一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及其应用的制作方法

专利名称：一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体及其应用。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶可以催化水解多种β -葡萄糖苷健，具有底物广谱性，和多种生物功能(1) β -葡萄糖苷酶用于纤维素的水解纤维素是自然界最丰富的碳资源，从纤维素分解为葡萄糖需要3种酶协同作用。β -葡萄糖苷酶可以将纤维二糖水解为葡萄糖，而纤维素酶组分中β -葡萄糖苷酶含量少，活力低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。因此筛选或者通过基因工程改造得到高活性的β-葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。(2) β -葡萄糖苷酶用于烷基糖苷和芳香基糖苷的合成烷基糖苷、苄基糖苷和烯基糖苷不仅是糖化学中重要的中间体，同时也是一类可生物降解的非离子表面活性剂，广泛应用于化妆品、制药、食品和去污剂行业。酶法合成烷基糖苷和芳香基糖苷具有很大的潜在市场。其特点是选择性好，产品纯度高，收率高，制备条件温和。(3) β -葡萄糖苷酶制备高生物活性苷元的应用研究发现，自然界多种具有高生物活性的物质，由于大部分以糖苷形式存在而降低了其的活性。利用葡萄糖苷酶水解掉葡萄糖后可以得到高活性的苷元。比如，人参皂甙是人参中的主要有效成分，含量约4%，但并非所有的人参皂甙都有很高的生物活性。如具有强烈抗癌作用的人参皂甙Rh2，在人参中的质量比仅为10_5。而以低活性的人参二醇类皂甙Rg3为底物，β -葡萄糖苷酶可以水解掉一个葡萄糖后得到人参皂甙他2。比如，大豆异黄酮具有的很多重要的生理功能，研究发现大豆异黄酮苷元的生理活性远比其相应糖苷的活性高。大豆异黄酮中97% 99%是以大豆异黄酮糖苷形式存在，苷元形式仅为大豆异黄酮总量的 3%。利用葡萄糖苷酶可以水解大豆异黄酮糖苷为高生物活性的大豆异黄酮苷元。据报道白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏和具有冠心病、缺血性心脏病的防治作用，白藜芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一。干燥虎杖根茎中白藜芦醇含量仅为0. 0. 2%，而虎杖苷含量约为2%左右。酶法水解虎杖苷制备白藜芦醇具有反应温和、环境友好、工艺简单等优点，是值得深入研究的制备方法。

发明内容
本发明目的是提供一种新的水解虎杖苷制备白藜芦醇的β -葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用。本发明采用的技术方案是
一种β -葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示Met Lys Thr Phe Pro Asp Asp Phe Leu Trp Gly Gly AlaAla Asn Gln Val Glu Gly Ala Tyr Leu Glu Glu Gly LysSer Thr Ser Asp Val Gln Pro Gln Gly Val Phe Gly ProGlu Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly lie Lys Asp Val AlaPhe Tyr His Arg Tyr Pro Glu Asp lie Lys Leu Phe AlaGly Phe Ser Cys Leu Arg Val Ser lie Ala Trp Thr ArgPro Asn Gly Asp Glu Gln Gln Pro Asn Glu Ala Gly LeuTyr Asp Arg Leu Phe Asp Glu Leu Ala Ala His Ser lieLeu Val Thr Leu Ser His Tyr Glu Met Pro Trp Gly LeuGln Tyr Gly Gly Trp Gly Ser Arg Gln Thr lie Gly PheArg Tyr Ala Arg Thr Val Phe Ala Arg Tyr Lys Glu LysLeu Trp Leu Thr Phe Asn Glu lie Leu Lys Gly Ser SerTyr Val Phe Cys Leu Pro Asn Thr Ala lie Val Met AlaPro Arg Gly Trp Arg Ser Lys Phe Gly Met Pro Gly GluPhe0由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在95%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。本发明所述肽蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的葡萄糖苷酶相同的生物学功能或活性的肽蛋白，可以是下列情形(I) 一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(II) 一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(III)成熟肽蛋白与另一种化合物(比如延长肽蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合进成熟的肽蛋白而形成的肽蛋白序列(如用来纯化此肽蛋白的序列或蛋白原序列)。所述肽蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的肽蛋白可以是糖基化的。