专利名称：利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法
技术领域：
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种转BT基因甘蔗的检测引物对、检测试剂盒及利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法。
背景技术：
甘蔗螟虫是我国蔗区广泛发生而且为害很大的一类甘蔗害虫。据估计，因螟害造成甘蔗减产达10%-25%，重者可达40%-60%，同时还可导致糖分损失和诱发某些茎部病害。 我国蔗区常见的甘蔗螟虫有二点螟、条螟、黄螟、大螟和白螟等。一直以来，喷施农药都是防治甘蔗螟虫主要手段。但长期大量使用化学农药，既增加了生产成本，又严重污染了环境、 破坏了生态平衡。而且螟虫的发生和为害并未得到有效的控制。实践证明，选育和推广抗虫甘蔗品种是解决甘蔗生产发展与环境污染问题的理想措施。但是甘蔗种质自身缺乏抗虫基因，传统的育种方法未能取得进展。随着生物技术的飞速发展，通过转基因技术已经能够有效地向作物导入外源目的基因。目前Bt基因已成为世界上植物抗虫基因工程研究和应用最多的基因。近年来Bt基因也成功引入了甘蔗作物当中，广州甘蔗糖业研究所在国内率先获得了一批表达量高、抗螟性好的转Bt甘蔗品系。优良的Bt材料必须作为种质不断地进行杂交利用，才能选育出符合生产发展需要的抗虫甘蔗品种。而在整个育种过程中，不管是当代转Bt基因植株还是其转育后代，都必须经过真假鉴定，剔除非Bt基因植株。鉴定工作越靠前，节省人力物力就越多，抗虫品种的选育效率越高。目前Bt基因甘蔗的主要鉴定方法有PCR检测、Western Blot分析、人工接虫试验等鉴定方法。但Western Blot法需要制定特定的抗体,分析过程非常复杂；人工接虫试验需要在特定的时间季节采集虫源，而且植株的数量、大小有一定的要求；而PCR方法具有简便、快速、高通量等优点，无疑是Bt基因植株初步筛选的首选方法，但一般要等植株生长几个月达到一定的高度后，才能采集叶片等组织提取DNA进行鉴定，在一定程度上伤害了植株，又要耗费大量时间等候，延误了实验工作。另外甘蔗叶片含有非常丰富的酚类、多糖等物质，对DNA的提取质量有负面影响，因此都要设法去除，否则直接干扰PCR结果，可见利用叶片提取DNA相对复杂。本发明以PCR扩增技术为基础，根据Bt基因特殊序列区设计引物， 不用事先提取基因组DNA，以含酚类、多糖较少的根尖作鉴定材料，用量极少，容易获得，检测过程简单、快速，结果准确。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测转BT基因甘蔗的引物对。本发明的另一个目的是提供一种用于检测转BT基因甘蔗的试剂盒。本发明的另一个目的是提供一种利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法。本发明所采用的技术方案是
一种转BT基因甘蔗的检测引物对，其序列如下所示
Fl:5，ATG GGA CGC CTT CCT GGT G 3，(SEQ ID NO 1)；Rl:5，TCC TGG AGT CGT AGT TCG GG 3，(SEQ ID NO :2)。一种转BT基因甘蔗的检测试剂盒，包括反应液I、反应液II和反应液III，其中， 反应液 I 含有 O. Γο. 2Μ Na0H、10 15%(v/v)Tween20 ；
反应液 II 含有 O. I 0.3M Tris-HCl、2 3mM EDTA (ρΗ2· O)；
反应液III含有O. 28、. 35 μ M上述的转BT基因甘蔗的检测引物对(FI、Rl的摩尔浓度比为 I :1)、0· 2 O. 3mM dNTP、3. 5 4. 5mM MgCl2、0. 020 0· 03U /μ Taq 酶和匹配的缓冲液。优选的，反应液II含有 O. IM Tris-HCl、2mM EDTA (ρΗ2· O)。 优选的，反应液III含有O. 32 μ M权利要求I所述的引物对(FI、Rl的浓度比为I :I),O. 25mM dNTP、4.0mM MgCl2、0. 02(Γ0. 03U /μ Taq 酶和匹配的缓冲液。优选的，所述缓冲液含有IOOmM Tris-HCl (ρΗ8. 8), 500mM KC1,0. 8% (v/v)乙基苯基聚乙二醇。利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法，包括如下步骤
1)取待检甘蔗根尖，压碎；
2)加入反应液II 2μ ，矿物油4 6μ ，95 98°C加热10 18分钟；
3)再加入反应液II2 3μ ，反应液ΙΙΙ15 17μ ，按如下程序进行PCR扩增预变性94°C4min ；94°C 40s, 60°C lmin，72°C 30s，循环 35 次；72°C延伸 5min ;
4)根据扩增结果判断待检甘蔗是否为转BT甘蔗。优选的，步骤4)的具体操作为将步骤3)的扩增产物在Agrose凝胶上进行电泳分离，所得的Agrose凝胶置于成象系统上进行检测。优选的，步骤4)的具体操作为
(1)配制O. 8-1. 2%Agrose 胶，加入 EB 替代染料 3PL/100mL ；
(2)上样每个PCR管加入上样缓冲液5_8μ ，混匀后在点样孔上点样8_12μ 7孔；
(3)电泳在电压4 5V/cm条件下30 40min；
(4)检测分析在凝胶成象系统上进行观察、照相保存。本发明的有益效果在于
(1)本发明的检测引物对可用于快速鉴定转Bt基因甘蔗，结果可靠；
(2)本发明的检测方法操作简便，不用提取基因组DNA即可直接进行PCR检测，3小时可以得到检测结果，省时省力；
