专利名称：一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法，具体是一株高效利用葡萄糖生长并产丁二酸重组菌株及其利用该菌株发酵生产丁二酸的方法。
背景技术：
丁二酸(又称琥珀酸)作为一种C4平台化合物，不仅被广泛应用于医药、农药、 染料、香料、油漆、食品和塑料等行业，还可用于合成1，4-丁二醇、四氢呋喃、Y-丁内酯等有机化学品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBS)类生物可降解材料，被美国能源部认为是未来12 种最有价值的生物炼制产品之一。目前工业应用的丁二酸主要采用化学方法生产，污染大、 成本高，制约了丁二酸作为大宗化学品的发展潜力。利用微生物发酵法转化可再生资源生产琥珀酸、价格低廉、污染小，且在发酵过程中可吸收固定CO2，开辟了温室气体利用的新途径，工艺过程具有绿色、能耗低、原子经济性高的优点，近年来成为研究的热点。丁二的生产菌株很多，目前主要集中在Anaerobiospirillum succiniciproducens、ActinobaciIlus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens 和重组疋coli I。利用野生菌株生产丁二酸虽然获得了较高的产物浓度，但培养过程培养基成本较高，且甲酸、乙酸等副产物积累较多，阻碍了其工业化进程。大肠杆菌由于对营养条件需求简单，并具有生长迅速、遗传背景清楚、易调控、易改造等特点，因此利用基因工程手段改造大肠杆菌生产丁二酸备受关注。现有的产丁二酸大肠杆菌基因改造策略主要有增强代谢途径中的关键酶(如 PPC、PCK)、失活或敲除竞争途径中的酶(如LDH、PFL)、引入新的代谢途径(如乙醛酸循环) 等。其中，疋coli NZNlll由于同时失活了丙酮酸甲酸裂解酶与乳酸脱氢酶，丙酮酸的代谢支路大大减少，丙酮酸大量积累，最终导致厌氧条件下菌株不能利用葡萄糖。其自发突变株疋coli AFPlll由于突变了葡萄糖专性转运系统中的基因，菌株使用葡萄糖激酶系统进行葡萄糖的转运，使丙酮酸的积累不再是糖转运的限制因素，恢复了菌株在厌氧条件下利用葡萄糖的能力，且产物主要为丁二酸，在有氧厌氧两阶段发酵培养AFPlll过程中，丁二酸质量收率达到96%，生产强度为1.21因此，在高产丁二酸大肠杆菌菌株构建过程中，减少丙酮酸的积累是重组大肠杆菌高产丁二酸的关键因素之一。Stols等通过测定的苹果酸酶对苹果酸的Km值,认为苹果酸酶在特定的菌种中有可能催化从丙酮酸到苹果酸的逆向反应，原因是该反应方向在热力学上是有利的。在 E. coli双突变株NZNlll中超量表达Ascaris suum中的苹果酸酶基因sfcA后，使苹果酸酶逆向催化生成苹果酸，减少了丙酮酸的大量积累，并以琥珀酸作为最终还原产物而大量积累。同时，Wang等人构建了万.NZNlll/pTrc99a_麗*菌株，过量表达苹果酸脱氢酶基因ijndh、后，能使疋coli NZNlll在厌氧条件下利用葡萄糖，丁二酸产量增加了 5倍多， 并且大大降低了丙酮酸的积累。Hui Wu和Zhi-min Li等人利用NZNlll进行两阶段发酵， 结果发现MDH和ICL的酶活大大提高，使丙酮酸的量大大减少，流向乙醛酸循环，从而使丁二酸的产量大幅度提高。Vemuri等人将Λ etli中的/77c基因引入NZNlll中，结果丙酮酸减少了 3倍，丁二酸产量增加了 52%。岳方方等人在JM1307中过量表达枯草芽孢杆菌中的 Pyc基因，结果丁二酸的产量增加了 I. 9倍，同时丙酮酸的量也有所减少。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种能高效利用葡萄糖生长并产丁二酸的基因工程菌株及其构建方法，并利用该菌株厌氧发酵生产丁二酸，达到菌株的构建方法简单方便，构建得到的菌株发酵方法简单可行，易于工业化，产酸能力强的目的，从而大大降低生产成本， 提闻经济效益。为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案。一、本发明提供的一株产丁二酸基因工程菌菌株，其分类命名为大肠埃希氏菌 (.Escherichia co7i ) BA103，其保藏号登记号为 CCTCC NO M 2012032。二、本发明所述的大肠埃希氏菌BA103的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株，利用同源重组技术敲除基因(Glucose phophotransferase Enzyme IIBC (Glc))后，再过量表达丙酮酸羧化酶(PYC)，得到能够利用葡萄糖产丁二酸的大肠埃希氏菌BA103。本发明所述的重组菌株BA103的代谢途径如图I所示。进一步地,所述的具体构建步骤如下
