专利名称：基于nasba的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术领域，涉及一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒。
背景技术：
我国是食品消费和生产的世界第一大国，食品安全是重大的民生问题，是国家和人民密切关注的话题。然而近些年我国的食品安全事故频繁发生，食品安全问题已然成为国人心中挥之不去的梦魇。据调查，让人不安的食品安全是导致民众幸福指数较低的主要原因。食源性疾病是食品安全的最大问题，给消费者健康和安全带来严重威胁。食源致病菌是引起食源性疾病的主要致病因子。2011年10月，上海家乐福超市的思念牌三鲜水饺被检出含有金黄色葡萄球菌，该细菌很可能会导致肺炎。2012年4月，广东有两批次婴儿配方奶粉被检出含有阪崎肠杆菌，该病菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和败血症，死亡率高达50%以上。2012年11月，国家质检总局组织了产品质量国家监督抽查，福建省的扭扭虾味条大肠菌群实测值是标准值的100倍以上。食源致病菌一直难以得到及时有效的监控，不仅对食品卫生和人民健康构成严重威胁，也对食品工业和国民经济造成很大的影响。因此，发展一种快速、灵敏、特异、安全的检测食源致病菌的方法对食品安全体系的完善、预防人类食源性疾病的发生具有重要意义。传统的食源致病菌的检测方法主要有培养鉴定法、电子显微镜观察法、免疫学检测方法等。培养鉴定法的操作烦琐，需时较长，而其他方法具有灵敏度低、特异性不高、耗时长、需要昂贵仪器 等缺点。传统的方法在相当程度上限制了对食源致病菌的快速检测能力，而近年来发展的分子生物学新技术就能够实现高通量、快速、准确的检测，其中核酸扩增技术使得分子检测的灵敏度和准确性大大提高。为了使扩增技术更适应现代分子诊断的需求，许多研究都集中在新的检测技术的开发。试纸条检测技术无疑为分子检测提供了便捷的途径。近期，基于与核酸扩增技术相结合的核酸试纸条发展迅速，其与免疫试纸条相比，具有成本低、应用范围广、灵敏度高、准确性好的特点。依赖核酸序列扩增(Nucleicacid sequence-based amplification, NASBA)是一种特别适合扩增RNA的技术，是由I对带有T7启动子序列的引物引导的灵敏的恒温扩增技术，其产生的大量单链RNA易于在试纸条上实现快速、准确、高灵敏度检测。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种基于NASBA与试纸条检测结合的快速、灵敏、准确、操作简便的检测食源致病菌的方法。本发明的另一目的在于提供一种使用上述方法检测单增李斯特菌的试剂盒。本发明的目的通过下述技术方案实现，基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，具体包括以下步骤:( I)模板的准备:提取食源致病菌的RNA。
(2)设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物:T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶识别的Τ7启动子序列。(3) NASBA反应:将步骤(I)制备的模板、步骤(2)设计合成的引物进行NASBA扩增反应，得到单链RNA产物。(4)探针的设计:根据单链RNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针I和探针2分别和单链RNA广物的两端互补,探针3与探针I完全互补；二条探针的一端都修饰有功能基团。(5)纳米金探针的制备:将步骤(4)中所设计合成的探针I与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针。(6)胶体金核酸试纸条的制备胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜(NC膜)和吸水板依次搭接固定于底板上(如图5所示结构)组装得到胶体金核酸试纸条。所述的金垫包埋有步骤(5)制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线(C线)和含链霉亲和素和探针2的检测线(Τ线)，检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。(7)检测:将由步骤(3)得到的RNA产物与含甲酰胺(甲酰胺能够破坏RNA的二级结构，从而提高其与探针的杂交效率)的SSC缓冲液(柠檬酸钠缓冲液)混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加SSC缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序列存在，即有待测食源致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌。