专利名称：一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法
技术领域：
本发明属于污染土壤遗传毒性检测技术领域，特别涉及一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法。
背景技术：
遗传毒性指化学物对生物体遗传物质损伤造成的毒性，并可能由此引起肿瘤、突变或畸形(参考文献I、印木泉.遗传毒理学.北京科学出版社，2002.)。与普通的化学毒性相比，遗传毒性作用缓慢，因此其危害可能在短时间内被忽视而引起更严重的问题，而遗传毒性检测的难度也相应更大。当待测样品以土壤为介质时，通常有原位和异位两种检测方法。原位检测指直接检测土壤介质中的污染物的毒性；异位检测指将土壤介质中的污染物提取至液相，通过间接检测液相中的毒性以表征土壤样品毒性(参考文献2、Plaza G, Nalecz-Jawecki G，Ulfig K，et al. Assessment of genotoxic activity of petroleum hydrocarbon-bioremediated soil. Ecotoxicology and Environmental Safety,2005， 62(3) :415-420.)。在科学研究和工程应用中较常见的土壤遗传毒性原位检测方法，包括蚯蚓的彗星试验(参考文献3、Xiao R YiWang Z JiWang C X, et al. Genotoxic risk identification of soil contamination at a major industrialized city in northeast China by a combination of in vitro and in vivo bioassays. Environmental Science &Technology, 2006,40 (19) :6170-6175. ;4、Zhu J，Zhao Z Y，Lu Y T. Evaluation of genotoxicity of combined soil pollution by cadmium and phenanthrene on earthworm. Journal of Environmental Sciences-China，2006，18 (6) : 1210-1215.)、 植物种子发芽试验(参考文献5、李彬，李培军，王晶，等.污染土壤毒性研究方法进展.环境污染治理技术与设备，2003，4 (5) :42-46. ;6、Baek K H，Kim H S，Oh H M，et al.Effects of crude oil， oil components， and bioremediation on plant growth. Journal of Environmental Science and Health Part a-Toxic/Hazardous Substances &Environmental Engineering，2004，39 (9) :2465-2472.)、土壤微型动物繁殖情况(参考 文献7、Patterson C J，Semple K T，Paton G I. Non-exhaustive extraction techniques (NEETs) for the prediction of naphthalene mineralisation in soil. Fems Microbiology Letters，2004，241 (2) :215-220.)等，但上述方法存在试验周期长、操作复杂、灵敏度低、成本较高等缺陷，不适用于大量样品快速灵敏的检测。常见的土壤异位检测方法，包括动物的生理生态监测、动物细胞彗星试验、AMES 细菌回复突变试验、生物传感细胞检测等。然而土壤样品异位毒性检测方法具有以下严重不足在毒性检测过程中引入了污染物萃取和固液分离的环节，增加了测试的不确定性以及测试的所需的时间和经济成本；经过萃取的样品不能代表污染物在土壤中的真实赋存状态，从而导致高估或低估样品的毒性；忽视了污染物在土壤介质中的生物有效性等对遗传毒性的重要影响(参考文献8、Frische T. Ecotoxicological evaluation of in situ bioremediation of soils contaminated by the explosive 2，4， 6-trinitrotoluene(TNT) · Environmental Pollution，2003，121 (I) :103-113.)。上述遗传毒性检测方法中，生物传感细胞在几小时内即对遗传毒物作出灵敏响应，是一种快速灵敏的遗传毒性检测方法。生物传感细胞对遗传毒性检测的原理是在细菌中构建一个启动基因和报道基因的融合体系，报告基因处于一个启动基因的下游，受启动基因的启动子控制。启动基因为诱导型表达基因，并且只在造成DNA损伤的毒性物质或辐射等外界压力存在下诱导表达。