专利名称：一种用于有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球制备方法
技术领域：
本发明涉及持久性有机氯污染土壤的原位修复，具体的说是一种用于有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法。
背景技术：
有机氯化物是一类毒性强、难降解的环境污染物，传统处理技术存在着降解不完全、效率低等不足。纳米技术的发展给有机氯污染物的处理带来了一种新的颇具潜力的方法，即应用纳米还原性金属颗粒对有机氯化物进行脱卤，降低其毒性。目前，以Fe2+和Fe3+ 等常见原料合成纳米铁颗粒的技术已经成熟，纳米颗粒对有机氯污染物也显示出高效的降解性能。更重要的是，其可灵活应用于地下水和污染土壤的原位和异位修复，尤其适用于原位修复。
磁性纳米微球是近年来发展起来的一种新型材料，不但具有普通纳米粒子所具有的4个基本效应(即表面效应、量子尺寸效应、体积效应和宏观量子隧道效应)，还具有异常的磁学性质，如超顺磁性、高矫顽力、低居里温度与高磁化率等特性。此外，将其与有机高分子材料结合，可对其表面进行修饰和改性，进一步调节其表面亲水性(或疏水性)以及生物兼容性等。由于其具有以上特点，将其作为固定化载体，在环境工程领域具有巨大的应用前景。磁性固定化技术是指通过采用化学或物理的方法将微生物(或酶)定位于磁性固定化载体的限定空间区域内，在固定化反应结束后，再利用外部磁场对其进行分离，实现微生物 (或酶)保持活性并可反复使用的固定化技术。微生物(或酶)在工业上应用广泛，但通常难以回收，循环使用次数较少。将磁性纳米微球作为微生物(或酶)的固定化载体具有以下优势①磁性纳米微球中含有有机高分子物质，易实现其功能的调整，可根据固定化需求人为控制微球表面的功能基团可利用外部磁场控制磁性材料的运动方式，此举既可替代传统的机械搅拌，又可改善固定化微生物(或酶)的作用效果，同时便于将微生物(或酶)从反应体系中分离和回收；③通过将固定有微生物(或酶)的磁性载体放入磁场稳定的流动床反应器中，大幅减少反应体系中的人工操作，易实现大规模连续化生产。
制备磁性纳米微球通常使用的磁性物质有纯铁粉、羰基铁、磁铁矿、正铁酸盐、铁钴合金等，尤以Fe3O4磁流体居多。与磁性材料相结合的有机材料中天然高分子材料有壳聚糖、葡聚糖、明胶、纤维素、淀粉、环糊精等，合成高分子材料有聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酸等。其中天然高分子材料因具有价廉易得、生物相容性好、可被生物降解等优点，得到了广泛的研究和应用。
采用固定化技术将各种生物酶固定在载体上用于生物医学、食品酿造或污水处理已有一些研究，但将降解菌固定化磁性纳米微球用于污染土壤的生物修复则未见报道。发明内容
本发明的目的在于提供一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法，即以纳米Fe3O4颗粒为载体吸附固定有机氯降解菌，将得到的磁性纳米生物微球用于污染土壤的原位修复，纳米Fe3O4的还原脱氯作用可使有机氯的毒性降低，微生物的共代谢作用加速有机氯的降解，最终实现土壤中残留有机氯的高效去除。
本发明所述用于有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法，包括纳米 Fe3O4颗粒的制备，以及如下步骤
(I)将l_2g壳聚糖溶解在IOOmL质量浓度为15_20%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将5-10g制备的纳米Fe3O4颗粒加入,搅拌20-30min,得到磁性纳米颗粒， 用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；
