专利名称：基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统及其应用的制作方法
基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统及其应用技术领域 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统，还涉及基因组长片段删除系统的应用。
背景技术：
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业在历史上一直与农并茂，为中华民族经济的发展和文化的弘扬都做出了巨大贡献。蚕丝拥有雍容典雅的光泽、轻盈舒适的触感、良好的衣料悬垂性和曲线性、适中的吸水性以及对人体肌肤的亲和性等固有的优良特性，长久以来都深受广大消费者的喜爱，蚕丝也因此而被誉为“纤维皇后”。目前我国丝绸エ业年总产值达1350亿元，占纺织エ业总产值的10%以上；茧丝产量和出ロ量分别占世界总额的70%和80%以上，年创汇超过50亿美元，是在国际市场上处于绝对优势的特色产业。全国共有种桑养蚕农户2000多万户，遍布20余个省区。蚕业是目前我国农村经济中的重要组成部分，其年出口创汇额在农产品中位居前列，是农民收入的重要来源。蚕丝产业在解決“三农”问题，特别是增加农民收入、调整农村产业结构上发挥着越来越重要的作用。然而，作为ー个古老的传统产业，蚕桑丝绸生产技术与水平最近60年来都处于ー个平台期。蚕品种的强健性、絹丝品质、产量等主要经济性状差等品种资源问题一直没有取得重大的突破，蚕丝服装易发黄、变皱等固有缺陷没有得到根本的解決。品种资源更新远远跟不上生产需要，蚕丝业整体生产效益低下。这主要是因为1)经过上百年的挖掘，基于传统育种手段的增产潜力已经发挥到极致，加之自然条件的特殊性和局限性，目前已很难突破品种资源本身的局限。现存的家蚕品种虽然种类和数量颇多，但是其遗传背景単一，相互之间的经济性状和生物学性状并没有显著的差异。家蚕品种经过百年更迭，在经济性状和生物学性状上都没有显著的改进。2)作为纺织纤维，蚕丝因其价格昂贵使得众多消费者望而止步，加之蚕丝具有易发黄、起皱的缺点，使其在各种纺织纤维中并不占有很大的市场份额。在蚕丝产业几乎停滞不前的近几十年中，棉、毛等纺织纤维的研究和利用进展良好，各种人造纤维异军突起，对蚕丝产业造成了比较大的冲击。3)长久以来，人类驯化和饲养家蚕的主要目的是缫丝织绸，所以现存的家蚕品种几乎都是千篇一律的多丝量品种，其茧丝的成分和特性基本上没有什么区别。在蚕业科技日新月异的今天，蚕丝越来越多的作为ー种多功能的生物材料而被重新认识。家蚕是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物和重要的生物反应器。家蚕遗传学和生理学的早期研究成果为昆虫信息素、激素、解剖学、生理学和遗传学等方面的基础发现做出尤为重要的贡献；在家蚕基因组框架图、家蚕基因组精细图、家蚕基因芯片和遗传变异图相继解析之后，家蚕基因组学和功能基因组学研究在现代昆虫生物学研究中也起着举足轻重的作用。作为合成和分泌丝蛋白的唯一器官，家蚕丝腺是昆虫中蛋白质合成能力最強的生物器官，一头家蚕可生产纯蛋白质O. 5g以上。无论是在基础研究，还是在药物、化妆品开发领域，提取或表达纯化的蛋白都扮演着极其重要的角色。饲养ー头蚕的成本不足I角钱，却能吐O. 5g的丝蛋白，而如果能用基因工程手段让家蚕吐出O. 5g纯蛋白，这对于蚕丝产业、甚至生物产业都将产生革命性的推动作用。也正是这ー奇特的生物学现象和应用前景吸引着众多生物学家自分子生物学发端以来就长期致カ于家蚕丝蛋白的表达调控和家蚕生物反应器的开发。要突破传统育种的局限，获得品种选育的革命性突破；彻底克服蚕丝的固有缺陷，恢复蚕丝的纺织纤维市场中生机；开发新型多功能蚕丝材料，促进单ー的蚕丝产业向更为广阔的非絹丝产业扩展，这些都是现代蚕业中亟须解决的关键问题。在分子农业时代，这些问题的解决离不开对家蚕重要经济性状相关基因的功能解析和遗传改造。要最大程度的发挥家蚕在鳞翅目昆虫研究中的模式作用，推动家蚕生物反应器的进ー步开发和应用，也离不开转基因、基因组编辑和遗传改造等重要的分子工具。尽管转基因和RNAi等目前广泛应用的分子改良工具在家蚕中已经得到了较好的应用，但是转基因和RNAi并不能彻底删 除基因组的中的核酸序列，而目前能直接对家蚕内源基因进行编辑和改造的技术还未见报道，更没有长片段基因组序列删除的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统及其应用和该删除系统的应用，利用该删除系统能够在基因组中删除目的基因长片段，获得遗传变异大的品种，为育种提供丰富的遗传资源。为实现上述目的，技术方案为