本发明的肽蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还涉及编码所述β -葡萄糖苷酶的基因。具体的，所述基因序列可如SEQ ID No. 2所示atgaaaactt tcccggacga ttttttatgg ggcggcgcgg ttgccgcgaa tcaggtagaaggcgcgtatc tggaggaggg aaaagggctg tccacctcag acgttcagcc gcagggtgtcttcggcccgg tggttgagcg cgtggcgggc gacagcggca tcaaggacgt cgccatcgacttctatcacc gctacccgga agacatcaaa ctgttcgctg agatgggctt tagctgcctgcgcgtctcca ttgcctggac ccgcattttt ccgaacggcg acgagcagca gcctaacgag
ValAlaGlyLeuValValIleAspGluMetIlePheAlaPheThrProValLysPheGluValLysLeuMetLeuSerAlaTrp
gcggggctgg cgttttacga ccggctgttt gacgagctgg ccgcgcacag cattaccccgctggtgacgc tctcgcatta cgaaatgccg tgggggctgg tgaagcagta cggcgggtggggcagccgcc agaccattgg gttcttcgag cgctacgccc gtaccgtgtt tgcgcgctacaaggagaagg tgaagctctg gctgaccttc aacgagatct taaagggttc gagcctgatgtacgtatttt gcttaccaaa tacagcaata gtaatggctc tcagtccccg tggatggaggagcaaattcg ggatgcctgg ggaagcatgg ttctaa 。由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO :2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70%以上同源性，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的变位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的肽蛋白的功能。另外，可与SEQ ID NO :2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50%同源性，优选至少具有70%同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0. 2 SSC,0. 1% SDS, 600C ；或(2)杂交时加用变性剂，如50% (ν/ν)甲酰胺，0. 小牛血清，0. 1% Ficoll,42°C ；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95%以上，更好是97%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的肽蛋白与SEQ IDNO 1所示的肽蛋白有相同的生物学功能和活性。编码本发明所述葡萄糖苷酶的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于(1)用探针与基因或cDNA文库杂交以检出同源性的多核苷酸序列( 表达文库的活性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，该表达文库可以包括环境宏基因组文库。本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得⑴从基因组DNA分离双链DNA序列；⑵化学合成DNA序列以获得所述肽蛋白的双链DNA。可用常规方法从这些cNDA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括(但不限于)(I)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；⑵标志基因功能的出现或丧失；(3)通过测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。如上所述得到的本发明所述的β -葡萄糖苷酶基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接全长的cDNA序列。本发明的葡萄糖苷酶序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同肽蛋白序列，而本发明的β -葡萄糖苷酶编码基因经基因数据库进行搜寻比较，也未发现有任何相同基因。本发明还涉及含有所述基因的重组载体、以及由所述重组载体转化得到的基因工程菌。所述的基因可用于转化制备重组β -葡萄糖苷酶。具体方法如下构建含β -葡萄糖苷酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离得到含有重组β-葡萄糖苷酶基因。本发明所述β -葡萄糖苷酶基因可插入到载体中，以构成含有本发明所述β -葡萄糖苷酶基因的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于在细菌中表达的基于Τ7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3. 