步骤(I)中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、大肠杆菌 0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)>志贺氏菌(Shigella.Spp)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)和腊状芽抱杆菌(Yersiniaenterocolitica)等。步骤(2)中所述的食源致病菌保守序列优选为食源致病菌16S rRNA基因的可变区序列或毒力基因片段，如单增李斯特菌16S核糖体RNA基因(16S rRNA基因)、沙门氏菌的侵袭基因A (invA)等。步骤(2)中所述的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA。步骤(3)中所述的NASBA反应的体系包含:模板RNA、AMV逆转录酶、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶、T7RNA聚合酶缓冲液、RNaseH、RNA酶抑制剂、T7弓丨物、引物2,dNTPs,NTPs、牛血清白蛋白(BSA)、二甲基 亚砜(DMSO)和DEPC (焦碳酸二乙酯)处理水；所述的T7引物的终浓度为300 500nM ;所述的引物2的终浓度为300 500nM。步骤(3)中所述的NASBA反应的条件优选为每25 μ L反应体系的组成如下:模板RNAlng/μ L、Τ7引物400ηΜ、引物2400nM、AMV逆转录酶8U、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶36U、RNA酶抑制剂10U、RNaseH5U、NTPs2mM (每种核糖核苷三磷酸的浓度为2mM)、dNTPsImM (每种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度为lmM)、DMS0的体积百分比为10%、BSA终浓度为0.1 μ g/μ L ;扩增过程优选为:配制混合液A于65°C加热5分钟，再于41°C冷却5min，加入酶混合液，于41°C孵育90min，4°C终止反应；所述的混合液A包括:模板RNA、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、5XT7RNA聚合酶缓冲液、5XAMV逆转录酶缓冲液、DMSO和DEPC处理水；所述的酶混合液包括:5 X T7RNA聚合酶缓冲液、5 XAMV逆转录酶缓冲液、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNaseH, RNA酶抑制剂、BSA和DEPC处理水。步骤(3)中所述的单链RNA产物的长度优选为120 270nt。步骤(4)中所述的探针I和探针2的长度优选为20 30nt。步骤(4)中所述的探针I的功能基团优选为巯基，探针2和探针3的功能基团优选为生物素。步骤(5)中所述的纳米金的粒径优选为13nm。步骤(5)中所述的包埋缓冲液为:Na3P0420mM，BSA (牛血清白蛋白)质量百分比5%，Tween X-100体积百分比0.25%,鹿糖质量百分比8%。步骤(6)中所述的底板的材料优选为PVC塑料(聚氯乙烯塑料)。步骤(6)中所述的样品板的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为:用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为ΦΗ8.0，体积百分比0.25% 的 Triton X-100,0.05Μ Tris_HCl，0.15M NaCl。步骤(6)中所述的金垫的材料优选为玻璃纤维，其处理方法为:用50yL步骤(4)中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4°C保存。步骤(6)中所述的硝酸纤维素膜的处理方法优选为:用喷膜仪将6 μ L链霉亲和素溶液和探针2混合液喷到检测线(Τ线)的位置，将6 μ L链霉亲和素溶液和探针3混合液喷到控制线(C线)的位置，置于室温下干`燥lh，并于4°C干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1.67mg/mL，所述的探针2和探针3的浓度为ImM ;所述的检测线宽2mm与金垫相隔6mm,所述的控制线宽2mm与金垫相隔12mm。步骤(6)中所述的吸水板的材料优选为吸水纤维。