I.基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统，所述删除系统由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和单链寡核苷酸ssODNs组成，所述内切酶TALEN由剪切所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和剪切所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；所述单链寡核苷酸ssODNs由所述目的基因的靶序列的至少10个连续核苷酸和距离所述靶序列上游或下游至少I个碱基的至少10个连续核苷酸组成。进ー步，所述靶序列为T(Nn)A的核苷酸序列，N为A，G，T和C中的任ー碱基，η为24至65之间的任一数字。进ー步，所述目的基因为家蚕油蚕基因BmBlos2，所述靶序列如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。进ー步，所述核酸酶TALEN-L如SEQ ID NO. 3所示核苷酸编码的蛋白质；所述核酸酶TALEN-R如SEQ ID NO. 4所示核苷酸编码的蛋白质。进ー步，所述单链寡核苷酸ssODNs由所述靶序列的连续40个核苷酸和距离所述靶序列上游795个碱基的连续60个核苷酸组成。进ー步，所述单链寡核苷酸ssODNs如SEQ ID NO. 17所示核苷酸。2.所述基因组长片段删除系统在靶细胞基因组中改造目的基因的应用。进ー步，所述靶细胞为家蚕卵细胞。进一步，所述目的基因为豕香油香基因BtnBlos20本发明的有益效果在于本发明利用TALEN和ssODNs技术，通过TALEN具有特异剪切核酸靶序列的特点，在目的基因内部设计含有识别靶序列的蛋白质，并在识别靶序列蛋白质的上游设置有核定位信号NLS和核酸酶FokI，使目标蛋白能够定位于细胞核中，并识别靶序列处通过核酸酶FokI发生剪切；同时还利用单链寡核苷酸ssODNs对核酸序列具有修复功能，通过ssODNs与靶序列上游或下游序列结合，在基因组中完成删除和修复，最后能够实现长片段删除，其操作简单，能够实现对任意序列进行删除，还可以利用基因同源性原理同时实现多基因一次性删除，能够获得遗传变异大的品种，提供丰富的遗传资源。
图1显示了家蚕油蚕基因ガ的结构示意图和剪切目的基因靶序列的内切酶TALEN的识别位点，其中数字表示外显子或内含子的长度，ATG和TAA分别表示起始和终止密码子，下划线表示TALEN的识别模块。图2显示了家蚕油蚕基因ガ敲除以后家蚕的表型，其中WT表示野生型的家蚕个体，mutant表示突变体。图3显示了注射了 B3后产生的突变序列，其中a图表示家蚕油蚕基因他 ガAxsJ的部分结构示意图，上方的箭头表示PCR和测序引物的位置，b图表示来自与不同蛾圈的突变个体的序列，以“〉”开头的标识表示不同的蛾圈编号，是“Λ”、“Μ”和“I”分别表示缺失、碱基替换和插入，其后的数字表示缺失、替换或插入的碱基数，“X”及后面的数字表示相应序列的条数，下划线的序列为TALEN的识别位点。图4显示了家蚕油蚕基因ガ的结构示意图和目的基因删除結果。其中a图显示了家蚕油蚕基因み 5705^的结构示意图，黑线表示ssODNs的设计；b图显示了共注射后TALEN和ssODNs后的PCR結果，目的条带的大小为556bp，底部的数字表示突变的效率。
具体实施例方式 为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进ー步的详细描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J-萨姆布鲁克等著)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中使用的家蚕品种为“N4”，由中国西南大学家蚕基因资源库提供。一、家蚕油蚕基因ガ序列分析
从silkDB数据库下载家蚕油蚕基因ガ 的序列(编号为BGIBMGA002101)。序列分析显示该基因包括四个长分别为180bp，131bp，112bp和608bp的外显子以及三个长分别为2465bp，663bp和2703bp的内含子，第一外显子包括125bp的非翻译区和55bp的编码区，其结构如图I所示。按照基因敲除的一般原则，该基因的第二和第三外显子为理想的靶标位点，本实施例以第二外显子和第三外显子为靶序列。ニ、第三外显子TALEN序列的设计
根据家蚕油蚕基因ガ〃沿的序列特征，我们选择第三外显子上的序列作为TALEN作用的靶序列，家蚕蚕油蚕基因BmBlos2第三外显子核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示，根据TALEN原理将结构为T(Nn)A的核苷酸序列为TALEN识别靶序列，其中N为A，G，T和C中的任ー碱基，η为24至65之间的任一数字。按照上述原理设计TALEN识别的靶位点为5’ -tcaccaagtacgcagatctaaggagcctagccgcgaacctgaacaagaccctta—3^ (SEQ 丄D NO. 2)，划1 部分为TALEN识别模块，黑体部分表示间隔序列，其中5’端划线核苷酸序列为5’端识别序列，对应SEQ ID NO. 2所示的1-20位核苷酸，3’端划线核苷酸序列为3’端识别序列，对应SEQ ID NO. 2所示的36-54位核苷酸序列。分别将5’端识别序列和3’端识别序列按照A=NI, T=NG, G=NN, C=HD规律设计识别靶序列的蛋白质的可变序列，并在蛋白质上游偶联核定位信号NLS，下游偶联核酸酶FokI，分别得到由核定位信号NLS、识别5’端识别序列的蛋白质和核酸酶FokI依次串联组成的核酸酶TALEN-L和由核定位信号NLS、识别3’端识别序列的蛋白质和核酸酶FokI依次串联组成核酸酶TALEN-R。