专利名称：用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)检测的lamp引物组的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物保护领域，提供了利用常温扩增技术对柑桔黄龙病菌(亚洲种)的检测，适用于ロ岸检验检疫等机构应用。
背景技术：
柑桔黄龙病是柑桔生产上的重要病害，被多个国家列入名单的重大检疫性病害。 柑桔黄龙病菌(亚洲种)是柑桔黄龙病菌的ー个菌系，在我国主要分布于广东、广西、福建、 台湾、海南、云南、贵州、四川、浙江、湖南、江西等省，该病对柑桔危害极大，感染后显现绿树冠、中枝梢发黄症状，甚至树亡林毀，幼龄树发病后一般在2 3年死亡，老年树发病则在 3 5年内枯死或丧失结果能力，因而也被称为“桔癌”，一直是国际柑桔学界的研究重点。 近年来，随着柑桔生产的发展，柑桔黄龙病的发病区域日益扩大，已成为柑桔产业发展的瓶颈。2002年11月，浙江省黄岩桔区首次发现柑桔黄龙病疫情，当年全区只有2镇的36个行政村发生，病树8510株。2003年有7个乡(镇、街道)共99个行政村发病，病树增加到 113115株。到2004年，整个黄岩桔区17个乡(镇、街道)都已发生柑桔黄龙病，发病村数为 225个，病树达312105株，病株率为1. 47% 44. 61%。广西柑桔黄龙病年均发病率超过5%， 毎年造成的直接经济损失超过8. 05亿 9. 62亿元。近年来，位居世界柑桔产量第一和第三的巴西和美国也正面临柑桔黄龙病的威胁，其柑桔产业大幅度萎縮。柑桔黄龙病传统的检测技术主要有症状鉴别、显微镜观测、血清学检测和PCR检测等，但这些检测方法均有其不足之处。症状鉴别法仅对发病明显的病株有效，对发病初期的病株往往造成漏检；显微镜观察大多应用电子显微镜观察，由于电镜本身检测技术上的缺点和黄龙病菌在植物体内的菌量低、分布不均等原因，电镜检测技术检测效率只有 60% 70%，容易造成漏检；虽然血清学检测已在其它病害的检测上获得了巨大的成功，但对黄龙病病原来讲，至今仍没有得到较好的抗体，在检测的时候容易造成漏检或假阳性； PCR方法虽然特异性高，检测周期短，但其昂贵的仪器设备和较高的假阳性率，也限制了其推广。本发明应用法LAMP引物将恒温扩增技术运用于柑桔黄龙病菌的快速检测，特异性、灵敏度比普通通变温PCR方法更高，同时可以免除高昂的仪器投入，便于基层推广使
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发明内容
本发明的第一目的是提供一組检测柑桔黄龙病菌(亚洲种)LAMP引物组；本发明的第二目的是提供ー种利用上述引物组检测柑桔黄龙病菌(亚洲种)的方法。ー种用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)检测的LAMP引物組，包括一对外引物和一对内引物，其DNA序列分别为
SEQ ID NOl :ACGATGAAGATACCGTCAA SEQ ID N02 CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCTSEQ ID N03 :GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC SEQ ID N04 :ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。ー种利用上述引物组检测柑桔黄龙病菌(亚洲种)的方法，步骤如下 DDNA模板的提取用市售DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取DNA模板。2) LAMP 10 μ mol/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 UOymol/ mL SEQ ID N03 禾ロ 10 μ mol/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步骤1)中获得的DNA模板2 μ L ；灭菌去离子水5. 5 μし3) LAMP扩增条件将配制好反应体系的PCR管于62°C水浴锅中恒温反应60min ； 然后80°C，5min终止反应。4)检测结果电泳步骤3)中的LAMP扩增产物，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔黄龙病菌(亚洲种)；若未产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔黄龙病菌(亚洲种)。与现有技术相比，本发明的进步在于检测时间短，效率高，假阳性率低；检测仪器简单，只需要简单的水浴锅，无需昂贵的PCR仪，降低了实验室投入，适合口岸检验检疫机构和基层实验室推广。
图1为LAMP引物等温扩增结果；
图中1-柑桔黄龙病菌(亚洲种)ic. Liberobacter asiaticum) ；2-黄单胞菌(Janthornonas sp.) ；3_ 短小杆菌{Curtobacterium sp.) ;4_ 鞘胺醇单胞菌 i^phmgomonassp.) ；5- 柑桔黄龙病菌(亚洲种)(C Liberobacter asiaticum).β- 单胞杆菌iBrevundimonas sp.) ；7-嗜冷杆菌0 ァcAroみacier sp. ) ；8-柑桔黄龙病菌(亚洲 ^KC. Liberobacter asiaticum)。-潘玉\\猿、场叙镇、Cmvimcter mickiganensis subsp. michiganensis) ； 白米软腐炳菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora ハ11_ 相桔黄龙病菌(亚洲种)(C Liberobacter asiaiic腫)；12-柑桔馈荡病菌CfefliAoffloaas axonopodis ρν· CY iri); 13-枯草芽孢杆菌(feci バ狀 subtil is) ； 14-阴性对照；M-DL2000 DNA分子量标记。
具体实施例方式下面提供具体实施例进ー步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。实施例1，引物的设计与合成