步骤(6)中所述的组装优选为:底板在最下层，NC膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于NC膜的上部的一侧并与之重叠2mm，样品板位于金垫的上部与之重叠2mm，吸水板位于NC膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与NC膜重叠2mm,最后用切条机切成4mm宽的条。步骤(7)中所述的样品的检测的过程优选为:将25 μ L由步骤(3)得到的RNA产物与125 μ L含体积浓度6%甲酰胺的4XSSC缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，IOmin后，再滴加50μ L4XSSC缓冲液，15min之内读取结果。所述的食源致病菌为单增李斯特菌时，其保守序列为16S rRNA基因；扩增保守序列的引物为:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物2:5，-AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；单链RNA 产物的序列为:5 ’ -CAUC腳AAGCGAUAGCCGAAACCAUC UUUCAAAAGCGUGGCAUGCGCCACACUUUAUCAUUCGGUAUUAGCUCCGGUUUCCCGGAGUUAUCCCCAACUUACAGGCAGGUUGCCCACGUGUUA CUCACCCGUCCGCCACUAACUUUGGAAGAGCAAGCU-3，:单下划线部分为与探针I互补配对的，双下划线表示的是探针2结合的区域；探针3与探针I完全互补；探针I 为:5’ -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’(SH 表示巯基)；探针2 为:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bi0-3’ (Bio 表示生物素)；
探针3 为:5’ -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ (Bio 表示生物素)。使用上述方法检测单增李斯特菌的试剂盒，包含A、B两个分试剂盒；A分试剂盒包含引物、酶、酶缓冲液、RNaseH, RNA酶抑制剂、牛血清白蛋白(BSA)、dNTPs、NTPs、DMSO、DEPC 处理水，其中:所述的弓丨物包括T7引物和引物2:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物2:5，-AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；所述的酶包括AMV逆转录酶和T7RNA聚合酶；所述的酶缓冲液包括:AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA酶缓冲液；B分试剂盒包含探针、缓冲液、胶体金核酸试剂条；所述的探针包括探针1、2和3:探针I 为:5’ -SH-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’(SH 表示巯基)；探针2 为:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-Bi0-3’ (Bio 表示生物素)；探针3 为:5’ -Bio-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ (Bio 表示生物素)；所述的缓冲液包 括4X SSC缓冲液、含体积浓度6%甲酰胺的4X SSC缓冲液。所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板(材料为PVC塑料)上且依次搭接的样品板(材料为玻璃纤维)、金垫(材料为玻璃纤维)、硝酸纤维素膜和吸水板(材料为吸水纤维);金垫包埋有连接探针I的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线(C线)和含链霉亲和素和探针2的检测线(T线)，检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。本发明的基本原理(如图1所示):当检测体系存在目的基因片段时，T7引物与其结合进行退火，同时体系中还存在AMV逆转录酶、RNase H和T7RNA聚合酶。在AMV逆转录酶作用下，形成DNA-RNA杂合体，接着体系里的RNase H将杂合体中的RNA链特异降解。引物2随后与此单链DNA结合退火，由于AMV逆转录酶具有DNA依赖的DNA聚合酶活性，因此在AMV逆转录酶作用下，催化合成双链DNA。因T7引物的5’端带有能被T7RNA聚合酶识别的启动子序列，所以此双链DNA就可作为T7RNA聚合酶的催化底物转录合成反义RNA。反义RNA可与引物2结合退火，在AMV逆转录酶作用下，催化合成RNA-DNA杂合体，然后RNaseH特异降解RNA链，形成的单链DNA与T7引物结合退火，在AMV逆转录酶作用下合成带有T7RNA聚合酶识别位点的双链DNA，又转录合成反义RNA。