专利名称：一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法及检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测原料乳中细菌的方法及检测试剂盒。
背景技术：
牛乳作为一种广泛食用并且是无数加工食品原辅料的重要动物源性食品 品种,是人类最理想的营养食品之一，人们对乳及乳制品的需求也在逐年增加。 然而牛乳也是一种最易遭受病菌污染而腐败变质的食品之一。乳制品中造成大 规摸人群食源性疾病暴发的主要致病菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增
李斯特氏菌、沙门氏菌、布鲁氏杆菌、志贺氏菌、蜡样芽孢杆菌等。1994年 美国暴发了由沙门氏菌造成的冰淇淋污染，约有22400人患病。2000年日本 大阪市爆发了由金黄色葡萄球菌造成的乳制品中毒事件，发病者达10682人。 2001年在江苏、安徽等地暴发的肠出血性大肠杆菌0157: H7食物中毒造成 177人死亡，中毒人数超过2万人。此外，世界各地仍有因致病菌的存在而导 致乳制品中毒事件的频频发生。这些事件的发生无不说明了检测乳中致病菌的 重要性。
目前检测乳中致病菌的方法除常规方法外主要应用PCR技术，但应用 PCR技术一次实验只能检测一种致病菌，而原料乳中可能同时存在多种不同 致病菌，有可能涉及不同种和型别的细菌，所以近些年来出现了一次实验可以 检测多种致病菌的多重PCR技术，但现在还没有针对乳中多种主要的致病菌 进行一次性的多重PCR检测。此外直接应用多重PCR技术需要8~12h的预增 菌时间，耗时长；通过加入过滤技术来快速富集菌体以节省预增菌的时间，如 美国的杜邦公司开发出了 BAX检测系统，这些系统可以在很短的时间内检出 致病菌，但这些体系所需的仪器动辄数十万元，目前还不能普遍应用，并且现 有采用过滤技术富集菌体只能过滤畜禽类肉品清洗后的污水等较"澄清，，的样 品，对于牛乳这种相对"混浊"且成分复杂的样品，虽有人也采用过滤技术进行 过滤，但一次过滤只能富集到一种致病菌。
发明内容
本发明是为了解决现有检测原料乳中致病菌的方法中存在不能同时检测 多种致病菌、耗时长、费用高或不适用于检测牛乳的问题，而提供一种同时检 测原料乳中多种致病菌的方法及检测试剂盒。
本发明同时检测原料乳中多种致病菌的方法按照如下步骤进行 一、将
200mL待检测的原料乳以3000g的离心力离心15min，去除上层的脂肪，得到 不含脂肪的样品，向样品中加入30mL、体积浓度为50n/。的EDTA-2Na溶液， 在37"C的水浴中保温30min; 二、将步骤一保温后的样品通过蔡氏过滤器进行 过滤，过滤后的滤膜剪成碎片，放入干燥无菌的烧瓶，向烧瓶中加入20mL的 生理盐水，放在漩涡振荡器上震荡洗脱2min;三、收集洗脱液，以10000g 的离心力离心5min，取下层菌体沉淀用lmL的灭菌双蒸水溶液重新悬浮，再 以10000g的离心力离心5min，弃去上清液，即得到菌体；四、利用细菌基因 组试剂盒提取细菌基因组DNA作为多重PCR模板，最后进行多重PCR，然 后以2y。凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，并以凝胶成像系统进行分析；即得到检 测结果；步骤四50nL多重PCR反应体系由44^iL的多重PCR反应液、2pL浓 度为2.5U/pL的Taq酶溶液和4pL的DNA模板组成；其中44^iL的多重PCR 反应液由5pL的10 xpCR buffer、 3^iL浓度为10_2mol/L的dNTPs、 8pL的引 物液和28pL的灭菌双蒸水组成，引物液中含有单增李斯特氏菌引物 2.5xlO—Umo1、沙门氏菌引物1.25xl(r1111101、金黄色葡萄球菌引物2.5xl0-umol、 大肠杆菌0157:H7引物1.25xl()-Umo1和蜡样芽孢杆菌引物2.5 xlO^mol;扩 增反应条件为预变性95-C5min，变性94。C50s，退火59。C50s，延伸72。