1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选PET载体系列以其其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含β -葡萄糖苷酶基因和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA序列、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有大肠杆菌的Iac或trp启动子；噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子寸。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素等。本发明所述含β -葡萄糖苷酶基因或含有β -葡萄糖苷酶基因的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该基因或重组载体的基因工程菌。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表例子有大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9 ；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。用本发明所述的基因(DNA序列)或含有所述基因(DNA序列)的重组载体转化宿主细胞，可用本领域技术熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所用的方法为本领域众所周知，可供选择的是用MgC12。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。通过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的β-葡萄糖苷酶。一般来说有以下步骤(1)用本发明的葡萄糖苷酶基因(或变异体)，或用含有该基因的重组载体转化或转染合适的宿主细胞；(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
在步骤O)中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞的条件下进行培养。当宿主细胞生长在适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在步骤(3)中，重组肽蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但不限于常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结
I=I O本发明的要点在于提供了 SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。本发明还涉及所述的β -葡萄糖苷酶在水解虎杖苷制备白藜芦醇中的应用。具体的，所述应用为在ρΗ为3 7的0. 1 0. 5mol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，加入等体积的0. 5 lmg/ml虎杖苷水溶液，混合均勻，以β -葡萄糖苷酶为催化剂，所述的β -葡萄糖苷酶的终浓度为0. 01 0. lmg/ml，混勻后于25 40°C摇床反应10 20小时，取反应液3000 6000rpm离心15分钟，取沉淀经纯化得到所述白藜芦醇。具体的，所述的应用可按如下步骤进行(1)配制pH5的0. 2mol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液；(2)取一支试管，加入上述缓冲液20ml，加入lmg/ml虎杖苷溶液20ml，混合均勻，加入lmg/ml的β-葡萄糖苷酶:3ml，混勻后于37°C摇床反应16小时，取反应液5000rpm离心15分钟，沉淀物即为白藜芦醇粗制品，虎杖苷以及白藜芦醇粗品分别用薄层扫描分析(TLC)，方法如下以硅胶板G为薄层吸附剂，氯仿丙酮乙酸水G 4 1 0. 2)为展开剂，在紫外灯(365nm)下观察荧光斑点，并在365nm处进行扫描测定。结果表明，用此方法可以简便，准确度高，重复性好的检测虎杖苷中白藜芦醇的生成量。与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用，该葡萄糖苷酶能够水解虎杖苷制备白藜芦醇，环境友好，产率高，应用前景广阔。


图1为β-葡萄糖苷酶降解七叶苷的结果；1-空白组；2-加样组；图2为β -葡萄糖苷酶催化对硝基苯-β -D-葡萄糖苷(ONPG)最适ρΗ的测定；图3为β -葡萄糖苷酶催化对硝基苯-β -D-葡萄糖苷(ONPG)最适温度的测定；图4为薄层层析(TLC)检测葡萄糖苷酶催化虎杖苷中白藜芦醇的生成(1-无酶(虎杖苷+缓冲液)样品、2-虎杖苷标准品、3-白藜芦醇标准品、4-D11反应样品、5-苦杏仁酶(β -glucosidase购买)反应样品)；图5为ρΗ对β -葡萄糖苷酶水解虎杖苷的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 β -葡萄糖苷酶Dll基因的七叶苷筛选方法LB固体培养基的配制。LB固体培养基的终浓度组成为胰化蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L、用5mol/L NaOH溶液调pH至7. 0，溶剂为水，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌25min。冷却培养基，在培养基未凝固前加入终浓度为2. 5%的柠檬酸铁铵(高压灭菌)和0. 的七叶苷(过滤除菌)，培养基冷却后，将待筛选的微生物接种于该培养基，37°C培养16小时，微生物菌落周围有黑色斑点的即为阳性(图1)。实施例2 =Dll基因全长的cDNA筛选与克隆构建土壤基因组文库。