专利名称：同时检测多种致病菌的检测用引物及检测方法
技术领域：
本发明涉及农副产品安全检测技术，具体涉及同时检测多种致病菌的引物及检测方法。
背景技术：
食品安全是公共卫生问题中最应重视的环节，据世界卫生组织报道全球每年发生食源性疾病的病例高达一亿例，全球每年约有170万儿童死于由食源性微生物污染引起的腹泻病，成年人的感染病例达到数十亿。研究发现，目前我国食品安全领域存在如下问题(1)微生物污染是影响我国食品安全的最主要因素。(2)在投入品供给，农业产地环境，防疫体系，农产品生产、加工以及销售等环节仍然存在安全隐患。(3)食品安全科技成果和技术储备不足。(4)食品安全标准体系、检验检测体系、认证认可体系等方面还存在明显的不适应性，食品安全管理体制和法律法规体系有待完善。(5)食物中毒和食源性疾病仍然对中国的食品安全构成了明显的威胁，重大食品安全事故屡有发生。为确保我国食品安全与食品贸易，必须大力加强食品检验的力度，在我国建立、健全食品安全法规，加强食品安全监控，提高检测技术，使我国相应的法规、标准与国际接轨，特别是食品快速检测技术达到国际先进水平。世界卫生组织将食源性疾病定义为，通过摄食进入人体的，使人体患感染性或中毒性的疾病。人类有60%的疾病都与动物疾病有关，近些年出现的新型疾病中，这一比例更是高达75%，在养殖业高度发达、人与动物多层面接触的今后，这一比例恐怕还会升高。常见的食源性致病菌包括沙门氏菌属、致病性大肠杆菌、葡萄球菌及毒素、变形杆菌属、副溶血性弧菌、李斯特菌、肉毒梭菌毒素、蜡样芽抱杆菌、韦氏梭菌、弯曲杆菌、酵米面椰毒假单胞杆菌、结肠炎耶尔森氏菌、链球菌及志贺氏菌属等。以上所述的致病菌目前还没有一套可以同时检测其是否存在的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的上述不足，提供一套可同时检测多种致病菌的检测用引物。本发明的另一目的是提供根据上述检测引物设计的一种检测方法。本发明通过以下技术方案实现上述目的
在各种食物中毒中，细菌性食物中毒是食物中毒的主要因素。本发明针对在我国食物中毒中最常见的致病菌，研究出一种食物中毒诊断及食品检测的有效方法。根据GB4789.1食品卫生微生物学检验总则和GB4789. 17肉与肉制品检验中的相关要求以及结合我国目前食源性致病菌的发生发展情况，选取以下六种细菌作为检测对象鼠伤寒沙门氏菌，甲型副伤寒沙门氏菌，单核细胞增生李斯特氏菌，副溶血性弧菌，福氏志贺氏菌，非01群霍乱弧菌，首先筛选出检测上述各致病菌的PCR引物。同时检测多种致病菌的检测用引物，核苷酸序列如下、invA 引物对SEQ ID NO: 1^2 (JnvA-up，down)；
力7ァ引物对SEQ ID NO:3^4 ihly-up, down)；iiorT 引物对SEQ ID NO:5 6 (toxR-up, down);
引物对SEQ ID NO:7^8 iipaH-up, down)；vcc 引物对SEQ ID NO:9 10 (vcc~up, down);
以上任何两对以上引物组合,可以检测该弓I物对所对应的致病菌；
其中i/ W引物对用于检测鼠伤寒沙门氏菌{Salmonella typhimurium)和甲 型副伤寒沙门氏菌{Salmonella para typhi ), hly引物对用于检测单核细胞增生李斯特氏菌iListeria monocytogenes), toxR引物对用于检测副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus ), 引物对用于检测福氏志贺氏菌flexneri ), rcc 引物对用于检测非ft/群霍乱弧菌(Cholerae non- 01、。以上引物是通过Blast、MegAlign和DNAStar程序筛选出的沙门氏菌inv基因簇保守序列(GenBank: FR775234. 2)，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか保守序列(GenBank: NC_012488. 2)，副溶血性弧菌toxR基因保守序列(GenBank: L11929. 2)，福氏志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因ipaH7保守序列(GenBank: NC_004337. I),非01群霍乱弧菌Fee基因保守序列(GenBank:7)作为模板,用Primer Explorer V5软件设计所得。本发明靶基因的选择原则有ニ 选择毒力基因，选择位于细菌基因组的基因。因为各种致病菌与其同属的非致病型在生化反应上没有区别，属间基因组的同源性也很高，但与致病性相关的毒力基因特异性高。