C50s， 共40个循环，延伸7(TCl0min;单增李斯特菌上游引物为5，-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3,，单增李斯特菌下游引物为5，-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3，， 沙门氏菌上游引物为 5，-ACTCTGCCGGGATTCCCACT-3，， 沙门氏菌下游引物为 5，-CAGTCCTAACGACGACCCTTCT-3，，金黄色葡萄球菌上游引物为5，-AAGGGCAATACGCAAAGAGGT-3，，金黄色葡萄球菌下游引物为5，-AATGCACTTGCTTCAGGACCATA-3，，大肠杆菌0157:H7上游引物为5，國 AACAGGAGGTGTCAGTAGGGAAGC-3'，大肠杆菌0157:H7下游引物为5，-CCCCATCATCGCCGTATAGTC-3，，蜡样芽孢杆菌上游引物为5，-
TGGACAAACTCAAACTCAAACGAC-3，，蜡样芽孢杆菌下游引物为5，-TGTTACTCCACCGATTACAGCGT-3 ，。
本发明的单增李斯特菌引物为根据单增李斯特菌设计的李氏溶血素O基
因(/2(^)特异性引物，沙门氏菌引物为根据沙门氏菌设计的吸附和侵袭上
皮细胞表面蛋白基因(/m^4)特异性引物，金黄色葡萄球菌引物为根据金黄色 葡萄球菌设计耐热性核酸酶基因(m/c)特异性引物，大肠杆菌0157:H7引物 为根据大肠杆菌0157:H7肠溶血素A基因(W>^)特异性引物，蜡样芽孢杆 菌引物为根据蜡样芽孢杆菌肠毒素FM基因(e"WM)特异性引物。
本发明同时检测多种致病菌的试剂盒中按照体积份数由1份、浓度为 2.5U/jiL的Taq酶溶液、20份的多重PCR反应液、1份的阴性对照液和1份 的阳性对照液组成；其中每44pL的多重PCR反应液由5pL的10 xPCRbuffer、 3pL浓度为l(T2mol/L的dNTPs、 8pL的引物液和28pL的灭菌双蒸水组成， 引物液中含有单增李斯特氏菌引物2.5xlO—Umo1、沙门氏菌引物1.25xlO—Umo1、 金黄色葡萄球菌引物2.5xl(T1111101、大肠杆菌0157:H7引物1.25xl(T1111101和蜡 样芽孢杆菌引物2.5 xl0—Umol;阳性对照液为五种致病菌标准菌株培养液中提 取的基因组DNA;阴性对照液为灭菌双蒸水。
本发明的试剂盒用于检测原料乳中的单增李斯特菌、沙门氏菌、金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌0157:H7和蜡样芽孢杆菌。
本发明同时检测原料乳中多种致病菌的方法具有以下优点1、单次检测 时间比直接应用多重PCR技术检测时间节省了 7 11个小时，操作简单、快速； 2、能够同时检测原料乳中五种主要致病菌；3、具有很高的特异性，并且检测 灵敏度最低达到1(^cfU/mL;4、采用离心脱脂后再用EDTA处理乳中的蛋白质， 快速过滤技术能够应用于富集牛乳中的菌体，节省了菌体富集时间；5、不需 要昂贵的测试仪器；6、用于检测致病菌的引物根据致病菌基因设计，特异性 强、针对性好。
本发明同时检测原料乳中多种致病菌的试剂盒具有以下优点1、比现有 的多重PCR操作节约了步骤和时间；2、只需按照PCR操作的规程进行操作， 操作人员不需要特别培训；3、提供阴性和阳性对照，以供实验人员对结果进 行准确分析；4、能够同时检测原料乳中五种主要致病菌。
图1为具体实施方式
一检测牛乳的电泳结果图；其中1泳道为标准Marker; 2泳道为污染梯度为1()Scfli/mL的检测；3泳道为污染梯度为104cfU/mL的检测； 4泳道为污染梯度为10^fU/mL的检测；5泳道为污染梯度为1(^cfU/mL的检观" 6泳道带为污染梯度为10Vfb/mL的检测；7泳道为阴性对照。
具体实施例方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方 式间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式一、将200mL待检测的原料乳以3000g的 离心力离心15min，去除上层的脂肪，得到不含脂肪的样品，向样品中加入 30mL、体积浓度为50。/。的EDTA-2Na溶液，在37。