专利名称：对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法
技术领域：
本发明涉及对虾白斑综合症病毒培养技术研究领域，尤其是涉及对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法。
背景技术：
对虫下白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus, WSSV)是引起对虫下白斑综合症的主要病原。于20世纪90年代初首先在中国台北发现，是1993年以来导致我国沿海人工养殖对虾爆发性流行病大规模频繁发生的主要病毒病原。随后在亚洲其他国家以及太平洋海岸国家相继爆发类似疾病。该病毒能使对虾出现各种典型症状，如不喜进食，在池边来回游动，体色变红，对外界反映迟钝，经解剖可见肝胰腺肿大，大多数病虾头胸甲膨大，易被剥离，甲壳上出现明显的白色斑点。
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对虾白斑综合症病毒(WSSV)是一种无包涵体的杆状病毒，外面包有一层囊膜，一端有尾状突出，核衣壳为(330-350)nmX (58-67) nm，WSSV的DNA是双链结构。完整的WSSV-中国株有12条主要多肽。通过氨基酸测序和反向遗传学确定WSSV病毒粒子的5种结构蛋白。这5种结构蛋白分别是主要囊膜蛋白VP28和VP19，主要核衣壳蛋白VP26，VP24和VP15。WSSV经口感染和浸泡感染同时存在；对上皮组织和造血组织有较强的嗜性。WSSV宿主范围广泛，世界上所有种类的人工养殖对虾、大部分野生虾蟹类都是WSSV的宿主，在糠虾、白虾、毛虾、螃蟹、桡足类、海葵甚至昆虫体内都有WSSV的检出。在最近20余年来，对虾白斑综合症席卷了全球的对虾养殖地区，给世界对虾养殖也造成了不可估量的损失。高密度的对虾养殖规模，日益恶化的环境和世界性的贸易都加剧了此病的发生与传播。国内外，对WSSV的病原学、流行病学、诊断学、感染机理等方面的研究早已深入到了分子水平，目前研究热点集中在WSSV结构和功能基因的分析及探明分子水平致病机理。迄今为止已有许多学者对其进行了研究，但诸多问题仍未克服，WSS尚无有效的治疗方法。简单易行的病原繁殖体系是研究的基础。要建立预防和控制白斑综合症病毒感染的有效方法，一个重要的前提条件是要有稳定而纯净的病毒来源，最好的方法就是对其进行体外培养。病毒培养常采用细胞系和鸡胚培养进行。但是目前还没有合适的细胞系来进行WSSV的体外培养，国内外研究者们尝试采用组织、原代细胞培养的方法，这些方法存在着组织、细胞培养技术不成熟、不能传代、成本及实验条件要求较高等问题。目前最主要的WSSV增值模式是采用人工感染动物模型来进行，较成熟的WSSV动物模型主要有克氏原螯虾。虽然克氏原螯虾作为动物模型已经运用得比较成熟，但是由于水域环境复杂，螯虾易感病毒范围广的影响，使得克氏原螯虾存在着带有其他病毒的隐患，此外采用动物模型作为病毒增殖的媒介会受到养殖管理和养殖条件等因素影响。因此要对WSSV进行深入的研究，就必须建立更为稳定、便捷的体外培养方法。鸡胚培养是一种广泛运用于哺乳动物病毒、禽类病毒等的培养方法，如授权公告号为CN101633911A，公告日为2010年I月27日，发明名称为“适合于大规模生产人用禽流感疫苗的纯化技术中病毒的培养方法”，就采用了 9-11日龄无畸形、血管清晰、活动的健康鸡胚进行病毒培养，这种培养方法可为规模化生产人用禽流感病毒裂解疫苗提供足够的、合格的禽流感病毒。但是，病毒鸡胚培养多见于一些高等动物病毒的培养，在水生动物病毒领域的研究应用更是鲜见报道。目前，国内外还没有关于利用鸡胚培养方法培养虾病毒包括对虾白斑综合症病毒的方法的相关研究报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种首次将鸡胚培养技术应用于对虾白斑综合症病毒的培养，可实现对虾白斑综合症病毒快速、有效的体外传代培养且稳定、便捷的对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，其特征在于采用SPF鸡胚作为对虾白斑综合症病毒的体外培养体系，选择6-7日龄健康鸡胚，将预先制备除菌了的对虾白斑综合症病毒接种液接种至鸡胚尿囊膜上，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚进行匀浆离心分离，得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。·一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，具体的操作步骤如下