当启动基因受遗传毒物诱导表达，继而使报道基因表达产生由其编码的报告蛋白后，报告蛋白便可以通过分析手段进行检测(参考文献9、Tecon R， van der Meer J R.Information from single-cell bacterial biosensors what is it good for Current Opinion in Biotechnology，2006，17 (I) :4-10 ;10、Sorensen S J，Burmolle M，Hansen L H. Making bio-sense of toxicity new developments in whole-cell biosensors. Current Opinion in Biotechnology，2006，17 (I) :11-16 ;11、 Hansen L H，Sorensen S J. The use of whole-cell biosensors to detect and quantify compounds or conditions affecting biological systems. Microbial Ecology,2001， 42(4) :483-494 ;12、Rusling JF, Hvastkovs E G，Schenkman J B. Toxicity screening using biosensors that measure DNA damage. Current Opinion in Drug Discovery & Development，2007，10 (I) :67-73)。编码蛋白的报告基因是生物传感细胞的重要部分，既存在于某些天然微生物中， 也可以通过基因工程手段人为构建。生物传感细胞中常见的报道产物包括IacZ基因编译的β -半乳糖苷酶，IuxAB和luxCDABE编译的细菌荧光素酶，Iuc编译的萤火虫荧光素酶， gfp编译的绿色荧光蛋白等。研究者目前已开发了多种遗传毒性的生物传感细胞检测技术， 如 umu/SOS 显色实验、Vitotox (参考文献13、Westerink W M K, Stevenson J C R, Lauwers A，et al. Evaluation of the Vitotox(TM)and RadarScreen assays for the rapid assessment of genotoxicity in the early research phase of drug development. Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis，2009， 676(1-2) :113-130)和 sulA-test (参考文献14、ElMzibri M，DeMeo M P，Laget M，et al. The Salmonella sulA—test :A new in vitro system to detect genotoxins. Mutation Research-Genetic Toxicology，1996，369 (3-4) :195-208)等。目前生物传感细胞已被广泛应用于土壤遗传毒性的异位检测。例如禹果等研究者，釆用umu方法评价受PAHs污染的北京郊区污灌土壤的遗传毒性(参考文献15、禹果， 肖睿洋，王春霞，等.利用mnu/SOS实验评价污灌土壤的遗传毒性.环境科学，2006，27 (6) 1162-1165) ；Xiao等研究者釆用umu方法研究天津地区41个土样，发现主要污染物为 PAHs (PAHs含量5mg/kg)的污染土壤会诱导细胞，诱导值为对照的2倍(参考文献16、Xiao R YiWang Z JiWang CX,et al. Genotoxic risk identification of soil contamination at a major industrialized city in northeast China by a combination of in vitro and in vivo bioassays. Environmental Science & Technology，2006，40 (19) 6170-6175)。然而如前所述，以生物传感细胞原位检测土壤遗传毒性在国内外尚属空白。
发明内容
为了克服上述现有技术存在的缺点，本发明的目的在于提供一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法，能够降低土壤样品遗传毒性评价的不确定性、减少时间和经济成本、更准确的评价土壤介质的真实毒性、并且可以将污染物的暴露途径与其毒性相关联，具有很大的科学和应用价值。为了达到上述目的，本发明所采用的技术方案是一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法，土壤样品不需固液萃取和分离，而直接利用检测遗传毒性的生物传感细胞进行检测，包括如下步骤步骤I :生物传感细胞的培养与准备将生物传感细胞接种至新鲜培养基培养，使其达到对数增长期，得到细胞悬浊液；步骤2 :土壤样品的准备将土壤样品风干、研磨过10目筛后，称取预设质量的样品，与预设体积的去离子水混合，制备土壤样品悬浊液；步骤3 :样品遗传毒性测试将步骤I中制备的细胞悬浮液与步骤2制备的土壤样品悬浊液混合，使用能够读取化学发光的发光检测仪或多功能酶标仪，每隔5-30min读取并记录混合液的化学发光值Ium ；步骤4 :数据处理对于待测土壤样品，定义诱导倍数(IR)=某一时刻污染土样的发光强度/相同时刻阴性对照土样的发光强度；若显著性检验IR > 1，则认为该土壤样品具有遗传毒性；在相同剂量下，IR越高，土壤样品的遗传毒性越强；在相同IR下，称取的土壤剂量越小，土壤样品的遗传毒性越强。