反义RNA重复循环进行DNA合成、RNA降解、T7RNA聚合酶的转录扩增，使得RNA不断得以扩增。扩增所得的RNA产物滴加到样品板上时，通过层析作用，先与金垫处已经包埋的纳米金探针杂交，当其到达已包埋有与RNA产物互补的探针2的检测线(T线)处时，RNA、纳米金探针和探针2形成“三明治结构”，就会形成一条红色的线，过量的纳米金探针继续层析，到达已包埋有探针3的控制线(C线)处时形成第二条红色的线。而不含目的基因片段时，检测线(T线)处因不能形成“三明治”结构的杂交产物，而没有红色的线出现，只有过量的纳米金探针继续层析，到达已包埋有探针3的控制线(C线)处时形成一条红色的线。若检测线(T线)和控制线(C线)处都无红色的线出现，则表明试纸条已经失效，检测失败，样品需要重新检测。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(I)依赖核酸序列扩增(NASBA)可在此内将模板RNA扩增IO9倍，比常规PCR法高1000倍。NASBA技术由于它的引物上带有T7启动子序列，而外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，因此在有DNA污染的条件下，NASBA技术同样具有较高的特异性和灵敏度。NASBA将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。(2)将NASBA与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，结果稳定。(3)检测速度快，特异性好，灵敏度高。(4)设备简单，成本低，无需昂贵的仪器。(5)探针设计简单，操作步骤简短，易于推广。(6)本发明没有溴化已锭、同位素等有害物质的使用，没有安全隐患，使用安全。
图1是基于NASBA的试纸条检测食源性致病菌的原理图。图2是单增李斯特菌总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。图3是NASBA反应产物的琼脂糖凝胶电泳图。图4是13nm胶体金的吸收光谱图，在520mm处有最大吸收峰。图5是试纸条的组装结构以及各部分包埋情况图。图6是基于NASBA的试纸条检测单增李斯特菌结果图，阴性结果(I号试纸条)和阳性结果(2号试纸 条)。
具体实施例方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。将本发明的方法应用于单增李斯特菌的检测。如图1所示为基于NASBA的试纸条检测食源性致病菌的原理图。实施例中所用试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司和生工生物工程(上海)股份有限公司，试纸条材料及设备均购自上海金标生物科技有限公司。实施例1(I)单增李斯特菌(菌株CMCC54007，购买于广州微生物研究所)总RNA的提取:①液氮研磨，取大约5mL菌液于研钵内，加入少量液氮，迅速研磨，研磨过程中不断加入液氮，直到研磨充分为止。研磨后将细胞裂解物转入1.5mL EP管中，再在研磨器内加入0.8mL Trizol，吹打研钵上的残余裂解物，倒入EP管中。②盖好盖子，颠倒混匀10次，室温静置5分钟。③往EP管中加入0.2mL氯仿，盖好盖子，用力摇晃15秒钟，使液体充分混匀，室温静置5分钟后，12000转离心15分钟。④将上清转移至新的1.5mL EP管中(大约为0.5mL)，加入0.5mL异丙醇，用力摇晃15秒钟，使液体充分混匀，放置于_20°C冰箱中I小时。⑤12000转离心10分钟，小心弃去上清，加入I毫升预冷的75%酒精的DEPC溶液，
震荡洗涤。⑥7500转离心5分钟，小心弃去上清，开盖于超净台内30分钟吹干沉淀，此时RNA沉淀变为透明。
⑦EP管中加入20 μ L DEPC溶液溶解沉淀，如沉淀溶解困难，可在55 60°C水浴中最多10分钟助溶。提取后的RNA可放置于-80°C冰箱中保存或立即进行实验。提取结果如图2所示，M为DL2000，I为单增李斯特菌总RNA，细菌的核糖体亚基中包含3种沉降系数不同的rRNA，分别是16S rRNA, 5S rRNA和23S rRNA。其余RNA的丰度低，在琼脂糖电泳中看不出条带。(2)引物及探针设计:根据单增李斯特菌的16S rRNA基因可变区序列设计可以扩增出159nt的RNA片段(如图3所示，M为DL2000，1、2分别为lng/yL、0.1ng/μ L模板浓度下的扩增条带)的引物(Τ7引物和引物2)。探针I和探针2分别和RNA产物的两端互补，探针3与探针I完全互补。所用到的引物和探针如表I所示:表I引物列表
权利要求