(1)选取符合SPF规格的新鲜种蛋，气室向上38°C孵化，相对湿度50%，每4小时翻蛋一次，培养6-7天后，选取血管粗大且呈鲜红色的健康发育良好的鸡胚在暗室内画出气室边缘并标明大血管所处位置，以备病毒接种用；
(2)选取患白斑综合症的日本对虾若干只，取甲壳和内脏，按质量体积比Ig=IOml的比例将甲壳和内脏加入到PH为7. 4的O. I M的PBS缓冲液，于匀浆器中匀浆，将匀浆液于4°C，6000g离心20min后取含病毒的上清液，将离心所得的沉淀用I 2ml的O. IM的PBS重悬，再次匀浆，将再次匀浆得到的匀浆液于4°C，6000g，离心20min，合并两次离心所得的上清液，将合并所得上清液先用O. 45 μ m的滤膜抽滤除去组织碎片，再用O. 22 μ m的滤膜抽滤除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000单位青霉素和IOOOug链霉素后，于4°C冰浴过夜处理，即得到对虾白斑综合症病毒接种液；
(3)选取健康，发育良好的6-7日龄的鸡胚，将对虾白斑综合症病毒接种液按接种量O. 15 O. 2ml接种到鸡胚的尿囊膜上；将已接种了病毒的鸡胚于33°C的恒温条件下培养13 14天，收集培养时间为5 10天的死亡鸡胚；
(4)将步骤(3)得到的死亡鸡胚分离出尿囊膜与尿囊液，按质量体积比Ig=IOml的比例将尿囊膜与尿囊液的混合物加入到PH为7. 4的O. I M的PBS缓冲液，重复步骤(2)即得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。步骤(2)中采用的PBS缓冲液配制方法是8g NaCl,O. 2gKCl，3. 62gNa2PO4 12H20,0. 24g KH2PO4,加入800ml双蒸水完全溶解，调节PH至7. 4，加入双蒸水定容至1000ml,高压灭菌。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明首次提出了对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，该方法具有如下优点
(I)用鸡胚培养的方法培养WSSV，避免了细胞培养成本高、易污染且不能进行传代培养的缺点；本发明培养的病毒其毒力与原代病毒毒力相当，未出现弱化，可用于该病毒的继续传代以及其他任何针对该病毒的研究。
(2)所用鸡胚在当地有专门SPF养殖场供应，获取方便，成本较低，一年四季均可培养。(3)电镜结合PCR的检测方法更方便、准确的检测鸡胚中病毒的存在与含量，为病毒培养体系建立成功与否提供了一个更便捷的验证途径。(4)接种了对虾白斑综合症病毒的鸡胚在上述相应的培养温度和培养时间下，病毒能得到较好的繁殖。 (5)相对于现今利用最多的细胞培养而言，病毒的鸡胚培养比细胞培养容易成功，操作简单。也比接种动物的来源容易，成本低廉，无饲养管理和隔离等特殊要求。无需特殊的设备或条件。另外SPF鸡胚无病毒隐性感染，同时鸡胚的敏感范围很广，多种病毒均能适用，且不会产生抗体，是我们建立一种新的、简便的病毒培养方法的不二之选。具有很高的科研价值和现实意义。综上所述，本发明对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法提供一种更高效、更适用的WSSV体外培养方法，以对WSSV进行快速、有效的体外传代培养，克服了在WSSV培养过程无合适培养体系，现有培养方法难以进行病毒传代培养的问题，因此鸡胚培养方法在WSSV中的应用将填补水产动物病毒鸡胚培养体系的空白，并为以后的研究与应用奠定基础。
图I为接种WSSV培养后频死鸡胚卵黄囊膜超薄切片图，箭头示WSSV ；