步骤I所述的生物传感细胞为重组发光菌，在暴露于遗传毒性物质时，产生相应的发光增强现象。所述重组发光菌为Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux。所述重组发光菌为Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux 已于 2009 年 2 月 26 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2925，该保藏中心简称CGMCCJia :北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。步骤2所述的土壤样品的准备，对土壤样品悬浊液进行超声处理，使土壤颗粒进一步分散在悬池液中。所述超声处理时间为200-300S，超声波的频率为38_40kHz。步骤2所述称取的土壤样品质量在5mg至500mg之间，按照土水重量比I : 20最
终定容。本发明和现有技术相比，具有如下优点I、本发明利用暴露于遗传毒物后发光增强的生物传感细胞实现，该类生物传感细胞携带发光基因片段，其发光基因片段与细胞内的某种DNA损伤修复基因具有相同的启动子，因此当该细胞暴露于遗传毒物时，遗传毒物诱导DNA损伤修复基因表达的同时，诱导发光基因表达，产生发光增强现象。发光基因表达的报道产物产生化学发光现象，与需要光激发才能发光的荧光基因报道产物不同，是一种生物的自发光效应。因此即使在土壤的混合介质中，也可以被检测到发光，从而实现对污染土壤样品的直接检测。2、本发明检测土壤样品遗传毒性快速、灵敏，并且在检测环节中不存在萃取和固液分离环节，从而降低了检测结果的不确定性，更客观反映污染物的真实赋存情况，更准确评价土壤介质中污染物的真实毒性。
图I为丝裂霉素C污染土壤遗传毒性原位检测与异位检测诱导倍数的对比。图2为利用生物传感细胞ADP_recA_km_lux对石油污染土壤中多环芳烃污染物的遗传毒性的表征结果。图3为利用生物传感细胞ADP_recA_km_lux对重金属Cr污染土样遗传毒性的表征结果。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
和附图对本发明作进一步详细说明。除非特殊说明，本试验所采用的方法均为常规方法，采用的材料或试剂均可以从商业途径获得。实施例I :丝裂霉素C污染土壤遗传毒性的原位检测与异位检测对比步骤I :生物传感细胞的培养与准备采用一株人工构建的生物传感细胞Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux,该细胞在暴露于遗传毒性物质时发光增强，该菌株已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2925，该保藏中心简称CGMCCJi 址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。从含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一个重组发光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落，接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基中 (LBKMlO)，30°C于150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKMlO培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬浊液，待用；步骤2 土壤样品的准备配制浓度为20mg/L、2mg/L、0. 2mg/L、0. 02mg/L的丝裂霉素C(MMC)溶液，各浓度梯度分别取Iml与5g无污染土壤混合，自然风干，得到MMC最终浓度为4mg/kg、0. 4mg/ kg、0. 04mg/kg、0. 004mg/kg的污染土壤；分别称取250mg污染土壤样品，按照土水重量比 I 20定容，得到土壤样品悬浊液。步骤3 :样品遗传毒性测试I)原位检测将步骤2得到的不同MMC浓度的土壤样品悬浊液置于频率为38_40kHz的超声清洗仪中，施加超声300s，得到不同MMC浓度的土壤样品待测液；取198μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L不同MMC浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min读取并记录37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光 (Ium)及600nm的吸光度(0D600)，两次测量间隔96孔板在37°C培养箱中培养。计算诱导倍数(IR)=暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度；
