专利名称：一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种重组黑麦草花粉过敏原与突变体的制备方法和应用。
背景技术：
近几十年来，随着工业化，城市化进程的推进，变态反应疾病的发病率呈逐渐上升趋势。在发达国家，近15% - 30%的人对花粉过敏，在我国，对花粉过敏的病人至少有500-1000万，且近年来花粉过敏患者的发病率有持续上升的趋势。所以植物花粉过敏原的分子生物学研究是世界变态反应学界研究的热点之一。花粉过敏症既与人自身的体质有关 也与空气中花粉的种类和浓度有关。空气中花粉的数量主要受地域环境，季节，气候和植物自身的生活影响。我国地域辽阔，植物种类繁多，致敏花粉也呈现出多样性。加之城市绿化的普及，人们接触花粉的机会增加，使得花粉过敏症的发病率有增长的趋势。花粉变应原可导致人体产生变应性鼻炎、皮炎、支气管哮喘等过敏性疾病。因此，对花粉变应原的深入研究有利于了解疾病发生的原因，为开展特异性免疫诊疗奠定基础。植物花粉是主要的吸入性变应原，能诱导人体产生I型超敏反应。目前国内外对花粉过敏治疗所采用的策略多种多样，其中较为有效的是采取变应原特异性免疫治疗，简称免疫治疗(special immune treatment, SIT)。这种方法被认为是目前唯一的过敏疾病医学治疗方法，它可缩短病程、阻滞症状的恶化和防治对新的过敏原产生过敏。但也暴露出一些新问题由于临床上所采用的变应原来源于花粉的粗提液，成分非常复杂，既包含主要、次要变应原以及其它一些非变应原蛋白。这就势必增加引起新的过敏反应的可能性。近年来，基因工程的发展为生产高纯度的变应原提供了值得考虑的思路和方法，基重组变应原替代天然变应原提取液在临床上取得良好的效果。相比较而言，利用基因工程技术，通过定点突变的方法获得低过敏原性或无过敏原性的重组黑麦草花粉过敏原的突变体，在一定程度上可从源头上降低治疗过程中的风险，同时能够保留黑麦草花粉过敏原的生物学活性。另外，重组过敏原的生产条件稳定，且标准化程序简单，有利于广泛应用于临床的诊断和治疗。因此，重组弱化过敏原将是一种很好的替代方法，有广阔的发展前景。全世界大约有4亿人对草花粉过敏,草过敏原分为Group I、Group II、GroupIILGroup IV及Group V。其中Group V是最重要的草花粉过敏原,在对草过敏的病人中，有80%的人对Group V过敏。黑麦草是禾本科黑麦草属的植物之一，花果期5-7月。Lol p5是黑麦草5种花粉过敏原之一，同时也是Group V草过敏原的代表蛋白。黑麦草的种植不仅能够提供大量优质牧草，同时在改善稻田土壤生态环境、减少水土流失、减轻农业环境污染方面具有重要作用。但是黑麦草的广泛种植，使得黑麦草花粉在空气中所占比例不断上升，受到了广大研究者的重视。
发明内容
本发明的目的在于针对上述存在的问题及天然黑麦草花粉过敏原纯度的不足，在克隆表达重组黑麦草花粉过敏原的基础上，利用生物信息学软件分析黑麦草花粉过敏原的抗原表位，突变一个或多个抗原性高的位点，从而获得低过敏原性的黑麦草花粉过敏原突变体，期望能够安全高效地应用于过敏性疾病的治疗。本发明的另一个目的是提供一种编码上述黑麦草过敏原及其突变体的基因。本发明的另一个目的是提供含有上述基因的重组质粒载体。本发明的另一个目的是提供上述基因转化的重组表达宿主。
本发明的另一个目的是提供一种上述重组黑麦草花粉过敏原及其突变体的制备方法。本发明的另一个目的是提供一种重组黑麦草花粉过敏原用作药物或者诊断试剂的制备方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
本发明的重组黑麦草花粉过敏原，是天然存在的黑麦草花粉过敏原衍生的非天然存在的变异体，其核酸序列经密码子优化后，人工合成全长的重组黑麦草花粉过敏原基因。采用生物信息学软件分析其抗原表位，针对一个或多个抗原性指数高的位点进行有目的的置换，获得重组黑麦草花粉过敏原突变体的基因，使其在保持原有生物学活性和空间结构的基础上，能够有效地降低重组黑麦草花粉过敏原的过敏原性。然后利用大肠杆菌表达系统，在人工控制的条件下，获得高纯度的重组黑麦草花粉过敏原及其突变体蛋白。与天然黑麦草花粉过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合性能明显减少，可安全地应用于过敏性基本的预防和治疗。一种重组黑麦草花粉过敏原，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。上述重组黑麦草花粉过敏原的突变体，是在重组黑麦草花粉过敏原的突变体的基础上衍生的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。更进一步地，所述表达宿主为大肠杆菌表达系统，该表达系统，名称为Escherichia coli JM109-Q4DF，并已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCCNO: M 2011177，保藏日期为2011年5月19日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该宿主表达与纯化后可以获得重组黑麦草花粉过敏原。最详细的制备方法步骤如下