C的水浴中保温30min; 二、 将步骤一保温后的样品通过蔡氏过滤器进行过滤，过滤后的滤膜剪成碎片，放 入干燥无菌的烧瓶，向烧瓶中加入20mL的生理盐水，放在漩涡振荡器上震荡 洗脱2min;三、收集洗脱液，以10000g的离心力离心5min，取下层菌体沉 淀用lmL的灭菌双蒸水溶液重新悬浮，再以10000g的离心力离心5min，弃 去上清液，即得到菌体；四、利用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA作 为多重PCR模板，最后进行多重PCR，然后以2Q/。凝胶电泳鉴定PCR扩增产 物，并以凝胶成像系统进行分析；即得到检测结果；步骤四50^iL多重PCR反 应体系由44pL的多重PCR反应液、2pL浓度为2.5U/pL的Taq酶溶液和4|_iL 的DNA模板组成；其中44pL的多重PCR反应液由5fiL的10 xPCRbuffer、 3^L浓度为l(T2mol/L的dNTPs、 8piL的引物液和28pL的灭菌双蒸水组成， 引物液中含有单增李斯特氏菌引物2.5xl0'"mo1、沙门氏菌引物1.25xl0-"mo1、 金黄色葡萄球菌引物2.5xl(T"mo1、大肠杆菌0157:H7引物1.25xl(r"mo1和蜡 样芽孢杆菌引物2.5 xlO^mol;扩增反应条件为预变性95。C5min，变性94°C 50s，退火59。C50s，延伸72。C50s，共40个循环，延伸70。C10min;单增李斯 特菌上游引物为5，- CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3'，单增李斯特菌下 游引物为5，- TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3'，沙门氏菌上游引物为5，-ACTCTGCCGGGATTCCCACT-3，， 沙门氏菌下游引物为 5，-CAGTCCTAACGACGACCCTTCT-3，，金黄色葡萄球菌上游引物为5，-
AAGGGCAATACGCAAAGAGGT-3，，金黄色葡萄球菌下游引物为5'-AATGCACTTGCTTCAGGACCATA-3，， 大肠杆菌0157:H7上游引物为5，-AACAGGAGGTGTCAGTAGGGAAGC-3'，大肠杆菌0157:H7下游引物为5，-CCCCATCATCGCCGTATAGTC-3，， 蜡样芽孢杆菌上游引物为5，-TGGACAAACTCAAACTCAAACGAC-3'，蜡样芽孢杆菌下游引物为5'-TGTTACTCCACCGATTACAGCGT-3'。
将不同浓度梯度的混合菌液(单增李斯特氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球、 大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的混合菌液)人工污染到牛乳中，污染梯度分别为 105cfb/mL、 104cfti/mL、 103cfb/mL、 102cfU/mL和lO^fU/mL,用本实施方式的 方法检测污染的牛乳，检测结果如图1所示(图1中1泳道100bpDNAMarker 自上至下条带分别为1500bp、 lOOObp、 900bp、 800bp、 700bp、 600bp、 500bp、 400bp、 300bp、 200bp、 lOObp)，从图1中可以看出本实施方式的方法检测灵 敏度为102cfU/mL，而大多数致病菌的的剂量在大于10^fo/mL(g)才能引起疾 病的发生，说明本实施方式的方法能够应用于原料乳中致病菌的检测。单增李 斯特氏菌的条带为112bp，沙门氏菌的条带为168bp，金黄色葡萄球的条带为 334bp，大肠杆菌的条带为240bp，蜡样芽孢杆菌的条带为610bp。
具体实施方式
二本实施方式同时检测多种致病菌的试剂盒中按照体积份 数由1份、浓度为2.5UVL的Taq酶溶液、20份的多重PCR反应液、1份的 阴性对照液和1份的阳性对照液组成；其中每44pL的多重PCR反应液由5^iL 的10 xPCRbuffer、 3pL浓度为l()-2mol/L的dNTPs、 8jiL的引物液和28pL的 灭菌双蒸水组成，弓l物液中含有单增李斯特氏菌引物2.5xl(T"mo1、沙门氏菌 引物1.2Sxl0-"mo1、金黄色葡萄球菌引物2.5xl0-"mo1、大肠杆菌0157:H7引 物1.25xl(TUmol和蜡样芽孢杆菌引物2.5 xlO^mol;阳性对照液为五种致病菌 标准菌株培养液中提取的基因组DNA;阴性对照液为灭菌双蒸水。