2)异位检测将步骤2得到的不同MMC浓度的土壤样品悬浊液置于频率为38_40kHz的超声清洗仪中，施加超声5-10min, 1500rpm进行离心分离，得到不同MMC浓度的上清液进行遗传毒性测试，取198 μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L不同MMC浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样， 使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min读取并记录37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，两次测量间隔96孔板在37°C培养箱中培养。计算诱导倍数(IR)=暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度；污染土壤中MMC浓度与诱导倍数的关系曲线如图I所示，由图可见，通过应用原位检测法，发光重组菌可以直接被土壤中的MMC诱导而产生发光增强现象，并且细胞发光与污染土壤中MMC含量呈现剂量效应关系。显著性检验表明，细胞可以检出MMC含量为O. 4mg/ kg的污染土壤所具有的遗传毒性；应用异位检测法，发光重组菌可以检出4mg/kg污染土壤所具有的遗传毒性，其检测灵敏度远低于原位检测法。该结果同时表明，由于土壤介质对污染物具有吸附作用，导致异位毒性检测过程中，部分MMC不能被超声萃取至液相。然而残留在土壤中的MMC尽管不可萃取，但对微生物依然体现遗传毒性。因此采用异位检测法将不能准确评价污染土壤的遗传毒性，而原位检测法能较好的反映MMC在介质中的遗传毒性。实施例2 :重组发光菌对石油污染土壤遗传毒性的原位检测步骤I :生物传感细胞的培养与准备从含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一个重组发光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落，接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基中 (LBKM10)，30°C于150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKM10培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬浊液，待用；步骤2 土壤样品的准备污染土壤样品1、2、3采集于胜利油田油井附近的表层土壤，通过常规的GC-MS方法对污染土壤成分进行分析表明样品中苯并芘等多环芳烃污染物污染严重；将风干的污染土壤样品1、2、3与去离子水以重量比I : 20的比例混合，制备土壤样品悬浊液，并置于频率为38-40kHz的超声清洗仪中，施加超声300s，得到土壤样品待测液 1、2、3 ；步骤3 :样品遗传毒性测试取198 μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L步骤2得到的土壤待测液样品的一种，每种土壤样品待测液样品做 3组平行样，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪(SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔30min读取并记录37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，两次测量间隔96孔板在37°C培养箱中培养；步骤4 :数据处理
诱导倍数(IR)=暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度；三个污染土壤样品中的苯并[a]芘、多环芳烃总量以及发光诱导倍数如图2所示。三个土壤样品中，有两个检测到遗传毒性(t检验，P < O. 05)，发光诱导系数与BaP 和PAHs的浓度的线性相关系数分别为O. 94和O. 86，对高环PAHs表现出突出的灵敏度，检出遗传毒性的土壤样品中PAHs最低含量为4. 17mg/kg，其中BaP含量O. 05mg/kg。有研究者利用土壤中线蚓或跳虫考察PAHs污染土壤遗传毒性，在21 329d的实验周期内，对PAHs 检测限为100 931mg/kg。与该方法相比，本发明所提供的方法可以迅速且高灵敏度表征油田污染土壤的遗传毒性。实施例3 :重组发光菌对重金属污染土壤遗传毒性的原位检测步骤I :生物传感细胞的培养与准备从含有10mg/L卡那霉素的LB平板中(LBAKM10)挑取一个重组发光菌 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落，接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基中 (LBKMlO)，30°C于150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKMlO培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬液，待用； 步骤2 :土壤样品的准备配制摩尔浓度为2. 5X10_1mol/L,2. 5 X l(T2mol/L、2. 5 X l(T3mol/L、2. 5X ΙΟΛιοΙ/ L的重铬酸钾溶液，取Iml上述不同浓度的溶液加入5g无污染土壤中，自然风干，得到六价 Cr最终浓度为5. 2mg/g、0. 52mg/g、0. 052mg/g、0. 0052mg/g的污染土壤样品；取风干土壤样品250mg，按照土水重量比I : 20定容。