參照GeneBank中柑桔黄龙病菌(亚洲种)基因序列，挑选特异性高的序列(序列号 HQ267229. 1)，采用 LAMP 引物设计软件 Primer Explorer V4. 0 设计 LAMP 引物，利用 LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应进程中的浊度进行实时监控，对不同引物组扩增的起始时间、进入最大扩增速率的时间、最大扩增速率及达到平台期所需时间等參数进行分析，筛选出扩增速率最高、特异性好的一組LAMP引物。引物由上海生エ公司合成，其序列分别为
外引物 1 SEQ ID NOl :ACGATGAAGATACCGTCAA ；外引物 2 SEQ ID N02 CCGATGTTCTTATAGAAATAACTCT ； 内引物 1 SEQ ID N03
GTGTTGTACTTTCACCATGACATTTCTGATGTGCATAACATCAAGC ； 内引物 2 SEQ ID N04
ACTTATGTGATTGAAGAAGGTGTCAGCGAATAATTTTTATTACCCACG。实施例2，样品DNA模板的提取
以1-柑桔黄龙病菌(亚洲种)(C Liberobacter asiaticum) ；2-黄单胞菌(Janthornonas sp.) ；3_ 短小杆菌{Curtobacterium sp.) ;4_ 鞘胺醇单胞菌 i^phmgomonassp.) ；5- 柑桔黄龙病菌(亚洲种)(C Liberobacter asiaticum).β- 单胞杆菌iBrevundimonas sp.) ；7-嗜冷杆菌0 ァcAroみacier sp. ) ；8-柑桔黄龙病菌(亚洲 ^KC. Liberobacter asiaticum)。-潘玉\\猿、场叙镇、Cmvimcter mickiganensis subsp. michiganensis) ； 白米软腐炳菌 iBrwinia carotovora var . Carotovora ハ11_ 相桔黄龙病菌(亚洲种)(C Liberobacter asiaiic腫)；12-柑桔馈荡病菌CfefliAoffloaas axonopodis pv. CYtrz ノ； 13_ ネ古草芽 包ホ干 1 (Bacillus subtil is)为供 ι式样品。用 Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit试剂盒提取样品DNA模板，具体操作步骤參照试剂盒说明书。其中1、5，8，11号分別为从柑桔园采集的柑桔黄龙病病叶，然后直接提取总DNA (经普通PCR方法和荧光定量PCR方法检测确定含有柑桔黄龙病菌(亚洲种)DNA)，其余菌株均可在国内市场购得。实施例3，阴性对照的制备
将去离子水高温高压灭菌，作为阴性对照。实施例4，LAMP扩增液的配制
LAMP具体扩增体糸如下。
2氺reaction mix12. 5μ L
lOymol/mL SEQ ID NOl1 μ L
lOymol/mL SEQ ID N021 μ L
10 μ mo/mL 1 SEQ ID N031 μ L
lOymol/mL SEQ ID N041 μ L Bst DNA聚合酶 1 μ L 灭菌水 5· 5 μ L DNA模板 2 μし其中，2氺reaction mix 与 Bst DNA 聚合均为 Loopamp DNA Amplification Kit
试剂盒产品。依次将上述试剂加入0. 2mL的PCR管中，配成LAMP扩增液。实施例5，LAMP扩增
将配制好反应体系的PCR管置于62°C水浴锅恒温反应60min ；然后80°C，5min终止反应。实施例6，检测结果
电泳參LAMP扩增产物，结果參见图1。其中1、5、8和11号样品为柑桔黄龙病菌(亚洲种)，均能出现梯状特异性条带，其他泳道均未出现梯状特异性条带，结果表明本发明引物对的特异性强，对其他細菌都没有特异性条带出现。
权利要求
1.ー种用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)检测的LAMP引物組，其特征是包括一对外引物和一对内引物，其 DNA 序列为SEQ ID NOU SEQ ID N02、SEQ ID N03 和 SEQ ID N04。
2.利用权利要求1所述的引物组检测柑桔黄龙病菌(亚洲种)的方法，步骤如下DDNA模板的提取用市售DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取DNA模板；2)LAMP 扩增体系ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N01、10 μ mol/mL SEQ ID N02 U0ymol/mL SEQ ID N03 禾ロ ΙΟμπιοΙ/mL SEQ ID N04 各 1 μ L ;2*reaction mix 12. 5μ L ；Bst DNA 聚合酶1 μ L ；步骤1)中获得的DNA模板2 μ L ；灭菌去离子水5. 5 μ L ；3)LAMP扩增条件将配制好反应体系的PCR管于62°C水浴锅中恒温反应60min ；然后 80°C，5min终止反应；4)检测结果对步骤3)中的LAMP扩增产物进行电泳，若产生特异梯状条带，则待测样品中含有柑桔黄龙病菌(亚洲种)；若未产生特异梯状条带，则待测样品中不含有柑桔黄龙病菌(亚洲种)。
全文摘要
本发明公开了一套用于柑桔黄龙病菌(亚洲种)LAMP检测的引物组，所述引物组由一对外引物和一对内引物组成。本发明还公开了一种利用该引物组检测柑桔黄龙病菌的方法。以本发明所设计的引物采用LAMP方法检测柑桔黄龙病，具有良好的特异性、灵敏度，能快速、方便、高效的检测柑桔黄龙病菌(亚洲种)，能满足对柑桔黄龙病菌(亚洲种)快速准确检测的需要。
文档编号C12Q1/68GK102534015SQ20121001833
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月20日 优先权日2012年1月20日
发明者吴瑜佳, 孔德英, 孙涛, 滕少娜, 赵文军, 邓朝晖, 陆丽华 申请人:重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心