根据核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的氨基酸序列设计编码核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列，编码核酸酶TALEN-L的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，其中第82-102位核苷酸编码核定位信号NLS，第120-2826位核苷酸编码识别5’识别序列的蛋白质，第2833-3420位核苷酸编码内切核酸酶FokI，编码核酸酶TALEN-R的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，其中第76-96位核苷酸编码核定位信号NLS，第114-2820位核苷酸编码识别3 ’识别序列的蛋白质，第2826-3414位核苷酸编码核酸酶FokI。三、编码TALEN-L 和 TALEN-R 的 mRNA 的制备
分别人工合成编码核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的核苷酸序列(SEQ ID NO. 3和 SEQ ID NO. 4)，再用限制性内切酶KpnI和BamHI双酶切后连接经同样酶切的原核表达载体pET28a，然后转化大肠杆菌，并筛选阳性克隆，获得重组质粒对，命名为pET28a-B3L和pET28a_B3R。将所得重组质粒对分别用Xho I酶切消化后用MessageMax T7 mRNA体外转录试剂盒(购自Epicentre)进行体外转录,体外转录条件为■ 在温度为37°C条件下孵育30分钟，加IuL DNA酶，再继续孵育15分钟。然后将反应液用Epicentre A-plus加尾试剂盒(购自Epicentre)进行加A反应，反应条件为在温度为37°C条件下孵育30分钟，然后用MEGAClear试剂盒(购自Ambion)进行纯化，得编码核酸酶TALEN-L和核酸酶TALEN-R的mRNA,将所得核酸酶TALEN-L的mRNA和核酸酶TALEN-R的mRNA混合物命名B3，于_80°C保存备用。四、B3显微注射
选择多化性家蚕品种“N4”，在温度为25°C、相対湿度75%±5%、光周期为12小时光照+12小时黑暗的条件下中，用桑叶饲养。羽化后收集同时化蛾的雌雄蚕蛾，在温度为25°C、光强为5(Γ155 μ mol/m2/s的条件下交配4小时后拆对，并将雌蛾投放于上浆的蚕连纸上产卵，所得蚕卵直接用于显微注射。用浓度为TOOng/yL的B3用显微注射仪(FemtoJet5247显微注射仪，购自Eppendorf)注射所得蚕卵中的521粒蚕卵，每粒蚕卵注射量约IOnL0注射后的蚕卵用无毒胶水封住注射ロ，并用体积百分比为35%的甲醛蒸气中消毒5分钟，置于25°C、相対湿度为85%、光周期为12小时光照+12小时黑暗的环境中催青孵化，将孵化的GO代蚁蚕人工饲料收集饲养至化蛾。五、突变个体筛选
在521粒注射蚕卵中，经人工饲养获得126头五龄幼虫，其中28头表现出嵌合体的表型，如图2所示。将获得的126个GO代蚕蛾，通过自交或回交获得41蛾圈Gl代蚕卵，将41个蛾圈催青并单独饲养至Gl代三龄幼虫观察，在其中的6个蛾圈中发现277头具有表型为油蚕的家蚕突变体。六、可遗传突变个体的测序分析
选取表型为油蚕的家蚕突变体51个，提取基因组，选取选取突变位点附近序列设计PCR 引物进行 PCR 扩增。PCR 引物上游引物为 B3-F364 :5，-tccaatttgagggcaatgctac-3’(SEQ ID NO. 5),下游引物为 B3-R315 :5，-atttcaccacctcattcaactaagat-3，(SEQ IDNO. 6) ;PCR 扩增条件为94°C预变性 4 min ;94°C变性 30s，59。。退火 30s，72。。延伸 45s，30个循环；72°C延伸10 min。同时选取突变位点附近序列设计测序引物，测序引物如SEQID NO. 6所示。PCR产物经电泳检测、纯化，然后进行测序。测序结果表明所选取的51个家蚕突变个体在第三外显子靶序列处均发生了突变，突变包括变异、缺失或小片段的插入，测序结果如SEQ ID NO. 7-16，部分结果如附图3所示。
七、ssODNs序列的设计与合成
根据第三外显子靶序列和删除片段上游序列即第二外显子，设计一条单链寡核苷酸(Single-stranded oligonucleotides, ssODNs), ssODNs 由第三外显子革巴序列的 3’ 识别序列和距离3’识别序列上游792位的60个连续核苷酸组成，具体序列为5’-tgtCaCCgagCtgttcgagtttcgaagtcctggatccacatgatcctgtgatcagtcggtgccgcgaacctgaacaagacccttaatgaatacaacgaga-S^SEQ ID NO. 17)，其中1_60位核苷酸为删除片段上游序列和61-100位核苷酸为根据TALEN切割位点下游序列构成，下划线部分为转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的3’端识别位点。ノV、ssODNs和B3的显微共注射