(1)以缺乏乳酸脱氢酶基因(A/M)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7沒)活性的疋CWi NZNlll菌株为出发菌株，敲除其中的葡萄糖专性转运系统中的基因，得到同时缺乏 IdhA ,pflB和ptsG的感受态菌株；
(2)合成一对5’端带有酶切位点的引物，以ZaciococciAslactis subsp. cremoris NZ9000基因组DNA为模板，纯化扩增出的基因后，表达质粒pTrc99a用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/ _Fc ；
(3)将步骤(2)所述的重组质粒pTrc99a-/7_Fc导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；
(4)利用步骤(3)的阳性转化子表达丙酮酸羧化酶(PYC)，得到可高效利用葡萄糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌BA103。三、利用本发明所述的大肠埃希氏菌BA103发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。进一步地，具体步骤如下将大肠埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体0D_至0. 4 0. 6用0. 5 mM的IPTG诱导至 0D_=3时，按3倍菌泥接种量转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。其中所述的有氧阶段发酵培养基是现有技术中有氧培养产丁二酸大肠杆菌的常规培养基；所述的厌氧阶段发酵培养基是以葡萄糖为碳源的产丁二酸大肠杆菌用发酵培养基。本发明的有益效果在于本发明以缺乏乳酸脱氢酶(LDH)基因，丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性的菌株大肠杆菌NZNlll为出发菌株，利用同源重组技术敲除葡萄糖专性转运系统中的基因，并表达Zaclactis subsp. cremoris NZ9000 中的/77c基因，通过两阶段发酵，得到了高效利用葡萄糖产丁二酸的优良菌株疋coli BA103。
图I本发明所述的重组菌株BA103的两阶段代谢途径；
其中，黑色粗线方块处表示敲除失活的酶；虚线部分表示新构建的途径。图2线性DNA片段的电泳鉴定图。图3同源重组阳性重组子的电泳鉴定图。图4重组质粒pTrc99a-/ _FC的构建图谱。图5 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳鉴定图。图6重组质粒pTrc99a-/ _FC的单酶切鉴定图。本发明的微生物分类命名为大肠埃希氏菌co7i ) BA103,其保藏日期为2012年2月23日，保藏单位全称为中国典型培养物保藏中心，简称为CCTCC，保藏地址是中国·武汉·武汉大学；保藏编号CCTCC NO M 2012032。
具体实施例方式下面的实施例对本发明作详细说明，但对本发明没有限制。本发明的生物材料的来源的说明
I、质粒来源
本发明所述的表达质粒用pTrc99a的来源是购自Introvegen公司。本发明所述的氯霉素抗性基因的来源是pKD3,购自Introvegen公司。本发明所述的能够诱导表达λ重组酶的质粒的来源是pKD46,购自Introvegen 公司。本发明所述的能够诱导产生FLP重组酶的质粒的来源是pCP20,购自Introvegen 公司。2、基因组模板来源
Lactococcus lactis cremoris NZ9000,购自中国微生物菌种网(www. mum800. com)。3、出发菌株'E. coli NZNlll的感受态菌株的来源有两处