(2)将步骤(I)制得的磁性纳米颗粒，加入到pH = 5. 0-8. 0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液中，超声分散得到质量浓度为0. 2-0. 5g/mL的磁流体；
(3)取步骤⑵所述的磁流体，加入其体积量0. 5-2倍的菌体浓度为IO5-IO7个/ ml的细菌溶液，再滴加其体积量0. 5-2倍的质量浓度为2-5%的交联剂溶液，充分混匀后在 250C _30°C温度条件下，交联0. 5-1. 5h，在外磁场作用下固液分离，然后用蒸馏水洗涤固相产物3-4次，得到磁性纳米生物微球；所述细菌溶液是假单胞菌、芽孢杆菌、红球菌、无色杆菌中的一种或多种混合。
本发明制备方法，作为优先，纳米Fe3O4颗粒的制备采用共沉淀法，所述共沉淀法是以氨水作为沉淀剂，氮气保护下加入FeCl3与FeCl2，其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩尔比为 2:1: 8，化学反应的方程式是2Fe3++Fe2++80H_ = Fe304+4H20 ;反应后经冷冻干燥得表面吸附氨基的纳米Fe3O4颗粒。
作为优先所述柠檬酸-磷酸缓冲溶液pH为5. 5-6. 0 ;所述磁流体的质量浓度为0.3-0. 4g/mL。
所述细菌溶液的加入量是磁流体体积量的0. 5-1. 5倍。
所述交联剂溶液的滴加量是磁流体体积量的0. 5-1. 5倍。
所述交联剂溶液选自羧甲基纤维素、海藻酸钠、3 -环糊精、淀粉中的一种，其质量浓度为2% -5%。
所述交联温度是30°C，交联时间是I. Oh。
本发明的原理是
土壤中毒性强的有机氯污染物难以被自然降解和微生物利用，而通过纳米颗粒铁对土壤中有机氯污染物的高效还原脱氯作用，进而促进微生物降解菌对化学降解过程中一些中间产物的利用，提高了土壤有机氯污染物的降解效率。
采用固定化技术将有机氯降解菌固定在载体上使用，可以达到增强菌体活性、提高降解效率的目的。纳米Fe3O4具有生物降解性、无毒性、惰性、抗菌性、对重金属的鳌合作用、凝胶成型性质、亲水性以及对蛋白质显著的亲和性等特性，常用作微生物固定化的载体。
本发明方法将壳聚糖的醋酸水溶液和Fe3O4纳米磁粉分散于适当的有机介质中， 形成细小的壳聚糖微粒，在交联剂的作用下与细菌作用，从而交联形成高微生物载量的固定化菌。整个过程中微生物活力丧失少，操作简便易行，所得固定化微生物性质稳定，活性闻。
磁性Fe3O4微球具有磁响应性，在外加磁场的作用下可以很方便地分离，避免了由于搅拌而造成对载体和微生物的破坏；粒径小，表面积大，表面特性多样，易于吸附，可以通过共聚、表面改性，赋予其表面多种反应性功能基团(如-OH、-C00H、-CHO, -NH2, -SH等)， 进而可以结合各种酶、细胞、抗体等生物活性物质。一些嗜磁病毒和菌种，如常见的大肠杆菌就很喜欢吸附在磁性粒子表面上；近年发现并研究较多的趋磁细菌则由于能从生活水环境中吸收磁铁矿成分并在细胞内合成具超顺磁性的磁小体，因而具有沿磁场方向移动的固有特性。
纳米Fe3O4颗粒对微生物固定化的过程中，静电引力、范德华力、疏水作用力及表面粗糙程度都会影响细菌在磁性微球表面的吸附。当体系pH = 5. 5 6. 0时，静电吸引力可能起到主导作用。这是因为细菌的等电点(Pl) —般在2 5，其中革兰氏阳性菌一般为 2 3、革兰氏阴性菌为4 5。当体系的pH值大于等电点时，细菌带负电荷。纳米Fe3O4磁颗粒表面显示其既具有Lewis碱又具有Lewis酸特性，在酸性环境中磁颗粒带正电荷。因此，体系pH = 5. 5 6. 0时,磁颗粒正好带正电荷,而细菌带负电荷,从而能显著增加吸附率。此外，与块体材料相比，由于纳米材料具有更多的角、边和离子空穴，所以有着更大的吸附容量。纳米磁颗粒具有比表面积大、吸附容量大、磁响应性强、易于分离等优点，在细菌的非特异性吸附分离和富集方面具有广阔的应用前景。