1.一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于包括如以下步骤: (1)模板的准备:提取食源致病菌的RNA； (2)设计合成两条用于扩增食源致病菌保守序列的引物:T7引物和引物2，T7引物中含有能被T7RNA聚合酶识别的Τ7启动子序列； (3)NASBA反应:将步骤(I)制备的模板、步骤(2)设计合成的引物进行NASBA扩增反应，得到单链RNA产物； (4)探针的设计:根据单链RNA产物的序列设计三条捕捉探针，探针I和探针2分别和单链RNA产物的两端互补，探针3与探针I完全互补；三条探针的一端都修饰有功能基团； (5)纳米金探针的制备:将步骤(4)中所设计合成的探针I与纳米金连接制备纳米金探针，并用包埋缓冲液重悬纳米金探针得到用于包埋的纳米金探针； (6)胶体金核酸试纸条的制备 胶体金核酸试纸条由底板、样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板构成，将样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板依次搭接固定于底板上组装得到胶体金核酸试纸条； 所述的金垫包埋有步骤(5)制备的纳米金探针；所述的硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线； (7)检测:将由步骤(3)得到的RNA产物与含甲酰胺的柠檬酸钠缓冲液混合，混合液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，再滴加柠檬酸钠缓冲液，读取结果，检测线和控制线都变成红色表明有靶序 列存在，即有待测食源致病菌，仅有控制线变成红色表明没有待测食源致病菌。
2.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(I)中所述的食品致病菌包括单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌0157:Η7、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、创伤弧菌和蜡状芽孢杆菌； 步骤(2)中所述的食源致病菌保守序列为食源致病菌16S rRNA基因的可变区序列或毒力基因片段； 步骤(2)中所述的T7启动子序列为TAATACGACTCACTATAGGGAGA。
3.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(3)中所述的NASBA反应的体系包含:模板RNA、AMV逆转录酶、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶、T7RNA聚合酶缓冲液、RNaseH, RNA酶抑制剂、T7引物、引物2、dNTPs、NTPs、牛血清白蛋白、DMSO和DEPC处理水；所述的T7引物的终浓度为300 500nM ;所述的引物2的终浓度为300 500nM ； 步骤(3)中所述的单链RNA产物的长度为120 270nt。
4.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(3)所述的NASBA反应的条件为每25 μ L反应体系的组成如下:模板RNAlng/ μ L、Τ7引物400ηΜ、引物2400nM、AMV逆转录酶8U、AMV逆转录酶缓冲液、T7RNA聚合酶36U、RNA酶抑制剂10U、RNaseH5U、NTPs2mM、dNTPslmM、DMS0的体积百分比为10%、牛血清白蛋白终浓度为0.1 μ g/ μ L ;扩增过程为:配制混合液A于65°C加热5分钟，再于41°C冷却5min，加入酶混合液，于41°C孵育90min，4°C终止反应；所述的混合液A包括:模板RNA、T7引物、引物,2、dNTPs、NTPs、5XT7RNA聚合酶缓冲液、5XAMV逆转录酶缓冲液、DMSO和DEPC处理水；所述的酶混合液包括:5 X T7RNA聚合酶缓冲液、5 X AMV逆转录酶缓冲液、AMV逆转录酶、T7RNA聚合酶、RNaseH, RNA酶抑制剂、牛血清白蛋白和DEPC处理水。
5.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(4)中所述的探针I和探针2的长度为20 30nt ；步骤(4)中所述的探针I的功能基团为巯基，探针2和探针3的功能基团为生物素。
6.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(5)中所述的纳米金的粒径为13nm ; 步骤(5)中所述的包埋缓冲液为:Na3P0420mM，BSA质量百分比5%，Tween X-100体积百分比0.25%,鹿糖质量百分比8%。