土壤样品置于超声清洗仪中超声300s，得到不同六价Cr浓度的土壤样品待测液；步骤3 :样品遗传毒性测试取198yL步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L不同Cr浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样，去离子水做阴性对照，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪 (SpectraMax M2Molecular Device Corporation),每隔 30min 读取并记录37°C温度条件下 96孔板中每一个孔的化学发光(Ium)及600nm的吸光度(0D600)，两次测量间隔96孔板在 37 °C培养箱中培养；步骤4 :数据处理诱导倍数(IR)=暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度；污染土壤中铬含量与相对诱导倍数的关系曲线如图3所示，由图可见，原位检测法对重铬酸钾污染土壤具有较高的灵敏度，检测限可低至0. 01mg/g以下，以对数坐标表示的土壤中Cr的含量与相对诱导倍数存在典型的剂量-效应关系，即在一定的浓度范围内， 随着土壤中Cr含量的增加，相对诱导倍数显著升高；当Cr含量达到5mg/g时，由于遗传毒性超出生物传感细胞的耐受限度，相对诱导倍数反而有所下降。
权利要求
1.一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法，其特征在于土壤样品不需固液萃取和分离，而直接利用检测遗传毒性的生物传感细胞进行检测，包括如下步骤步骤I:生物传感细胞的培养与准备将生物传感细胞接种至新鲜培养基培养，使其达到对数增长期，得到细胞悬浊液；步骤2 :土壤样品的准备将土壤样品风干、研磨过10目筛后，称取预设质量的样品，与预设体积的去离子水混合，制备土壤样品悬浊液；步骤3 :样品遗传毒性测试将步骤I中制备的细胞悬浮液与步骤2制备的土壤样品悬浊液混合，使用能够读取化学发光的发光检测仪或多功能酶标仪，每隔5-30min读取并记录混合液的化学发光值Ium ；步骤4 :数据处理对于待测土壤样品，定义诱导倍数(IR)=某一时刻污染土样的发光强度/相同时刻阴性对照土样的发光强度；若显著性检验IR > 1，则认为该土壤样品具有遗传毒性；在相同剂量下，IR越高，土壤样品的遗传毒性越强；在相同IR下，称取的土壤剂量越小，土壤样品的遗传毒性越强。
2.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于步骤I所述的生物传感细胞为重组发光菌，在暴露于遗传毒性物质时，产生相应的发光增强现象。
3.根据权利要求2所述的原位检测方法，其特征在于所述重组发光菌为 Acinetobacter sp. ADP—recA—km—lux。
4.根据权利要求3所述的原位检测方法，其特征在于所述重组发光菌为 Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux已于2009年2月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2925，该保藏中心简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101。
5.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于步骤2所述的土壤样品的准备， 对土壤样品悬浊液进行超声处理，使土壤颗粒进一步分散在悬浊液中。
6.根据权利要求5所述的原位检测方法，其特征在于所述超声处理时间为200-300S， 超声波的频率为38-40kHz。
7.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于步骤2所述的土壤样品质量在 5mg至500mg之间，按照土水重量比I : 20最终定容。
8.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于包括如下步骤步骤I :生物传感细胞的培养与准备从含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一个重组发光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落，接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基LBKMlO中，30°C于 150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKMlO培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬池液，待用；步骤2:土壤样品的准备配制浓度为20mg/L、2mg/L、0. 2mg/L、0. 02mg/L的丝裂霉素C溶液，各浓度梯度分别取Iml与5g无污染土壤混合，自然风干，得到丝裂霉素C最终浓度为4mg/kg、0. 4mg/ kg、O. 04mg/kg、0. 004mg/kg的污染土壤；分别称取250mg污染土壤样品，按照土水重量比 I 20混合，得到土壤样品悬浊液。步骤3 :样品遗传毒性测试将步骤2得到的不同MMC浓度的土壤样品悬浊液置于频率为38-40kHz的超声清洗仪中，施加超声300s，得到不同MMC浓度的土壤样品待测液；取198 μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2μ L不同MMC浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪，每隔30min读取并记录37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光及600nm的吸光度，两次测量间隔96孔板在37 °C培养箱中培养。步骤4 :数据处理诱导倍数IR =暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度。