(1)Biotechnol Bioeng, 2001，74:89 95。申请人首先通过查阅到该生物材料的上述文献出处，并联系了发表人系美国芝加哥大学的David P. Clark教授，并邮件请求其赠与该生物材料，并免费获得了该生物材料；且申请人保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料；
(2)该生物材料还在中国专利(申请号96198547.X，申请日1996. 10. 31，授权曰2003年 I月I日，授权公告号CN1097632C)的专利文献中公开并获得授权。4、引物的设计及合成自行设计并外包金斯瑞生物技术公司合成。实施例I
本实施例说明利用同源重组技术敲除出发菌株NZNlll中葡萄糖专性转运系统中的基因，得到消除氯霉素抗性菌株的过程。I、利用LB培养基，于37°C、有氧条件下培养大肠杆菌NZNlll至OD6tltl=O. 4 O. 6， 制备成电转感受态。
2、将质粒pKD46电转入感受态的大肠杆菌NZNlll。电击条件为200 Ω，25 μ F， 电击电压2. 3 kV，电击时间4 5 ms ο电击后迅速将菌体加入预冷I mL的SOC培养基，150 r/min、30°C培养I h之后涂布于带氨苄青霉素(amp)的LB培养基平板筛选出阳性转化子大肠杆菌 NZNlll (pKD46)。3、在LB培养基中加入10 mM的L-阿拉伯糖，于30°C下诱导质粒pKD46表达出λ
重组酶，制成电转感受态。4、以两侧带有FRT位点的氯霉素抗性基因为模板，利用高保真PCR扩增系统，以质粒PKD3为模板，并设计两端带有同源片段的扩增引物，扩增出线性DNA同源片段，引物序列如下
上游带同源臂引物H1-P1，下划线为同源片段
5’ -ATCGCAGCGTACATGTTTAACCGTTTCTACCGTATTAAGCTGCCTGAGTATCGTGTAGGCTGGAGCTGCT TC-3，。下游带同源臂引物H2-P2，下划线为同源片段
5， -TTCGCTGGTACCTGTCGCTTTTGCATCTTCAGTCGCGTCTTCACGACCCGGCATGGGAATTAGCCATGGT CC-3，。反应体系带同源臂的上下游引物(100 11101/^1^各0.5 yL;模板DNA(100 ng/ μ L) O. 5 μ L ； 10 X buffer 5 μ L ；dNTPs (10 mM)各 I μ L ;DMS0 (100%) 2.5 μ L ； Pyrobest DNA 聚合酶(2· 5 U/ μ L) I μ L ；ddH20 36/35. 5 μ L ;总体积 50 μ L。反应条件94°C，2min ； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;10 个循环)； (94°C 45 sec ；50°C 45 sec ；72°C 90 sec;15 个循环)；72°C，5 min。线性DNA片段的鉴定如图2。5、电转线性DNA片段至已诱导表达λ重组酶的大肠杆菌NZNlll(pKD46)感受态， 并涂布于带安普霉素的LB平板筛选出阳性重组子，并进行了 PCR鉴定，电泳图如图3所示。6、阳性重组子制成感受态后倒入能诱导表达FLP重组酶的质粒pCP20，于42°C热激表达FLP重组酶后即可消除氯霉素抗性。利用一对平板，进行平行点样，能够在无抗性平板上生长，但不能在抗性平板上生长的均极为已经敲除抗性的菌株。实施例2
本实施例说明构建表达外源丙酮酸羧化激酶的表达质粒，得到菌株coli BA103，如图4所示的原理构建。I、构建pTrc99auc质粒,其过程包括
(I)合成带有AfcoI和AiI酶切位点的引物，
上游引物5’ - CATGCCATGGTCAGCTGATGAGAAACGTCGAGAAG -3’ ；
下游引物5’ _ AAAACTGCAGGGTCATCTCTTCAAAGCCAAAACGA-3’。Lactococcus lactis cremoris NZ9000基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因片段，反应条件为94°C，5 min ； (94°C 45 s，53°C 45 s，72°C 300 s, 35个循环)；72°C， 10 min。纯化扩增出的/7_^基因后，表达质粒用？1'1^99&分别用价01和/ >^1双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/7_Fc。PCR扩增得到的产物片段如图5琼脂糖凝胶电泳鉴定图所示。使用单酶切重组质粒pTrc99a-/ _Fc,得到8185bp的片段,结果见图6,酶切结果表明重组质粒pTrc99a-/ _Fc构建成功。