壳聚糖是自然界大量存在的天然阳离子生物聚合物，具有良好的生物相容性、可降解性，其分子链上丰富的羟基和氨基使其易于进行化学修饰而被赋予多种功能。
海藻酸钠是一种从海藻中提取的亲水性胶态多聚糖，它是由P-l，4-D型甘露糖醛酸和a -1,4-L型古罗糖醛酸组成的线性高分子化合物，其分子含有自由的羧基和羟基， 可溶于不同温度的水中。海藻酸钠可生物降解，生物相容性好，稳定、无毒、成膜性或成球性较好，是常用的载体材料。
￠-环糊精是由7个葡萄糖分子以a _1，4糖苷键连接而成的环状低聚糖，其非极性的疏水空腔可以范德华力、疏水作用力和氢键等与分子间尺寸相匹配的许多疏水性客体分子或某些客体分子的疏水性基团形成稳定的超分子包结化合物。
淀粉是一种多糖，分子式为(C6HltlO5)n，是白色颗粒状的固体，其颗粒大小，形状及水溶性因其来源和结构不同而异。淀粉是植物界中存在的极为丰富的有机化合物，大量存在于植物的种子、根、茎等部位。
本发明具有如下优点
I.磁性纳米生物微球形状均一，制作简单，使用方便。
磁性纳米Fe3O4颗粒作为微生物固定化载体，具有较大的比表面积，能有效地提高载菌量，表面带有一定的正电荷，便于吸附弱负性的微生物；较小的颗粒直径，具有很小的扩散限制，在溶液中能稳定存在；较少的质量传递阻力和较少的污染；利用外加磁场，很容易从混合物中分离包被的细菌。含有有机功能基团的有机分子和聚合物被引入到磁性纳米Fe3O4颗粒的表面，然后通过多种方式将细菌键合，得到磁性纳米生物微球。该方法快速简便、成本低，经磁性纳米颗粒固定化的微生物对温度、PH等表现出了较好的稳定性。
2.磁性纳米生物微球的微生物活性高。
纳米Fe3O4颗粒具有良好的生物相容性，作为微生物的载体基本上不会对微生物造成损伤。纳米Fe3O4的磁场能刺激细菌的生长，并促进微生物生长挂膜和新陈代谢，另外还可提高微生物细胞膜的通透性，使水和氧分子等易于进入细胞。磁致生物效应能诱导微生物的酶活和酶合成，提高细菌的活性，对细菌降解有机污染物有明显的促进作用，缩短细菌降解污染物质的周期。
3.磁性纳米生物微球对土壤有机氯去除效果好。
将纳米Fe3O4颗粒固定有机氯降解菌的磁性纳米生物微球用于污染土壤的原位修复，包含纳米Fe3O4催化脱氯-微生物协同降解，纳米Fe3O4的还原脱氯作用可使有机氯的毒性降低，微生物的共代谢作用加速有机氯的降解，从而实现土壤中残留有机氯完全降解。
图I为阿特拉津降解菌在实施例I磁性纳米微球上的生长曲线
图2为多氯联苯降解菌在实施例I磁性纳米微球上的生长曲线具体实施方式
实施例I
(I)用共沉淀法制备纳米Fe3O4，共沉淀法是以氨水作为沉淀剂，氮气保护下加入FeCl3与FeCl2，其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩尔比为2 I 8，化学反应的方程式是 2Fe3++Fe2++80r = Fe304+4H20 ;反应后经冷冻干燥得表面吸附氨基的纳米Fe3O4颗粒；
(2)将Ig壳聚糖溶解在IOOmL质量分数为15%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将5g已制备的纳米Fe3O4颗粒加入,搅拌20min,得到磁性纳米颗粒,用蒸懼水反复洗涤至中性，烘干待用；
(3)将制得的磁性纳米颗粒，加入到0. IM pH = 5. 0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液中， 超声分散得到质量浓度为0. 5g/mL的磁流体；
