专利名称：在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法。
背景技术：
猪圆环病毒(Porcinecircovirus, PCV)由 Tischer 于 1974 年在连续传代的 PK15 细胞株(PK15 ATCC CCL31)中首次发现，当时被认为是一种无致病性的细胞污染物，随后即被证实是一种无囊膜、直径为17nm的新病毒。这种圆环病毒广泛存在于PK15细胞中且不引起猪的临床症状，因而被称为猪I型圆环病毒(PCVl)。断奶后仔猪多系统衰竭综合征 (Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS)于 1991 年首先发现于加拿大西部，到1994年已广泛流行于该国，现已在美洲和欧洲的许多国家和地区流行，亚洲地区的印度、日本、韩国、菲律宾、中国台湾省等也有此病的报道。PMWS主要感染7 15周龄猪，患猪表现为渐进性消瘦，淋巴结肿大，皮肤苍白或有黄疸等症状；猪群发病率为5 50%，死亡率接近100%，严重威胁世界各国的养猪业。现已证实该病是由一种致病性猪圆环病毒引起的，并将该圆环病毒命名为猪II型圆环病毒(PCV2)。我国朗洪武等于1999年在北京、 河北等地某些猪场中也检测到猪圆环病毒的存在，此后国内许多实验室也相继检测到该病毒。两型猪圆环病毒在分类上属于圆环病毒科，被列入该科的既有动物病毒，也有植物病毒。PCVl基因组全长1759bp，PCV2基因组全长1768bp (或1767bp)。PCVl与PCV2型内的同源性都在90 %以上，但两型间同源性小于80 %。已有研究表明，两型PCV的基因组均含有11个潜在的开放阅读框架(Open readingframe, 0RF)。其中0RF1、2、3、6和7具有一定的同源性，而其余ORF无任何同源性。0RF1、2为两个主要的0RF，对其功能研究较为清楚。ORFl编码与病毒复制相关的Rep蛋白；0RF2编码的蛋白为病毒的主要结构蛋白-核衣壳蛋白，具有较好的免疫原性，是构建重组疫苗的首选基因。
发明内容
本发明的目的是提供一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法。在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法的步骤为I)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建；3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入 MG132 ；4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪圆环病毒 2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。
2.根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆步骤为收集 SXO株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA，用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy,获得重组载体pGEM_T_PCV,并行序列测定,测定的序列在GenBank 登录号为AY604430. I。所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建步骤为根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列，GenBank登录号AY604430. 1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC, pcvCapMlu CTACGCGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA ；并在蛋白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和MluI连接入 pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132步骤为pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下，转染猪肾细胞 PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入MG132，浓度为5nM。本发明相对于普通的真核表达方法，该方法可有效稳定真核细胞中的PCV2核衣壳蛋白。转染后72小时的蛋白免疫印迹检测显示，本专利使用的方法，可最高提高PCV2核衣壳蛋白的表达量在20倍左右。
图I是本发明提供的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆过程示意图。图2是本发明提供的含有猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白基因的真核表达质粒的构建示意图。图3是本发明提供的将上述质粒(pCI-PCVCapHA)转染猪肾细胞PK15，转染后24 小时，在细胞培养液中加入MG132示意图。图4是本发明提供的继续培养48小时后，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白示意图。图5是本发明提供的，相对于普通的真核表达方法，在细胞培养液中加入MG132， 可有效稳定真核细胞中的PCV2核衣壳蛋白，并提高蛋白产量在20倍左右。图6是本发明提供的pCI-PCVCapHA和pUBR7共转染PK15细胞的示意图。图7是本发明提供的泛素蛋白的表达，可抑制PCV2核衣壳蛋白在PK15细胞的表
达产量。
具体实施例方式在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法的步骤为I)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建；3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入 MG132 ；4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。2.根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆步骤为收集 SXO株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA，用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy,获得重组载体pGEM_T_PCV,并行序列测定,测定的序列在GenBank 登录号为AY604430. I。所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建步骤为根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列，GenBank登录号AY604430. 1，设计核衣壳蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CGACGCT AGCATGACGTATCCAAGGAGGCGTTAC, pcvCapMlu CTACGCGTTTAAGCGTAATCTGGAACATCGTATGGGTAAGGGTTAAGTGGCGGGTCTTTAA ；并在蛋白C端引入HA序列，作为蛋白标记，将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和MluI连接入 pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。