本实施方式的试剂盒用于具体实施方式
一中步骤四的多重PCR检测，单 增李斯特氏菌引物、沙门氏菌引物、金黄色葡萄球菌引物、大肠杆菌0157:H7 引物和蜡样芽孢杆菌引物都与具体实施方式
一中的引物相同。
本实施方式的试剂盒需要在-20。C的条件下保存。
序列表
<110>东北农业大学
<120> —种同时检测原料乳中多种致病菌的方法及检测试剂盒
<160> 10
<210> 1 <211>24 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据单增李斯特菌设计的李氏溶血素O基因(W_M) PCR扩增上游引物。 <400> 1
cactgcatct ccgtggtata ctaa 24
<210>2 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据单增李斯特菌设计的李氏溶血素O基因"/;;」)PCR扩增下游引物。 <400> 2
tgcaagtcct aagacgcca 20
<210> 3 <211>20 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据沙门氏菌设计的吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因Gm^)PCR扩增上游引物。 <400> 3
actctgccgg.gattcccact 20
<210>4 <211>22 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据沙门氏菌设计的吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因(/m^)PCR扩增下游引物。 <400> 4
cagtcctaac gacgaccctt ct 22
<210> 5 <211>21 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据金黄色葡萄球菌设计的耐热性核酸酶基因("wcr) PCR扩增上游引物。 <400> 5
aagggcaata cgcaaagagg 121
<210>6 <211>23 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据金黄色葡萄球菌设计的耐热性核酸酶基因(""c) PCR扩增下游引物。 <400> 6
aatgcacttg cttcaggacc ata 23
<210>7 <211>24 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据大肠杆菌0157:H7设计的肠溶血素A基因(/z/;^) PCR扩增上游引物。 <400> 7
aacaggaggt gtcagtaggg aagc 24
<210> 8 <211>21 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据大肠杆菌0157:H7设计的肠溶血素A基因(W少j) PCR扩增下游引物。 <400> 8
ccccatcatc gccgtatagt c 21
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列 <220>
<223>根据蜡样芽孢杆菌设计的肠毒素FM基因(eWFM) PCR扩增上游引物。 <400> 9
tggacaaact caaactcaaa cgac 24
<210> 10 <211>22 <212>DNA <213>人工序列
<220>
<223>根据蜡样芽孢杆菌设计的肠毒素FM基因(ewFM) PCR扩增下游引物。 <400> 10
tgttactcca ccgattacagc gt 2权利要求