图2为鸡胚组织中WSSV的PCR检测结果；图中从左至右的3条泳道依次为1)Marker, 2)健康没有接种病毒的鸡胚组织，3)病毒接种的鸡胚组织。
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。以下实施例对本发明作了进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此，保护范围以权力要求为准。本发明一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，采用SPF鸡胚作为对虾白斑综合症病毒的体外培养体系，选择预先培养了 6-7天的健康鸡胚，将预先制备除菌了的对虾白斑综合症病毒接种液接种至鸡胚尿囊膜上，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚进行匀浆离心分离，得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。其具体培养方法如下
(1)选取符合SPF规格的新鲜种蛋，气室向上38°C孵化，相对湿度50%，每4小时翻蛋一次，培养6-7天后，选取血管粗大且呈鲜红色的健康发育良好的鸡胚在暗室内画出气室边缘并标明大血管所处位置，以备病毒接种用；
(2)选取患白斑综合症的日本对虾若干只，取甲壳和内脏，按质量体积比Ig=IOml的比例将甲壳和内脏加入到PH为7. 4的O. I M的PBS缓冲液，于匀浆器中匀浆，将匀浆液于4°C，6000g离心20min后取含病毒的上清液，将离心所得的沉淀用I 2ml的O. IM的PBS重悬，再次匀浆，将再次匀浆得到的匀浆液于4°C，6000g，离心20min，合并两次离心所得的上清液，将合并所得上清液先用O. 45 μ m的滤膜抽滤除去组织碎片，再用O. 22 μ m的滤膜抽滤除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000单位青霉素和IOOOug链霉素后，于4°C冰浴过夜处理，即得到对虾白斑综合症病毒接种液；(3)选取健康，发育良好的6-7日龄的鸡胚，将对虾白斑综合症病毒接种液按接种量O. 15-0. 2ml接种到鸡胚的尿囊膜上；将已接种了病毒的鸡胚于33°C的恒温条件下培养13-14天，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚；
(4)将步骤(3)得到的死亡鸡胚分离出尿囊膜与尿囊液，按质量体积比Ig=IOml的比例将尿囊膜与尿囊液的混合物后加入到PH为7. 4的O. I M的PBS缓冲液，重复步骤(2)即得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。步骤(2)中采用的PBS缓冲液配制方法是8g NaCl,O. 2gKCl，3. 62gNa2PO4 12H20,0. 24g KH2PO4,加入800ml双蒸水完全溶解，调节PH至7. 4，加入双蒸水定容至1000ml,高压灭菌。电镜观察各组织中病毒粒子情况(图I)。结合WSSV特异引物用PCR的方法进行辅助检测(图2)。
从图I中我们可以观察到大量的杆状病毒粒子，这些病毒粒子无论在形态还是大小上都与纯化的WSSV以及对虾组织中的WSSV的形态和大小相同。初步说明本发明中使用的鸡胚培养WSSV的方法获得成功。根据对虾白斑综合症病毒的基因序列(参考文献Xie, X.，Li, H., Xu, L.，andYang, F. (2005). A simple and efficient method for purification of intact whitespot syndrome virus (WSSV) viral particles. Virus Research 108(1-2)，63-67.)设计一对引物进行PCR检测，预期扩增片段大小为300bp，
引物 F: 5，-TATTGTCTCTCCTGACGTAC-3，
引物 R :5’ -CACATTCTTCACGAGTCTAC-3’