所述的将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132步骤为pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下，转染猪肾细胞 PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入MG132，浓度为5nM。实施例I :本实施例描述了本发明提供的猪圆环病毒2型(PCV 2)SX04株全基因组序列的克隆的整个实验过程如图I所示。称取适量病料(腹股沟淋巴结、肺门淋巴结和颈部淋巴结等)，加入适当体积的组织裂解缓冲液进行勻衆；将组织勻衆分装到I. 5ml eppendorf管中，室温，3000g离心 IOmin ;取上清加入蛋白酶K至终浓度为100 μ g/ml, 55°C裂解3h ;加入等体积的酹/氯仿， 上下颠倒混勻，4°C, 12000g离心IOmin ;取上清置一新的I. 5ml eppendorf管中；取上清置一新的I. 5ml eppendorf管中，加入2倍体积冰冷无水乙醇(其中含1/10体积的3M NaAc), 上下颠倒混勻，-20°C,40min,沉淀DNA ;4°C, 12000g离心IOmin,弃上清,沉淀用70%的乙醇洗涤一次；41，1200(^离心51^11，弃上清，沉淀于室温干燥后，溶于3(^1的TE溶液中 (PH8. 0)。根据已发表的PCV2序列(GenBank序列号AF027217)设计引物(见表I)。以上引物由上海博亚生物技术有限公司合成，用前溶解于灭菌超纯水中至终浓度15μπιΟ1/πι1，-20τ 保存备用。表I猪圆环病毒基因组DNA扩增用引物序列
引物序列结合位置产物长度Sense-PCV Anti-PCVTGGAGCTCCTAGATCTCAGGGAC TAGGAGCTCCACACTCCATCAGTAA371-394 357-3811767按照 Roche 公司 Expand High Fidelity PCR System 的操作指南进行 PCR 反应， 以抽提的病毒DNA为模板，PCR反应参数为94°C预变性3min，94°C变性15sec，58°C退火 45sec，68°C延伸2min ;循环30次，72°C延伸lOmin。反应完毕后取I 21%琼脂糖凝胶电
5泳检测，结果得到约1800bp的DNA条带。割胶回收PCR产物直接连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)上。具体按照说明书进行，在O. 5ml离心管中，依次加入以下试剂2XBuffer 5 μ I, pGEM-T easy I μ I, 回收的PCR产物4μ 1，T4DNA liagase I μ 1，室温连接lh，转化大肠杆菌HD5 α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落，以LB培养基过夜扩大培养，抽提质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定。为进一步证实序列的正确性，选3个独立的阳性克隆进行测序。测序用引物步进法，在ΑΒΙ3730测序仪上进行。对测序正确的克隆分别命名为pGEM-T-PCV，GenBank登录号为 AY604430. I。实施例2 本实施例描述了本发明提供的含有猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白基因的真核表达质粒的构建。如图2所示跟据PCV2SX04株基因组序列，设计特异性引物(表2)，并在蛋白C端引入HA标记，用于蛋白的检测。表2猪圆环病毒核衣壳蛋白基因扩增用引物序列
权利要求
1.一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于， 方法的步骤为1)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；2)含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒pCI-PCVCapHA的构建；3)将pCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132；4)继续培养48小时后，通过抑制蛋白酶体的活性，稳定真核细胞中的猪圆环病毒2型核衣壳蛋白，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。
2.根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆步骤为收集 SXO株感染仔猪的淋巴结组织，抽提病毒基因组DNA，用长距离精确PCR扩增基因组DNA全长，克隆于pGEM-T easy,获得重组载体pGEM_T_PCV,并行序列测定,测定的序列在GenBank 登录号为AY604430. I。
3.根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的含有猪圆环病毒2型核衣壳蛋白基因的真核表达质粒PCI-PCVCapHA的构建步骤为根据猪圆环病毒2型SX04株基因组序列， GenBank登录号ΑΥ604430· I,设计核衣壳蛋白基因上下游引物pcvCapNhe CgacGCT AGCAtgacgtatccaaggaggcgttac，pcvCapMlu ctACGCGTttaAGCG TAATCTGGAACATCGTATGGGTA agggttaagtggCgggtctttaa ;并在蛋白C端引入HA序列，作为蛋白标记,将获得的核衣壳蛋白基因，通过NheI和MluI连接入pCI-Neo真核表达质粒pCI-PCVCapHA，并进行序列测定。
4.根据权利要求I所述的一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法，其特征在于，所述的将PCI-PCVCapHA转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132步骤为pCI-PCVCapHA质粒在脂质体Lipofectamine 2000介导下，转染猪肾细胞PK5，在转染后24小时，在细胞培养上清液中，加入MG132，浓度为5nM。
全文摘要
本发明公开了一种在哺乳动物细胞中高效表达猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的方法。该方法通过抑制猪圆环病毒2型核衣壳蛋白的泛化作用(Ubiquitination)，增强其稳定性，从而提高病毒蛋白在哺乳动物细胞中表达水平。方法的步骤为1)猪圆环病毒2型SX04株全基因组序列的克隆；2)含有猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白基因的真核表达质粒的构建；3)将上述质粒转染猪肾细胞PK15，转染后24小时，在细胞培养液中加入MG132；4)继续培养48小时后，收集细胞，免疫印迹检测表达蛋白。相对于普通的真核表达方法，该方法可有效稳定真核细胞中的PCV2核衣壳蛋白。转染后72小时的蛋白免疫印迹检测显示，本专利使用的方法，可最高提高PCV2核衣壳蛋白的表达量在20倍左右。
文档编号C12N15/85GK102586326SQ20121001872
公开日2012年7月18日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者于涟, 方立, 李龙 申请人:杭州贝尔塔生物技术有限公司