1、一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法，其特征在于同时检测原料乳中多种致病菌的方法按照如下步骤进行一、将200mL待检测的原料乳以3000g的离心力离心15min，去除上层的脂肪，得到不含脂肪的样品，向样品中加入30mL、体积浓度为50％的EDTA-2Na溶液，在37℃的水浴中保温30min；二、将步骤一保温后的样品通过蔡氏过滤器进行过滤，过滤后的滤膜剪成碎片，放入干燥无菌的烧瓶，向烧瓶中加入20mL的生理盐水，放在漩涡振荡器上震荡洗脱2min；三、收集洗脱液，以10000g的离心力离心5min，取下层菌体沉淀用1mL的灭菌双蒸水溶液重新悬浮，再以10000g的离心力离心5min，弃去上清液，即得到菌体；四、利用细菌基因组试剂盒提取细菌基因组DNA作为多重PCR模板，最后进行多重PCR，然后以2％凝胶电泳鉴定PCR扩增产物，并以凝胶成像系统进行分析；即得到检测结果；步骤四50μL多重PCR反应体系由44μL的多重PCR反应液、2μL浓度为2.5U/μL的Taq酶溶液和4μL的DNA模板组成；其中44μL的多重PCR反应液由5μL的10×PCR buffer、3μL浓度为10-2mol/L的dNTPs、8μL的引物液和28μL的灭菌双蒸水组成，引物液中含有单增李斯特氏菌引物2.5×10-11mol、沙门氏菌引物1.25×10-11mol、金黄色葡萄球菌引物2.5×10-11mol、大肠杆菌O157H7引物1.25×10-11mol和蜡样芽孢杆菌引物2.5×10-11mol；扩增反应条件为预变性95℃5min，变性94℃50s，退火59℃50s，延伸72℃50s，共40个循环，延伸70℃10min；单增李斯特菌上游引物为5’-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3’，单增李斯特菌下游引物为5’-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3’，沙门氏菌上游引物为5’-ACTCTGCCGGGATTCCCACT-3’，沙门氏菌下游引物为5’-CAGTCCTAACGACGACCCTTCT-3’，金黄色葡萄球菌上游引物为5’-AAGGGCAATACGCAAAGAGGT-3’，金黄色葡萄球菌下游引物为5’-AATGCACTTGCTTCAGGACCATA-3’，大肠杆菌O157H7上游引物为5’-AACAGGAGGTGTCAGTAGGGAAGC-3’，大肠杆菌O157H7下游引物为5’-CCCCATCATCGCCGTATAGTC-3’，蜡样芽孢杆菌上游引物为5’-TGGACAAACTCAAACTCAAACGAC-3’，蜡样芽孢杆菌下游引物为5’-TGTTACTCCACCGATTACAGCGT-3’。
2、 一种同时检测原料乳中多种致病菌的试剂盒，其特征在于同时检测多 种致病菌的试剂盒中按照体积份数由1份、浓度为2.5U&L的Taq酶溶液、 20份的多重PCR反应液、1份的阴性对照液和1份的阳性对照液组成；其中 每44(iL的多重PCR反应液由5|iL的10 xPCR buffer、 3pL浓度为l(T2mol/L 的dNTPs、 8pL的引物液和28pL的灭菌双蒸水组成，引物液中含有单增李斯 特氏菌引物2.5xlO—Umo1、沙门氏菌引物1.25x10—Umol、金黄色葡萄球菌引物 2.5xl(T"mo1、大肠杆菌0157:H7引物1.25xl(r"mo1和蜡样芽孢杆菌引物2.5 xlO-"mol;阳性对照液为五种致病菌标准菌株培养液中提取的基因组DNA; 阴性对照液为灭菌双蒸水。
全文摘要
一种同时检测原料乳中多种致病菌的方法及检测试剂盒，它涉及了一种检测原料乳中细菌的方法及检测试剂盒。本发明解决了现有检测原料乳中致病菌的方法中存在不能同时检测多种致病菌、耗时长、费用高或不适用于检测牛乳的问题。本发明同时检测原料乳中多种致病菌的方法按照如下步骤进行一、将待检测的原料乳去除脂肪；二、将步骤一保温后的样品过滤；三、收集洗脱液；四、进行多重PCR并对凝胶成像系统进行分析；即得到检测结果。本发明的试剂盒由Taq酶溶液、多重PCR反应液、阴性对照液和阳性对照液组成。本发明的方法具有耗时短、费用低、适用于检测牛乳和检测结果准确的优点。本发明的试剂盒使用方便。
文档编号C12Q1/04GK101386884SQ20081013744
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月31日 优先权日2008年10月31日
发明者伟 刘, 琦 吕, 姜毓君, 张光辉, 毕宇涵, 王明娜, 丽 相, 凤 赵, 冰 闫, 韩希妍 申请人:东北农业大学