利用上述制备蚕卵的方法制备蚕卵，取402粒蚕卵进行显微注射，具体为用浓度为700ng/l·! L的B3与浓度为IOOmM的ssODNs按体积比为I :1混合，然后用显微注射仪(FemtoJet 5247显微注射仪，Eppendorf )注射，每粒蚕卵注射量约10nL。注射后的蚕卵用无毒胶水封住注射ロ，并用体积百分比为35%的甲醛蒸气中消毒5分钟，然后置于25°C、相対湿度85%的高湿度环境中催青孵化，孵化得到61头GO代蚁蚕，经人工饲料收集共得到35头五龄蚕,其中I头表型为嵌合体(部分表皮表现出透明的表型，部分表皮为正常的乳白色)，为突变体。提取所得嵌合突变体和20头表现正常的个体的基因组设计引物进行PCR扩增，PCR 引物上游引物为 5’-ttggtccagtaggtttgaagtaggt_3’ (SEQ ID NO. 18),下游引物如SEQ ID NO. 10 ;PCR扩增条件为94°C预变性4 min ;94°C变性30s，59で退火30s，72で延伸45s，30个循环；72°C延伸10 min, PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，检测所得PCR条带为556bp，与未发生突变的1351bp相比，目的基因中删除了 795bp片段，由此可知，嵌合体表型的家蚕个体中发生了长片段删除，删除序列为目的基因在ssODNs的缺失部分，其比例为2. 2%，结果如图4所示。最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过參照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
权利要求
1.基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统，其特征在于所述删除系统由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和单链寡核苷酸ssODNs组成，所述内切酶TALEN由剪切所述靶序列5’端的核酸酶TALEN-L和剪切所述靶序列3’端的核酸酶TALEN-R组成；所述单链寡核苷酸ssODNs由所述靶序列中的至少10个连续核苷酸和距离所述靶序列上游或下游至少I个碱基的至少10个连续核苷酸组成。
2.根据权利要求I所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述靶序列为T(Nn)A的核苷酸序列，N为A, G, T和C中的任一碱基，η为24至65之间的任一数字。
3.根据权利要求I或2所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述目的基因为家蚕油蚕基因他沿AxsJ ，所述靶序列如SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列。
4.根据权利要求I所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述核酸酶TALEN-L如SEQ ID NO. 3所示核苷酸编码的蛋白质；所述核酸酶TALEN-R如SEQ ID NO. 4所示核苷酸编码的蛋白质。
5.根据权利要求I所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述单链寡核苷酸ssODNs由所述靶序列的连续40个核苷酸和距离所述靶序列上游795个碱基的连续60个核苷酸组成。
6.根据权利要求I所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述单链寡核苷酸ssODNs如SEQ ID NO. 17所示核苷酸。
7.权利要求1-6任一项所述基因组长片段删除系统在靶细胞基因组中改造目的基因的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述靶细胞为家蚕卵细胞。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述目的基因为家蚕油蚕基因BmBlos ο
全文摘要
本发明公开了基于TALEN和ssODNs的基因组长片段删除系统，由剪切目的基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN和单链寡核苷酸ssODNs组成；该系统能够准确识别结构为T(Nn)A的靶序列，并在基因组中实现长片段删除，还公开了基因组长片段删除系统的应用，具有删除效率高，彻底改变基因组遗传信息，获得遗传变异大的品种，为育种提供丰富的遗传资源。
文档编号C12N15/113GK102618528SQ201210095048
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者夏庆友, 张圣棂, 徐汉福, 马三垣 申请人:西南大学