而在食品检测上只有检测出毒力才能认定为致病菌，所以选择毒力基因为靶基因。细菌属于原核生物，其遗传物物质有基因组和质粒两类，很多毒力基因位于质粒上。但质粒不稳定，可能在细菌间转移，也容易在传代培养中丢失。质粒DNA与基因组DNA的大小相差很大，不能用同样方法提取。所以选择位于细菌基因组上的毒力基因为靶基因。由于要在同一个PCR管体系中同时进行至少两个目的基因的扩增，引物设计比较复杂，且对引物扩增区的特异性要求较高。所以引物设计没有普通引物设计简单，要设计出优良的引物，需要在各种生物信息软件评估的基础上进行费时的筛选。由于所设计的引物具有高度的选择特异性，在进行病原检测时，要求引物所针对的靶序列位点应该相当保守，这样所建立的方法才具有适用性。研究中也可以设计一些简并引物以增强其应用的广泛性，但简并度高的引物会对扩增反应造成负面影响。对于ー些具有GC含量高、变异性强、弓丨物ニ聚体等特点的目的序列，没有办法设计出非常适用的引物，使多重检测技术的应用受到限制。由于所设计的引物要在下一步进行多重PCR反应，因此在设计引物时要将各基因对应的序列一同进行比对分析。除了遵循引物设计的一般原则，引物对内部和引物对之间也要尽量使Tm值相近，确保能在同一条件下均获得较好的扩增；各对引物内部和引物对之间不能互补，尤其避免3’端的互补，以减少引物ニ聚体的形成；各引物与其他扩增片段和模板有较好的特异性；扩增产物片段的大小要有差异，确保能够用琼脂糖凝胶电泳方法区分开。设计好的引物序列提交到NCBI网站进行BLAST分析，用以验证引物的理论特异性。
本发明要保护的另一技术方案是一种同时检测多种致病菌的检测方法，该方法使用上面任意两对以上检测用引物对，以待检样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳结果出现以下条带，表明待检样品中存在相应的致病菌 214bp :副溶血性弧菌；
394bp :福氏志贺氏菌；
490bp :非01群霍乱弧菌；
568bp :鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌；
797bp :单核细胞增生李斯特氏菌。本发明还保护一种同时检测两种致病菌的双重PCR反应体系，该反应体系为25ML，其中2XPCRmix 12. 5uL, 10umol/L的上、下游引物各0. 4ML，待检测样品DNA模板I. Oii L，超纯水补足25ML ;所述上、下游引物为SEQ ID NO: TlO中任意两种检测用引物对中的上、下游引物，如果选择引物对和/或引物对，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌为所选用引物对所对应能检测的致病菌。上述的双重PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为56°C退火30s，72°C延伸45s，共28个循环。当检测的致病菌种类增加时，上述PCR反应体系的总体积及组分也有相应变动，作为一种能检测三种以上致病菌的PCR体系优选方案，这种同时检测多种致病菌的多重PCR反应体系为50ML，其中2XPCRmix 12. 5 u L, 10 u mol/L的上、下游引物各0. 4ML，待检测样品DNA模板I. 0 ii L，超纯水补足50ML ;所述上、下游引物为SEQ ID NO: TlO中任意三种以上检测用引物对中的上、下游引物，如果选择引物对和/或引物对，其上、下游引物需各加IML ;所述致病菌为所选引物对所对应能检测的致病菌。上述的多重PCR反应体系的扩增方法，扩增条件为56°C退火30s，72°C延伸45s，共28个循环。多重PCR体系中增加了引物和模板，影响反应的因素增多，互相之间增加了干扰。因此增加了设计引物的难度。除此之外体系中各成分的量和循环参数也需在实验中做适当调整，以减少非特异性扩增的影响，平衡各产物的量，获得清晰的各段电泳条带。实际检测中模板的量是不能确定的，因此引物的浓度和其他成分要保证充分供给，也不能过量，这对检测结果有直接影响。因此在体系中重点调整的是引物的浓度。本发明的同时检测多种致病菌的检测用引物特异性强，可用于制备农副产品尤其是水产品致病菌的检测试剂。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
(I)本发明筛选出了多种特异性强的致病菌PCR扩增引物，建立了一种同时检测多种致病菌的多重PCR方法，为快速、高效检测农副产品中多种致病菌提供了一种简便快速的方法。(2)本发明的 5 对弓丨物 invA-up，down, hly~up, down, toxR-up，down,ipaH-up, down，vcc-up，down只引起相应祀基因的特异性扩增,无任何非特异性扩增，显示了良好的特异性，在实践中能够避免假阳性结果的出现。(3)本发明的检测方法扩增反应快速、高效、简便，整个扩增在不到2小时即可完成。