(4)用接种环将保存在斜面培养基上的假单胞菌(Pseudomonas sp.),接入到液体种子培养基(其组分重量比是葡萄糖I. 25%，牛肉膏0.25%，NH4NO3 0.1%, MgSO4 IW2O0.02%，KCl 0. 02%, pH 7. 0-7. 2)中，在摇床转速 130-150r/min、28-30°C 条件下，培养 20-24h，制得细菌种子液，菌体浓度为IO5-IO7个/ml。
(5)按照总质量1000g，称取50g羧甲基纤维素，溶于蒸馏水中，pH值自然，制得质量浓度为5%的交联剂溶液。
(6)取步骤⑶所述的磁流体，加入其体积量0. 5倍的菌体浓度约IO7个/ml的细菌溶液，再滴加其体积量0. 5倍的质量浓度为5%的羧甲基纤维素交联剂溶液，充分混匀后在25°C温度条件下，交联I. 5h，在外磁场作用下固液分离，然后用蒸馏水洗涤固相产物3 次,得到磁性纳米生物微球。
(7)将制得的磁性纳米生物微球投加比5% (指生物微球占土壤的质量百分比，下同)，当土壤中有机氯除草剂阿特拉津的初始浓度为30mg/kg时,修复35d,阿特拉津的去除率为67%。
实施例2
与实施例I不同之处在于
所述磁性纳米颗粒是将2g壳聚糖溶解在IOOmL质量分数为20 %的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将IOg已制备的纳米Fe3O4颗粒加入,搅拌30min制得。
将制得的磁性纳米生物微球投加比5%，当土壤中有机氯除草剂阿特拉津的初始浓度为30mg/kg时，修复35d，阿特拉津的去除率为65%。
实施例3
与实施例I不同之处在于
所述磁流体的质量浓度为0. 4g/mL, pH = 6. 0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液。
所述菌种为芽孢杆菌(Bacillus sp.)加入为磁流体体积量I倍的菌体浓度约IO6 个/ml的细菌溶液。
所述交联剂为磁流体体积量2倍的质量浓度2%海藻酸钠，交联时间lh，交联温度 30。。。
将制得的磁性纳米生物微球投加比2%，当土壤中有机氯除草剂2，4-D的初始浓度为30mg/kg时，修复35d，2，4-D的去除率为55%。
实施例4
与实施例I不同之处在于
所述磁流体的质量浓度为0. 3g/mL, pH = 7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液。
所述菌种为红球菌(Rhodococcus sp.)加入为磁流体体积量2倍的菌体浓度约 IO7个/ml的细菌溶液。
所述交联剂为磁流体体积量I. 5倍的质量浓度3% ^ -环糊精，交联时间lh，交联温度30°C。
将制得的磁性纳米生物微球投加比5%，当土壤中多氯联苯PCB77的初始浓度为 4mg/kg时，修复28d，PCB77的去除率为63%。
实施例5
与实施例I不同之处在于
所述磁流体的质量浓度为0. 2g/mL, pH = 8. 0的磷酸盐缓冲溶液。
所述菌种为无色杆菌(Achromobacter sp.)。加入为磁流体体积量I. 5倍的菌体浓度约IO7个/ml的细菌溶液。
所述交联剂为磁流体体积量I倍的质量浓度4%淀粉，交联时间0. 5h,交联温度 25。。。
将制得的磁性纳米生物微球投加比2%，当土壤中多氯联苯PCB28的初始浓度为 4mg/kg时，修复28d，PCB28的去除率为52%。
实施例6
与实施例不同之处在于
所述菌种为假单胞菌、芽孢杆菌两种组合，加入为磁流体体积量I. 5倍的菌体浓度约IO7个/ml的细菌溶液。