9.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于包括如下步骤步骤I :生物传感细胞的培养与准备从含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一个重组发光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落,接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基LBKMlO中，30°C于 150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKMlO培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬池液，待用；步骤2:土壤样品的准备污染土壤样品1、2、3采集于胜利油田油井附近的表层土壤，通过常规的GC-MS方法对污染土壤成分进行分析表明样品中苯并芘等多环芳烃污染物污染严重；将风干的污染土壤样品1、2、3与去离子水以重量比I : 20的比例混合，制备土壤样品悬浊液，并置于频率为38-40kHz的超声清洗仪中，施加超声300s，得到土壤样品待测液I、2、3 ；步骤3 :样品遗传毒性测试取198 μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L步骤2得到的土壤待测液样品的一种，每种土壤样品待测液样品做3组平行样，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪，每隔30min读取并记录 37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光及600nm的吸光度，两次测量间隔96孔板在37 °C培养箱中培养；步骤4 :数据处理诱导倍数IR =暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度。
10.根据权利要求I所述的原位检测方法，其特征在于包括如下步骤步骤I:生物传感细胞的培养与准备从含有10mg/L卡那霉素的LB平板LBAKM10中挑取一个重组发光菌Acinetobacter sp. ADP_recA_km_lux单菌落,接种于含有10mg/L卡那霉素的LB培养基LBKMlO中，30°C于 150rpm摇床中过夜培养16h，离心后重悬，用新鲜LBKMlO培养基将细菌稀释10倍以获得细胞悬液，待用；步骤2:土壤样品的准备配制摩尔浓度为 2. 5X10^1101/1、2. 5Xl(T2mol/L、2. 5 X l(T3mol/L、2. 5Xl(T4mol/L 的重铬酸钾溶液，取Iml上述不同浓度的溶液加入5g无污染土壤中，自然风干，得到六价Cr 最终浓度为5. 2mg/g、0. 52mg/g、0. 052mg/g、0. 0052mg/g的污染土壤样品；取风干土壤样品 250mg，按照土水重量比I : 20定容。土壤样品置于超声清洗仪中超声300s，得到不同六价Cr浓度的土壤样品待测液；步骤3 :样品遗传毒性测试取198 μ L步骤I中稀释的细胞悬浊液，加入黑色底透的96孔酶标板孔内，再向每个孔中加入2 μ L不同Cr浓度的土壤样品待测液，每种土壤样品待测液做3组平行样，去离子水做阴性对照，使用能够读取96孔酶标板化学发光和吸光度的多功能酶标仪，每隔30min读取并记录37°C温度条件下96孔板中每一个孔的化学发光及600nm的吸光度，两次测量间隔96孔板在37 °C培养箱中培养；步骤4 :数据处理诱导倍数IR=暴露3小时时刻污染土样的发光强度/相同时刻空白土样的发光强度。
全文摘要
一种污染土壤遗传毒性的原位检测方法，土壤样品不需固液萃取和分离，而直接利用检测遗传毒性的生物传感细胞进行检测，首先将生物传感细胞接种至新鲜培养基培养，使其达到对数增长期，得到细胞悬浊液；然后称取预设质量的土样风干、研磨后，与预设体积的去离子水混合，制备土壤样品悬浊液；随后将细胞悬浮液与土壤样品悬浊液混合，读取并记录混合液的化学发光值；最后定义诱导倍数(IR)＝某一时刻污染土样的发光强度/相同时刻阴性对照土样的发光强度；若IR＞1，则该土壤样品具有遗传毒性；本方法能降低土壤样品遗传毒性评价的不确定性、减少成本，更准确的评价土壤介质的真实毒性、并且可以将污染物的暴露途径与其毒性相关联，具有很大的科学和应用价值。
文档编号C12Q1/02GK102605036SQ201210096428
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者姜博, 宋一之, 张旭, 李广贺, 田思聪, 黄巍 申请人:清华大学