(4)本发明的5对引物在六种细菌单重PCR检测中灵敏度都在103cfu/mL 104cfu/mL,显示了高灵敏度。(5)能够同时检测多种致病性细菌通过对六种致病菌的特异基因片段的选择，通过ー个多重PCR体系的建立和调试，成功同时扩增出了六种菌，并且六种菌随机组合的扩增也成功，未出现相互间强抑制现象。
图I.鼠伤寒沙门氏菌DNA为模板的引物i/o#/ 退火温度梯度 实验结果电泳结果图，注=Tio道从左起分别为退火温度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55.8，56. 9，58. 1，59. I。图2.甲型副伤寒沙门氏菌DNA为模板的引物invA-即，down退火温度梯度实验结果电泳结果图，注10道从左起分别为退火温度(°C): 50，50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. 1，59. I。图3.引物Aか-or i/o#/ 退火温度梯度实验结果电泳结果图，注f 10道从左起分别为退火温度(°C) 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I, 59. 7。图4. 3\嫩toxR-up, down退火温度梯度实验结果电泳结果图，注f 10道从左起分别为退火温度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。图5.引物退火温度梯度实验结果电泳结果图,注]Λ10道从左起分别为退火温度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。图6.引物退火温度梯度实验结果电泳结果图，注]Λ10道从左起分别为退火温度(°C) 50, 50. 5，51. 2，52. I, 53. 5，54. 7，55. 8，56. 9，58. I, 59. I。图7.引物invA-up，down对几种菌的扩增电泳结果图,注1为阴性对照，2 7道分别为不同菌株基因组模板2.鼠伤寒沙门氏菌，3.甲型副伤寒沙门氏菌，4.单核细胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志贺氏菌，7.非Ol群霍乱弧菌。图8.引物i/o#/ 对六种菌的扩增电泳结果图，注I为阴性对照，2 7道分别为不同菌株基因组模板2.甲型副伤寒沙门氏菌，3.鼠伤寒沙门氏菌，4.单核细胞增生李斯特氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志贺氏菌，7.非Ol群霍乱弧菌。图9.引嫩hly-up, down对六种菌的扩增电泳结果图，注I为阴性对照，cT 道分别为不同菌株基因组模板2.单核细胞增生李斯特氏菌，3.鼠伤寒沙门氏菌，4.甲型副伤寒沙门氏菌，5.副溶血性弧菌，6.福氏志贺氏菌，7.非Ol群霍乱弧菌。图10.引物ioi-UR i/o#/ 对六种菌的扩增电泳图，注I为阴性对照，2 7道分别为不同菌株基因组模板2.副溶血性弧菌，3.鼠伤寒沙门氏菌，4.甲型副伤寒沙门氏菌，5.单核细胞增生李斯特氏菌，6.福氏志贺氏菌，7.非02群霍乱弧菌。图11.引物ipaH-up’ down对六种菌的扩增电泳图，注I为阴性对照，2 7道分别为不同菌株基因组模板2.福氏志贺氏菌，3.鼠伤寒沙门氏菌，4.甲型副伤寒沙门氏菌，5.单核细胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.非02群霍乱弧菌。图12.引物ゐ_对六种菌的扩增，注I为阴性对照，2 7道分别为不同菌株基因组模板2.非01群霍乱弧菌，3.鼠伤寒沙门氏菌，4.甲型副伤寒沙门氏菌，5.单核细胞增生李斯特氏菌，6.副溶血性弧菌，7.福氏志贺氏菌。