7.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(6)中所述的底板的材料为聚氯乙烯塑料； 步骤(6)中所述的样品板的材料为玻璃纤维，其处理方法为:用样品板处理缓冲液浸润，置于干燥器中室温保存；所述的样品板处理缓冲液为:PH8.0，体积百分比0.25%的Triton X-100,0.05M Tris-HCl,0.15M NaCl ； 步骤(6)中所述的金垫的材料为玻璃纤维，其处理方法为:用50yL步骤(4)中所述的用于包埋的纳米金探针喷在其上，室温下干燥，干燥器中4°C保存； 步骤(6)中所述的硝酸纤维素膜的处理方法为:用喷膜仪将6μ L链霉亲和素溶液和探针2混合液喷到检测线的位置，将6 μ L链霉亲和素溶液和探针3混合液喷到控制线的位置，置于室温下干燥lh，并于4°C干燥保存；所述的链霉亲和素溶液浓度为1.67mg/mL，所述的探针2和探针3的浓度为ImM ； 步骤(6)中所述的吸水板的材料为吸水纤维； 步骤(6)中所述的组装为:底板在最下层，硝酸纤维素膜粘贴在底板上的中间部位，金垫位于硝酸纤维素膜的上部的一侧并与之重叠，样品板位于金垫的上部与之重叠，吸水板位于硝酸纤维素膜的上部相对与金垫和样品板的另一侧并与硝酸纤维素膜重叠。
8.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 步骤(7)中所述的样品的检测的过程为:将25 μ L由步骤(3)得到的RNA产物与125 μ L含体积浓度6%甲酰胺的4Χ柠檬酸钠缓冲液组成的溶液滴加到胶体金核酸试纸条的样品板上，IOmin后，再滴加50 μ L4X柠檬酸钠缓冲液，15min之内读取结果。
9.根据权利要求1所述的基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法，其特征在于: 所述的食源致病菌为单增李斯特菌时，其保守序列为16S rRNA基因；扩增保守序列的引物为:T7 引物:5，-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAG CGATAGCC-3，；引物 2:5’ -AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ；探针 I 为:5’ -巯基-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’ ；探针 2 为:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-生物素 _3’ ；探针 3 为:5’ -生物素-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’。
10.使用权利要求1 7任一项所述的方法检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包含A、B两个分试剂盒； A分试剂盒包含引物、酶、酶缓冲液、RNaseH, RNA酶抑制剂、牛血清白蛋白、dNTPs、NTPs、DMSO、DEPC 处理水，其中:所述的引物包括T7引物和引物2:T7 引物:5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACATCTGTAAGC GATAGCC-3’ ；引物 2:5’ -AGCTTGCTCTTCCAA-3’ ； 所述的酶包括AMV逆转录酶和T7RNA聚合酶； 所述的酶缓冲液包括逆转录酶缓冲液、T7RNA酶缓冲液； B分试剂盒包含探针、缓冲液、胶体金核酸试剂条； 所述的探针包括探针1、2和3: 探针 1 为:5’ -巯基-GCTTGCTCTTCCAAAGTTAGTG-3’ ； 探针 2 为:5’ -TTTCGGCTATCGCTTACAGATG-生物素 _3’ ； 探针 3 为:5’ -生物素-CACTAACTTTGGAAGAGCAAGC-3’ ； 所述的缓冲液包括4X柠檬酸钠缓冲液、含体积浓度6%甲酰胺的4X柠檬酸钠缓冲液； 所述的胶体金核酸试剂条包含附着于底板上且依次搭接的样品板、金垫、硝酸纤维素膜和吸水板；金垫包埋有连接探针I的纳米金探针；硝酸纤维素膜上有含链霉亲和素和探针3的控制线和含链霉亲和素和探针2的检测线，检测线靠近金垫，控制线靠近吸水板。
全文摘要
本发明公开了一种基于NASBA的试纸条检测食源致病菌的方法及试剂盒，属于生物检测技术领域。该方法包括如下步骤(1)提取食源致病菌的RNA；(2)设计扩增引物；(3)进行NASBA反应；(4)设计捕捉探针；(5)制备纳米金探针；(6)制备胶体金核酸试纸条；(7)样品的检测。使用该方法检测单增李斯特菌的试剂盒包括引物(如SEQ ID NO.1和2所示)、酶、缓冲液、RNaseH、RNA酶抑制剂、dNTPs、NTPs、探针(如SEQ ID NO.4、5和6所示)和胶体金核酸试剂条等。本方法将NASBA与试纸条检测结合，可以实现定性或者定量检测，成本低，检测速度快，特异性好，灵敏度高，使用安全。
文档编号C12R1/19GK103146835SQ201310098339
公开日2013年6月12日 申请日期2013年3月25日 优先权日2013年3月25日
发明者邢达, 詹芳芳, 周小明 申请人:华南师范大学