利用该对引物对接种了病毒的鸡胚样进行PCR，PCR结果经1%琼脂糖凝胶电泳后，经EB染色显示扩增出了 300bp的条带，条带大小与预期相符。图2结果进一步证明了接种了WSSV的鸡胚在经过一段时间的培养后确实存在WSSV。从培养病毒成功的鸡胚中纯化病毒后回归接种感染对虾成功，致死率100%，临床症状与自然发病死亡对虾相同，说明病毒经鸡胚培养后病毒毒力没有减弱，这进一步证明了本发明中涉及的利用鸡胚进行WSSV体外培养的方法是可行的。通过采用鸡胚培养的途径，成功的对WSSV进行了体外培养。
权利要求
1.一种对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，其特征在于采用SPF鸡胚作为对虾白斑综合症病毒的体外培养体系，选择预先培养了 6-7天的健康鸡胚，将预先制备除菌了的对虾白斑综合症病毒接种液接种至鸡胚尿囊膜上，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚进行匀浆离心分离，得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。
2.根据权利要求I所述的对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，其特征在于具体的操作步骤如下 (1)选取符合SPF规格的新鲜种蛋，气室向上38°C孵化，相对湿度50%，每4小时翻蛋一次，培养6-7天后，选取血管粗大且呈鲜红色的健康发育良好的鸡胚在暗室内画出气室边缘并标明大血管所处位置，以备病毒接种用； (2)选取患白斑综合症的日本对虾若干只，取甲壳和内脏，按质量体积比lg:10ml的比例将甲壳和内脏加入到PH为7. 4的0. I M的PBS缓冲液，于匀浆器中匀浆，将匀浆液于40C，6000g离心20min后，取含病毒的上清液，将离心所得的沉淀用I 2ml的0. IM的PBS重悬，再次匀浆，将再次匀浆得到的匀浆液于4°C，6000g，离心20min，合并两次离心所得的上清液，将合并所得上清液先用0. 45 y m的滤膜抽滤除去组织碎片，再用0. 22 y m的滤膜抽滤除菌，除菌后的上清液每毫升加入1000单位青霉素和IOOOug链霉素后，于4°C冰浴过夜处理，即得到对虾白斑综合症病毒接种液； (3)选取健康，发育良好的6-7日龄的鸡胚，将对虾白斑综合症病毒接种液按接种量0.15-0. 2ml接种到鸡胚的尿囊膜上，将已接种了病毒的鸡胚于33 °C的恒温条件下培养13-14天，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚； (4)将步骤(3)得到的死亡鸡胚分离出尿囊膜与尿囊液，按质量体积比Ig=IOml的比例将尿囊膜与尿囊液的混合物加入到PH为7. 4的0. I M的PBS缓冲液，重复步骤(2)即得到含对虾白斑综合症病毒的上清液。
3.根据权利要求2所述的对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，其特征在于步骤(2)中采用的PBS缓冲液配制方法是8g NaCl,0. 2gKCl,3. 62g Na2P04 12H20,0. 24g KH2PO4,力口A 800ml双蒸水完全溶解，调节PH至7. 4，加入双蒸水定容至1000ml，高压灭菌。
全文摘要
本发明公开了对虾白斑综合症病毒的鸡胚培养方法，特点是采用SPF鸡胚作为对虾白斑综合症病毒的体外培养体系，选择预先培养了6-7天的健康鸡胚，将预先制备除菌了的对虾白斑综合症病毒接种液接种至鸡胚尿囊膜上，收集培养时间为5-10天的死亡鸡胚进行匀浆离心分离，得到含对虾白斑综合症病毒的上清液，优点是提供一种更高效、更适用的WSSV体外培养方法，以对WSSV进行快速、有效的体外传代培养，克服了在WSSV培养过程无合适培养体系，现有培养方法难以进行病毒传代培养的问题，因此鸡胚培养方法在WSSV中的应用将填补虾病毒鸡胚培养体系的空白，并为以后的研究与应用奠定基础。
文档编号C12N7/02GK102787099SQ20121001877
公开日2012年11月21日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者刘联国, 周永强, 彭娇, 李登峰, 陈炯, 顾晓英 申请人:宁波大学