图13.鼠伤寒沙门氏菌灵敏度检测结果，f 8道分别为108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^图14.甲型副伤寒沙门氏菌灵敏度检测结果，f 8道分别为108、107、106、105、104、IO3UO2UO1CfuM^图15.单核细胞增生李斯特氏菌灵敏度检测结果，广8道分别为108、107、106、105、IO4UO3UO2UO1Cfu/!!!!^图16.副溶血性弧菌灵敏度检测结果，1 8道分别为108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^图17.福氏志贺氏菌灵敏度检测结果，f 8道分别为108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^图18.非01群霍乱弧菌灵敏度检测结果，广8道分别为108、107、106、105、104、103、IO2UO1CfuM^图19. 二重PCR电泳检测结果，1,2扩增和基因，3,4扩增和基因，5，6扩增invA和基因，7，8扩增invA和rcc基因。图20. 二重PCR电泳检测结果，I，2扩增in W和基因，3，4扩增invA和toxR基因，5，6扩增invA和基因，7，8扩增invA和rcc基因。图21. 二重PCR电泳检测结果，I，2扩增hly和toxR基因，3，4扩增hly和ipaH基因，5，6扩增hly和Mc基因。图22. 二重PCR电泳检测结果，I, 2扩增toxR和基因，3，4扩增toxR和wc基因，5，6扩增ipaHM MC基因。图23. 二重PCR电泳检测结果，I扩增in vA和toxR基因，2扩增in vA和ipaH基因，3扩增invA和MC基因，4扩增hly和toxR基因，5扩增hly和toxR基因，6扩增hly和toxR基因。图24. 二重PCR电泳检测结果，I扩增in vA和toxR基因，2扩增in vA和ipaH基因，3扩增invA和MC基因，4扩增hly和toxR基因，5扩增hly和toxR基因，6扩增hly和toxR基因。图25.三重PCR电泳检测结果，I，2扩增in vA、ipaH和wc基因，3，4扩增in vA、vcc 和 toxR 基因，5，6 扩增 invA、toxR 和基因，7, 8 扩增 invA、hly 和 vcc 基因，9，10扩增 invA、ipaHM 基因，11，12 扩增 invA、hly 和 toxR 基因。图26.三重PCR电泳检测结果，I, 2扩增invA、hly和toxR基因，3，4扩增invA、 和 hly 基因，5，6 扩增 invA、hly 和 vcc 基因，7，8 扩增 invA、toxR 和基因，9, 10
扩增 invA、vcc 和 tiorT 基因，11，12 扩增 invA、和 vcc 基因。图27.三重PCR电泳检测结果，I, 2扩增A7_f、ipaHM 基因，3，4扩增从F、toxR 和 vcc 基因，5，6 扩增 hly.、和 vcc 基因，7，8 扩增 fcc、toxR 和基因。图28.四重PCR电泳检测结果，I，2扩增in vA、hly、ipaH和toxR基因，3，4扩增hly、toxR.、和 vcc 基因。图29.四重PCR电泳检测结果，1,2,3扩增hly、toxR、ipaHM vcc基因。图30.五重PCR电泳检测结果，I, 2, 3, 4扩增invA、hly、toxR、ipaH和vcc基因。图31.五重PCR电泳检测结果，I, 2, 3,扩增invA、hly、toxR、ipaH取vcc基因。、
图32.五重 PCR 电泳检测结果，I, 2, 3, 4, 5, 6 扩增 invA.、hly.、toxR、ipaH和 rcc基因，1，2扩增invA、hly基因引物量为toxR、か成和基因2倍，3，4扩增invA、hly基因引物量为toxR、ipaim vcc基因3倍，5，6扩增invA、hly基因引物和模板量均为toxR、
和vcc基因2倍。
具体实施例方式以下实施例中如无特殊说明，均为本领域常规实验试剂和常规操作步骤。实施例I五种致病菌检测引物的设计与筛选
I.I实验材料
主要工具酶类、生化试剂及试剂盒
LB肉汤、各种生化管、李氏增菌液等试剂购自广州环凯生物试剂有限公司。Taq DNA聚合酶(Fermentas)，溶菌酶，细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)，普通琼脂糖凝胶，DNA回收试剂盒(天根)，PGM-T19连接含试剂盒(含载体，连接酶)购自广州市宝泰克生物科技有限公司，质粒DNA小量提取试剂盒(天根)，EB替代染料(北京普利菜)；Tip和Tip盒、离心管、玻璃试管、平皿、三角瓶等耗材购自广州市韵荟试验仪器公司；其他试剂均为分析纯常规试剂。LB固体培养基在LB肉汤基础上加入比例为15g L_1的琼脂粉，混匀煮沸熔化灭菌。营养肉汤NB培养基(IL):牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，ρΗ7· 4。实验菌株来源及编号见表I 表I实验菌株及来源
菌种名称菌种编号来源
,SHSf —黄埔出入境检验捡顧
CMCC_15黄埔出入境检验检顧