将制得的磁性纳米生物微球投加比2%，当土壤中多氯联苯PCB28的初始浓度为 4mg/kg时，修复28d，PCB28的去除率为55%。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球制备方法，包括纳米 Fe3O4颗粒的制备，其特征在于还包含如下步骤(1)将l_2g壳聚糖溶解在IOOmL质量浓度为15-20%的醋酸溶液中，形成均一透明的胶体溶液，再将5-10g制备的纳米Fe3O4颗粒加入,搅拌20-30min,得到磁性纳米颗粒,用蒸馏水反复洗涤至中性，烘干待用；(2)将步骤⑴制得的磁性纳米颗粒，加入到pH= 4. 0-8. 0的柠檬酸-磷酸缓冲溶液中，超声分散得到质量浓度为0. 2-0. 5g/mL的磁流体；(3)取步骤(2)所述的磁流体，加入其体积量0.5-2倍的菌体浓度为IO5-IO7个/ml 的细菌溶液，再滴加其体积量0. 5-2倍的质量浓度为2-5%的交联剂溶液，充分混匀后在 250C -30°C温度条件下，交联0. 5-1. 5h，在外磁场作用下固液分离，然后用蒸馏水洗涤固相产物3-4次，得到磁性纳米生物微球；所述细菌溶液是假单胞菌、芽孢杆菌、红球菌、无色杆菌中的一种或多种混合。
2.根据权利要求I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球制备方法，其特征在于，所述共沉淀法是以氨水作为沉淀剂，氮气保护下加入FeCl3与FeCl2, 其中Fe3+ Fe2+ 0H_的摩尔比为2 I 8，化学反应的方程式是2Fe3++Fe2++80H_ = Fe304+4H20 ;反应后经冷冻干燥得表面吸附氨基的纳米Fe3O4颗粒。
3.根据权利要求I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法，其特征在于所述柠檬酸-磷酸缓冲溶液PH为5. 5-6. 0 ;所述磁流体的质量浓度为 0.3-0. 4g/mL。
4.根据权利要求制备方法，其特征在于
5.根据权利要求制备方法，其特征在于
6.根据权利要求制备方法，其特征在于的一种，其质量浓度为I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的 :所述细菌溶液的加入量是磁流体体积量优选为0. 5-1. 5倍。I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的 :所述交联剂溶液的滴加量是磁流体体积量的0. 5-1. 5倍。I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的 :所述交联剂溶液选自羧甲基纤维素、海藻酸钠、3 -环糊精、淀粉中 2% -5%。
7.根据权利要求I所述一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法，其特征在于所述交联温度是30°C，交联时间优选是I. Oh。
全文摘要
本发明涉及一种用于持久性有机氯污染土壤修复的磁性纳米生物微球的制备方法，包括(1)用共沉淀法制备表面吸附氨基的纳米Fe3O4颗粒；(2)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中形成均一透明的胶体溶液，再与纳米Fe3O4颗粒混合搅拌，得到磁性纳米颗粒；(3)将制得的磁性纳米颗粒，加入到柠檬酸缓冲溶液中，超声分散得到磁流体；(4)将磁流体加入到细菌溶液，再滴加交联液进行吸附-交联，在外磁场作用下固液分离，得到磁性纳米生物微球。本发明方法快速、简便、廉价，所得磁性纳米生物微球具有形状均一、比表面积大及微生物活性高等特点，适用于有机氯污染物降解及污染土壤的原位修复。
文档编号C12N11/10GK102533716SQ20121001910
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘小红, 司友斌, 司雄元, 张进霞 申请人:安徽农业大学