(O从数据库中获取黑麦草花粉过敏原的核酸序列，根据表达宿主的密码子偏好型对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变；
(2)人工合成优化后的核酸序列；
(3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体；
(4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物；
(5)在2(T38°C下，培养阳性转化物，用浓度为O.0Γ2. OmmoI/L的IPTG诱导重组蛋白表达，诱导温度为4 38°C ；
(6)所得培养物经裂解宿主细胞后，纯化获得高纯度的重组蛋白。本发明所述重组黑麦草花粉过敏原的突变体的制备方法包括如下步骤(a)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组黑麦草花粉过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位；
(b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基；
(C)获得花黑麦草花粉敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体；
(d)按照前述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。本发明所述重组黑麦草花粉过敏原及其突变体可以用于制备药物，制得的药物用于治疗变态反应性疾病并使对黑麦草花粉过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏源性的高低。·与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组黑麦草花粉过敏原的编码基因，并采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变的方法，针对一个或多个抗原性高的位点进行定向置换，以降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组黑麦草花粉过敏原突变体。利用在人工控制的条件下进行蛋白表达，获得高纯度的重组黑麦草花粉过敏原及其突变体蛋白。与天然黑麦草花粉过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白过敏原性的高低。
图I重组黑麦草花粉过敏原蛋白的诱导表达电泳图。图中从左至右分别为Marker ；未诱导菌体；诱导菌体。Marker从上至下分别为97. 4，66.2，45. O, 31. O, 21. O, 14.4kD。具体的实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例I重组黑麦草花粉过敏原的克隆与表达
(O重组黑麦草花粉过敏原核酸序列的确定=WNCBI数据库中获取天然黑麦草花粉过敏原的核酸序列(GenBank登录号L13083. I)，在该序列的C端加上方便纯化的亲和标签6*HIS、STREPII或S蛋白。然后分别在序列的N端和C端加上Nde I、Eco RI、Xho I、PstI等酶切位点，得到重组黑麦草花粉过敏原的目的基因片段Q4DF。(2)根据大肠杆菌的密码子偏好性，对目的基因Q4DF的核酸序列进行密码子优化，使得目的基因更适合在宿主菌中表达，优化后GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变，如SEQ ID NO: I 所示。(3 )人工合成优化后的Q4DF基因序列。(4)经双酶切后，将目的片段Q4DF克隆到原核表达载体pET上，构建重组表达质粒。(5)将重组表达质粒pET-Q4DF转化入表达宿主菌Rosetta中。(6)选择含重组表达质粒pET-Q4DF的表达宿主菌Rosetta在LB培养基中30_37°C培养1-6小时，加入浓度为O. 0Γ2. O mmol/L IPTG诱导表达2-8小时，诱导温度为4-38°C。诱导后，离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测目的蛋白的表达量(见图I)。
(7)超声破碎法裂解菌体获得目的蛋白的包涵体，裂解液为15-100 mM Tris-Hcl,50-300 mM NaCl, O. 05-1. O mM EDTA。(8)用透析法进行蛋白复性后，以8000-30000rpm的转速在4°C下离心15-30 min,
收集上清液。(9)复性后得到的上清液，经6*HIS、STREPII或S蛋白标签的亲和层析柱获得高纯度的目的蛋白。实施例2重组黑麦草花粉过敏原的抗原表位分析及突变位点的确定
(I)运用在线软件平台包括 SYFPEITHI，MHCPred, SYFPEITHI, BIMAS, NetMHC II，MHC-THREAD,EpiPredict,HLA-DR4 binding, ProPred, RankPep, SVMHC,PREDEP,PREDICT 等对重组黑麦草花粉过敏原的氨基酸序列的抗原指数进行分析。综合各软件的分析，结果表 明重组黑麦草花粉过敏原氨基酸序列中1-25、69-89、301-323区域的抗原值较高。(2)针对抗原值比较高的一个或多个位点进行氨基酸置换，以弱化抗原性。将抗原性改造后的氨基酸序列再进行上述的抗原性分析，如此反复，筛选出抗原性显著降低的突变位点。实施例3重组黑麦草花粉过敏原突变体的构建