!SI=S 置哪湖翻出入境检验检顧
歷mm龍出入境麵检顧
(01)■卿厕黄埔出入境检验纖
——画禅皿_黄埔出入境检验薩_
感受态细蟲 菌E-COH华献业大学动物糇学院家禽·究室
1.2引物设计
PCR扩增菌特异靶基因的选用沙门氏菌inv基因簇-编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白基因W，单核细胞增生李斯特氏菌的溶血素O基因Aか，副溶血性弧菌ioi基因，福氏志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因iPaH7,非01群霍乱弧菌基因。
于NCBI网站检索相应基因序列,用Primer premier 5.0软件设计多重引物，详见表2。引物由北京奥科生物工程技术有限公司合成，合成后的引物用超纯水稀释成10mmol/mL溶液，-20 °C保存。引物序列如下
表2引物及相关信息
权利要求
1.同时检测多种水产品致病菌的引物，其特征在于核苷酸序列如下 invA 引物对SEQ ID NO: I 2 ； hly 引物对SEQ ID NO:3 4 ； ioi 引物对SEQ ID NO: 5^6 ； 引物对SEQ ID NO :7 8 ； vcc 引物对SEQ ID NO :9 10 ； 以上任何两对以上引物组合,可以检测该弓I物对所对应的致病菌； 其中invA引物对用于检测鼠伤寒沙门氏菌和/或甲型副伤寒沙门氏菌引物对用于检测单核细胞增生李斯特氏菌，引物对用于检测副溶血性弧菌，引物对用于检测福氏志贺氏菌，KCC引物对用于检测非见群霍乱弧菌。
2.一种同时检测多种水产品致病菌的检测方法，其特征在于使用权利要求I所述的任何两对以上检测用引物对，以待检样品中提取的DNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳结果出现以下条带，表明待检样品中存在相应的致病菌 . 214bp :副溶血性弧菌； .394bp :福氏志贺氏菌； .490bp :非01群霍乱弧菌； .568bp :鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌； .797bp :单核细胞增生李斯特氏菌。
3.一种同时检测两种致病菌的双重PCR反应体系，其特征在于反应体系为25μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待检测样品DNA模板I. O μ L，超纯水补足25μ ； 所述上、下游引物为权利要求I所述的任意两种检测用引物对中的上、下游引物，如果选择引物对和/ WLhly引物对，其上、下游引物需各加WL ； 所述致病菌为选择的权利要求I所述引物对所对应能检测的致病菌。
4.权利要求3所述同时检测两种致病菌的双重PCR反应体系的扩增方法，其特征在于扩增条件为56°C退火30s，72°C延伸45s，共28个循环。
5.一种同时检测多种致病菌的多重PCR反应体系，其特征在于反应体系为50μ ，其中.2 XPCRmix 12. 5μ L，10 μ mol/L的上、下游引物各O. 4μ ，待检测样品DNA模板I. O μ L，超纯水补足50μ ； 所述上、下游引物为权利要求I所述的任意三种以上检测用引物对中的上、下游引物，如果选择引物对和/或hly引物对，其上、下游引物需各加WL ;所述致病菌为选择的权利要求I所述引物对所对应能检测的致病菌。
6.权利要求5所述同时检测多种致病菌的多重PCR反应体系的扩增方法，其特征在于扩增条件为56°C退火30s，72°C延伸45s，共28个循环。
7.权利要求I所述同时检测多种致病菌的引物在制备农副产品致病菌检测试剂中的应用。
全文摘要
本发明公开了同时检测多种致病菌的检测用引物及检测方法。所述引物的核苷酸序列为invA引物对，用于检测鼠伤寒沙门氏菌和甲型副伤寒沙门氏菌；hly引物对，用于检测单核细胞增生李斯特氏菌；toxR引物对，用于检测副溶血性弧菌；ipaH引物对，用于检测福氏志贺氏菌；以及vcc引物对，用于检测非O1群霍乱弧菌。本发明同时公开了一种利用上述各引物对建立的多重PCR扩增体系，使用这一体系可快速准确地检测出待检样品中是否有相应致病菌，整个检测过程用时不到2小时，简单方便，且每对引物特异性都很高，不会出现假阳性结果，可以做成试剂盒等，在农副产品致病菌检测中非常适用。
文档编号C12N15/11GK102634580SQ20121009654
公开日2012年8月15日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者吕英姿, 孙宝丽, 张凌俊, 毕英佐, 谢青梅 申请人:华南农业大学