根据实施例1方法筛选阳性克隆并构建亚文库，通过基因序列测定(由上海生工生物工程技术服务有限公司测定)，得到SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。根据SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，通过体外扩增技术获得SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列的β-葡萄糖苷酶基因，将该基因克隆至pET 3 载体(杭州师范大学生物医药与健康中心保存)，在保证阅读框架正确的前提下鉴定好的表达载体，再将其转入E. Coil BL21中，得到工程菌E. Coil BL21/pET 32a/Dll。实施例3 =Dll蛋白的表达将实施例2获得的E. Coil BL21/pET 32a/Dll在含IOOmL 50 μ g/mL氨苄霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将IOml过夜培养后的菌液倒入IL 50 μ g/mL氨苄霉素的LB液体培养基培养，直到菌液0D600达到0. 6-0. 8时加入IPTG终浓度为1. Ommol/L, 25 V诱导证后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7. 4使其重悬浮，使用超生破碎仪(30min)，使细胞充分破碎。离心(12000g,15min)取上清，含Dll蛋白的上清用0. 22 μ m醋酸纤维素滤膜过滤后镍柱亲和层析进行纯化获得Dll纯酶(氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示)°实施例4 =Dll催化对硝基苯- β -葡萄糖苷测定最适催化条件本发明以对硝基苯-β-葡萄糖苷(ONPG)为底物，Dll催化裂解一分子ONPG得到一份子对硝基苯酚，通过测定对硝基苯酚在420nm波长的UV吸收来测定动力学曲线以分析测定Dll最适催化条件。分别用ρΗ2· 0、2· 5、3· 0、3· 5、4· 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、7· 5、8· 0、8· 5、
9. 0磷酸缓冲液(0. 15mol/L)将实施例3取得的Dll纯酶配成lmg/ml的酶液，再取各pH值的磷酸缓冲液200ul和对应pH值的酶液IOOul，再分别加入200ul0NPG (lmg/ml)，30°C保温，测定波长420nm处的动力学曲线，得出Dll最适pH值约为4. 7 (图2)。用0. 15mol/L的磷酸缓冲液(pH4. 7)将实施例3取得的Dll酶配成lmg/ml的酶液，分别取该酶液IOOul，并分别加入200ul磷酸缓冲液(pH4. 7)和200u 10NPG (lmg/ml)，分别在15、20、25、30、35、45、50、55°C温度条件下(15°C _55°C )，测定波长420nm处的动力学曲线(图3)，得出Dll最适温度约为37°C。实施例6 :D11催化虎杖苷方法分别用ρΗ4· 0和ρΗ5· 0的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液(0. 2mol/L)配制成lmg/ml的Dll酶液，分别将pH4. 0和pH5. 0上述缓冲液20ml与lmg/ml虎杖苷溶液20ml混合均勻，再分别加入上述PH4. 0和pH5. 0的Dll酶液:3ml，混勻后于37°C摇床反应16小时，反应结束，取反应液IOOOOrpm离心15分钟，弃去上清液，沉淀为白藜芦醇粗品。虎杖苷标准品、白藜芦醇标准品及白藜芦醇粗品分别用薄层层析进行分析(图4)。以硅胶板G为薄层吸附剂，氯仿丙酮乙酸水G 4 1 0. 2)为展开剂，在紫外灯(365nm)下观察荧光斑点，并在365nm处进行扫描测定。 结论该Dll酶能催化虎杖苷为白藜芦醇，转化率约为40%。
权利要求
1.一种β-葡萄糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.编码权利要求1所述β-葡萄糖苷酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因序列如SEQID No. 2所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.由权利要求4所述重组载体转化得到的基因工程菌。
6.权利要求2或3所述的基因在制备重组β-葡萄糖苷酶中的应用。
7.如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在水解虎杖苷制备白藜芦醇中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述应用为在ρΗ为3 7的0.1 0. 5mol/L的Na2HPO4-柠檬酸缓冲液中，加入等体积的0. 5 lmg/ml虎杖苷水溶液，混合均勻，以β -葡萄糖苷酶为催化剂，所述的β -葡萄糖苷酶的终浓度为0. 01 0. lmg/ml，混勻后于25 40°C摇床反应10 20小时，取反应液3000 6000rpm离心15分钟，取沉淀经纯化得到所述白藜芦醇。
全文摘要
本发明提供了一种新的水解虎杖苷制备白藜芦醇的β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用。该β-葡萄糖苷酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明的有益效果主要体现在本发明提供了一种β-葡萄糖苷酶、编码基因、载体、工程菌及其应用，该β-葡萄糖苷酶能够水解虎杖苷制备白藜芦醇，环境友好，产率高，应用前景广阔。
文档编号C12N15/56GK102559642SQ20121001785
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者李海峰, 王秋艳, 黄黎锋 申请人:杭州师范大学