专利名称：一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及使用荧光定量PCR技术检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法和试剂盒。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,简称Lm)是一种人畜共患食源性致病菌，可使人畜患脑膜炎、心肌炎、败血症、早产等疾病，危害较大。李斯特氏菌亦是食源性四大病原菌之一，在环境中无处不在，在绝大多数食品中都能找到李斯特氏菌。肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特氏菌的感染源，这使得食品在储运加工过程中容易被Lm污染。该菌在4°C环境下仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一，因此,在食品卫生微生物检验中必须加以重视。李斯特氏菌中毒严重的可引起血液和脑组织感染，很多国家都已经采取措施来控制食品中的李斯特氏菌，并制定了相应的标准。其中，单核细胞增生李斯特氏菌是唯一能引起人类疾病的。Lm的致病性与多种毒力因子有关，包括李斯特氏菌溶血素(KListeriolysin0，简称LL0)、内化素、磷脂酶C、ActA蛋白等，由hly基因(GenBank:HM589598.1)编码的LLO是该菌侵染力的重要组成成分，是Lm的主要毒力因子。因此，针对Lm DNA中的hly基因提供一种简便、快速、灵敏、特异性高的检测方法成为目前食品卫生微生物检验的迫切需要
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，该方法利用针对单核细胞增生李斯特氏菌的毒力相关基因hly的特异性引物和Taqman荧光探针特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌。该方法能够快速、简便、敏感、特异地检测食品中的单核细胞增生李斯特氏菌的存在。本发明利用荧光定量PCR技术，针对李斯特氏菌属特异性毒力相关基因(hly基因)设计引物和Taqman突光探针。hly 基因上游引物序列:5’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)hly 基因下游引物序列:5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’ (SEQ ID NO:2)Taqman 荧光探针:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。对探针进行5’端FAM标记。反应条件为:95°C 5分钟；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集荧光)，共40个循环。本发明的另一个目的在于提供一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:针对单核细胞增生李斯特氏菌的毒力相关基因hly基因的特异性引物和Taqman荧光探针，其中，hly基因上游引物序列:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1) ;hly 基因下游引物序列:5，-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ (SEQ ID NO:2) ；Taqman 荧光探针:5’ -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)。
本发明的试剂盒中，优选地，进一步包括聚合酶及反应缓冲液，优选地，所述聚合酶为Taq酶。优选地，使用本发明的试剂盒进行检测的反应条件为:95°C 5分钟；95°C 15秒、60 0C 45秒、(收集荧光)，共40个循环。本发明的优点和效果如下:(1)敏感:荧光PCR检测技术是综合了 PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高。(2)特异:使用特异性引物和探针双重对靶分子进行识别，特异性好、准确性高、假阳性低。(3)简便安全:操作简单、安全、自动化程度高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染。(4)快速:速度快、高通量，可在2内小时完成。
图1为显示Lm阳性的扩增曲线的图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例实施例1.引物和探针设计l)hly基因引物设计设计可扩增一段80_120bp片段的引物，相关参数为:Tm值55.(TC -60.0°C，GC值40.0% -60.0%，引物大小20±3bp。所设计的引物序列如下:上游引物:5’-CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3’ (SEQ ID NO:1)下游引物:5’-CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3，(SEQ ID NO:2)3)探针设计在引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0 °C -70.0 °C，GC值40.0% -70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下:探针:5’-CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3’ (SEQ ID NO:3)上述引物和探针均由上海生工合成。实施例2.Lm菌的荧光定量PCR检测方法Lm标准菌株(中国药品生物制品检定研究所)经LB培养基培养过夜后采用天根细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302-02)按照说明书的步骤提取DNA。具体过程为PCR仪上将30 μ I包括下表中组分的反应体系(其中样本基因组DNA是从Lm标准菌株中提取的基因组DNA)进行PCR反应。
权利要求
1.一种检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，该方法利用针对单核细胞增生李斯特氏菌的毒力相关基因hly的特异性引物和Taqman荧光探针来特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌，其中，所述hIy基因的上游引物序列为5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’;所述hIy基因的下游引物序列为5’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3’;所述Taqman荧光探针的序列为5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
2.如权利要求1所述的方法，其中，反应条件为95°C5分钟；95°C 15秒、60°C 45秒、(收集荧光)，共40个循环。
3.—种检测单核细胞增生李斯特氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:针对单核细胞增生李斯特氏菌的毒力相关基因hly的特异性引物和Taqman荧光探针，其中，所述hly基因的上游引物序列为5 ’ -CGCAAAAGATGAAGTTCAAATCA-3 ’ ；所述hly基因的下游引物序列为5 ’ -CCTGGTGTTTCTCGATTAAAAGT-3 ’ ；所述Taqman荧光探针的序列为5， -CGACGGCAACCTCGGAGACTTACG-3，。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，使用所述试剂盒进行反应的条件为95°C5分钟；950C 15秒、60°C 45秒、(收集荧光)，共40个循环。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其进一步包括聚合酶及反应缓冲液。
6.如权利要求5所 述的试剂盒，其中，所述聚合酶为Taq酶。
全文摘要
本发明提供了一种一步检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法和试剂盒，该方法利用荧光定量PCR技术，对Lm菌的毒力相关基因hly进行特异性扩增，从而进行是否污染了Lm的检测。该方法能快速、简便、特异地检测单核细胞增生李斯特氏菌的存在。
文档编号C12R1/01GK103215344SQ201210017868
公开日2013年7月24日 申请日期2012年1月19日 优先权日2012年1月19日
发明者贾斌, 姜君, 陈唯军, 冯华华, 刘利成, 吴伟立 申请人:北京世纪盈和科技发展有限公司, 北京华大基因研究中心有限公司