2、将质粒pTrc99auc导入同时缺乏的感受态菌株,获得的阳性转化子即为本发明的新构建菌株coli BA103。实施例3
本实施例说明在大肠杆菌NZNlll中敲除葡萄糖专性转运系统中的基因并导入质粒pTrc99a-/7_Fc后，能够高效利用葡萄糖，同时主要的产物是丁二酸，无甲酸和乳酸的积累，而且大幅度地减少了副产物丙酮酸的生成。将大肠埃希氏菌BA103按1%(ν/ν)接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体OD6tltl至O. 4 O. 6用O. 5 mM的IPTG诱导至0D6(I(I=3时，按3倍菌泥接种量转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵48h。有氧阶段培养基为LB+ Amp +Chl+Kna (氨节青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/ mL) ο厌氧血清瓶发酵用培养基为LB+葡萄糖(20g/L) +碱式碳酸镁0.48g + Amp +Chl+Kna(氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素各50 μ g/mL) +0. 5mM IPTG。厌氧血清瓶培养后各种参数的测定结果见表I。
权利要求
1.一株产丁二酸基因工程菌菌株,其分类命名为大肠埃希氏菌coli) BA103，其保藏编号为 CCTCC NO M 2012032。
2.权利要求I所述的产丁二酸基因工程菌菌株大肠埃希氏菌BA103的构建方法，其特征在于以缺乏乳酸脱氢酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的菌株大肠杆菌为出发菌株， 利用同源重组技术敲除基因后，再过量表达丙酮酸羧化酶，得到能够利用葡萄糖产丁二酸的大肠埃希氏菌BA103。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于具体包括以下步骤Cl)以缺乏基因，/7/7沒基因活性的菌株为出发菌株，敲除其中的葡萄糖专性转运系统中的基因，得到同时缺乏IdhA ,pflB和ptsG的感受态菌株；(2)合成一对5’端带有酶切位点的引物，纯化扩增出的基因后，表达质粒pTrc99a 用与引物所设计的酶切位点一致的酶双酶切、连接获得重组质粒pTrc99a-/ _Fc ；(3)将步骤(2)所述的重组质粒pTrc99a-/7_Fc导入步骤(I)得到的感受态菌株，获得阳性转化子；(4)利用步骤(3)的阳性转化子表达丙酮酸羧化酶，得到可利用葡萄糖代谢产丁二酸基因工程菌大肠埃希氏菌BA103。
4.利用权利要求I所述的大肠埃希氏菌BA103发酵生产丁二酸的方法，其特征在于采用两阶段发酵方式，有氧阶段提高生物量，厌氧阶段发酵产酸。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于具体步骤是将大肠埃希氏菌BA103按体积比1%接种量接种入有氧阶段发酵培养基中有氧培养，当有氧培养菌体0D_至O. 4 O. 6 用O. 5 mM的IPTG诱导至0D_=3时，按3倍菌泥接种量转接至厌氧阶段发酵培养基中厌氧发酵。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，涉及一株产丁二酸基因工程菌及其发酵生产丁二酸的方法。具体是高效利用葡萄糖产丁二酸基因工程菌株EscherichiacoliBA103菌株及其构建方法及其产丁二酸的方法。通过表达外源丙酮酸羧化酶，使重组大肠杆菌能够利用葡萄糖代谢生长，大幅度提高丁二酸的得率及生产强度，减少副产物丙酮酸的生成。
文档编号C12N1/21GK102604880SQ20121009671
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月5日 优先权日2012年4月5日
发明者刘嵘明, 姜岷, 张常青, 梁丽亚, 苟冬梅, 陈可泉, 韦萍, 马江锋 申请人:南京工业大学