(I)针对确定的突变位点，按照突变试剂盒提供方法设计突变体引物，Tm值一般要求大于78 °C，引物长度在25-45个碱基之间比较适宜。(2)根据突变试剂盒的要求，以重组黑麦草花粉过敏原的重组表达质粒为模板，进行突变PCR。(3)用试剂盒中提供的酶消化PCR产物后，转化感受态细胞，挑取阳性克隆，测序检测突变是否成功。
权利要求
1.一种重组黑麦草花粉过敏原，其特征在于在重组黑麦草过敏原的基础上衍生的非天然存在的突变体，其中B细胞或/和T细胞表位的至少一个表面暴露的保守氨基酸残基被在天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的另一残基取代，该突变体具有与天然出现的过敏原基本相同的α-碳骨架三级结构。
2.权利要求I所述的一种黑麦草花粉过敏原的突变体，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO: I 所示。
3.权利要求I所述一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤编码权利要求I所述重组黑麦草花粉过敏原的基因依据相应的表达宿主的情况通过密码子优化得到，并以之获得重组载体后，转化大肠杆菌、酵母或植物，得到重组宿主，蛋白表达后得到权利要求I所述的重组黑麦草花粉过敏原。
4.根据权利要求3中所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于所述表达宿主是大肠杆菌表达系统，名称为Escherichia coli JM109-Q4DF，并已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO: M 2011177，保藏日期为2011年5月19日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学；该宿主表达与纯化后可以获得权利要求I所述的重组黑麦草花粉过敏原。
5.根据权利要求3所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的制备方法，其特征在于包括如下步骤 (1)从数据库中获取此蛋白的核酸序列，根据表达宿主的密码子偏好性对其进行密码子优化，优化后序列中GC含量为35飞5%，原氨基酸序列不变； (2)人工合成优化后的核酸序列； (3)经双酶切后，与表达载体连接，构建成重组载体； (4)将重组载体转化表达宿主中，选择阳性转化物； (5)在20-38°C下，培养阳性转化物，用浓度为O.0f2. O mmol/L的诱导剂来诱导重组蛋白表达，诱导温度为4-38°C ； (6)所得培养物通过超声波破碎或其它裂解方法裂解宿主细胞后，通过超滤法、层析法、离心法、等电点沉淀法等纯化方法获得高纯度的重组蛋白。
6.权利要求2所述的一种重组黑麦草花粉过敏原的突变体的制备方法，其特征在于包括如下步骤 Ca)采用生物信息学软件预测权利要求I所述重组黑麦草花粉过敏原的氨基酸序列的优势抗原表位； (b)采用定点法改变抗原性高的位点，用天然存在的过敏原来源的分类学目内任何已知的同源蛋白质氨基酸序列中的相同位置不出现的氨基酸残基取代原有的氨基酸残基； (C)获得黑麦草花粉过敏原突变体的基因片段，经酶切后，与表达载体连接，构建成突变型重组载体； Cd)按照权利要求5所述步骤(4) (6)的方法，获得高纯度的重组突变蛋白。
7.权利要求1-6所述的重组黑麦草花粉过敏原或其突变体在制备药物中的应用，该药物用于治疗变态反应性疾病并使对黑麦草花粉过敏原乃至其它类型过敏的患者产生免疫耐受；或者用来诊断变态反应性疾病或者判断其它食品药品的过敏原性的高低。
8.权利要求7中所述的药物或诊断试剂，其特征在于它包含根据权利要求1飞中任意一项的重组过敏原，任选与药用或者诊断试剂中可接受的赋形剂和/或载体，并且任选佐剂和/或偶联剂组合。
全文摘要
本发明具体公开了一种重组黑麦草花粉过敏原与其突变体的制备方法与应用。本发明所述重组黑麦草花粉过敏原是天然存在的过敏原衍生的非天然存在的变异体，氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明利用基因工程技术，经密码子优化后人工合成重组黑麦草花粉过敏原的编码基因，采用生物信息学软件分析其抗原表位，通过定点突变针对一个或多个抗原性高的位点进行定向置换，降低其过敏源性，构建成低过敏原性的重组黑麦草花粉过敏原突变体。在人工控制下进行蛋白表达，获得高纯度的重组黑麦草花粉过敏原及其突变体蛋白。与天然过敏原相比，该重组蛋白突变体与特异性IgE的结合能力明显降低，可安全地应用于过敏性疾病的诊断与治疗乃至判断其它蛋白过敏原性的高低。
文档编号C12N15/29GK102675439SQ20121009503
公开日2012年9月19日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年3月31日
发明者何颖, 刘雪婷, 董慧峰, 邹泽红, 陈惠芳, 陶爱林 申请人:广州医学院第二附属医院