(3)用根尖(I根，约Imm即可)作检测材料，试管苗、种茎或植株等的根尖都可，而且材料用量极少，不会伤害、影响被取材植株的生长；
(4)根尖极易长出，容易取得，可省去几个月等待植株生长的时间。
图I是利用根尖材料通过本发明的方法进行PCR扩增的鉴定图谱(MSDNAmarker ;1_3分别为供测试品系D6、D7、D8 ；4为Y3 ；5为粤农73 — 204)。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。实施例I利用根尖快速鉴定转BT基因甘蔗的方法一、检测引物对
Fl:5，ATG GGA CGC CTT CCT GGT G 3，(SEQ ID NO 1)；
Rl:5，TCC TGG AGT CGT AGT TCG GG 3，(SEQ ID NO :2)。二、反应液
反应液 I 含有 0. 2M NaOHU5% (v/v) Tween20 ；
反应液 II 含有 0. IMTri s-HCl、2mMEDTA (pH2. 0)；
反应液III含有0. 32 ii M上述的引物对(FI、Rl的摩尔浓度比为I :1)、0. 25mM dNTP、 4. OmM MgCl2、0. 020 0. 03U /ML Taq酶和缓冲液(IOOmM Tris-HCl (Ph8. 8), 500mMKCl,0. 8% (v/v)乙基苯基聚乙二醇)。三、反应步骤
I、采集甘蔗的根尖
将来自“粤农73 — 204父丫3”3个品系(06、07、08)、丫3 (转Bt基因第一代品系)、粤农 73 - 204种茎(1-2节)，用10mg/L IBA+5mg/L NAA溶液浸泡30分钟后，放置在35°C、相对湿度为98%以上的容器(或塑料袋)内，1-3天后根尖长出即可采作检测材料。2、PCR 反应
分别取06、07、08、￥3、粤糖79-177的根尖I条(约Imm)压碎后置于PCR管低部，加入反应液I 2ML，然后加上5W矿物油，把PCR管置于在PCR仪上，在95°C下加热15分钟；先加入反应液II 2ML，再加入反应液III 16W。按下列程序进行PCR扩增预变性94°C 4min ； 94°C 40s, 60°C lmin，72°C 30s，循环 35 次；72°C延伸 5min。3、扩增产物分离
配制浓度为I. 0%Agrose胶(加入EB替代染料为3ML/100mL)。在有扩增产物的PCR管加入8ML上样缓冲液，混匀后分别在点样孔点上IOML样品，同时点上DL2000 DNA Marker 3ML。在电压5V/cm条件下电泳40min。4、扩增产物检测
电泳结果后，马上把凝胶置于凝胶成象系统上进行观察记录、照相保存等，对是否含有 Bt基因进行分析在分子量约为545bp处能扩增出条带者则为Bt基因甘蔗，反之为非Bt基因甘蔗。四、检测结果
Y3是以粤糖79-177为供体的第一代转Bt基因甘蔗品系，经过常规的PCR检测、 Western Blot分析和人工接虫等试验表明，Y3含Bt基因，毒蛋白表达量高，抗虫能力较强， 是本试验的正对照。粤农73 - 204属于普通甘蔗品种，是供试品系的母本，不含Bt基因， 为本试验的负对照。如图I所示，Y3在545bp处出现条带，而粤农73 — 204则没有，符合实验预期，说明试验正确，结果可靠。在3个供试品系D6、D7、D8中，只有D8在545bp处出现条带，其余2个则没有，表明D8是Bt基因甘蔗，而D6、D7则为非Bt基因甘蔗。以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。
权利要求
1.一种转BT基因甘蔗的检测引物对，其序列如下所示Fl:5，ATG GGA CGC CTT CCT GGT G 3，(SEQ ID NO 1)；Rl:5，TCC TGG AGT CGT AGT TCG GG 3，(SEQ ID NO :2)。
2.—种转BT基因甘蔗的检测试剂盒，包括反应液I、反应液II和反应液III，其中，反应液 I 含有 O. Γθ. 2Μ Na0H、10 15%(v/v)Tween20 ；反应液 II 含有 O. I 0.3M Tris-HCl、2 3mM EDTA (ρΗ2· O)； 反应液III含有O. 28 O. 35 μ M权利要求I所述的引物对(F1、R1的摩尔浓度比为I :1)、O.2 O. 3mM dNTP、3. 5 4. 5mM MgCl2、0. 020 0· 03U /μ Taq 酶和匹配的缓冲液。
3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，反应液II含有O.IM TriS-HC1,2mMEDTA (pH2. O) ο
4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，反应液III含有O.32 μ M权利要求I 所述的引物对(FI、Rl 的摩尔浓度比为 I :1)、0· 25mM dNTP、4. OmM MgCl2、0. 020 0· 03U /μ Taq酶和匹配的缓冲液。
5.根据权利要求2或4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液含有IOOmMTris-HCl (ρΗ8. 8), 500mM KC1,0. 8% (v/v)乙基苯基聚乙二醇。
6.利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法，包括如下步骤 1)取待检甘蔗根尖，压碎； 2)加入权利要求2所述的反应液II 2μ ，矿物油4 6μ ，95 98°C加热10 18分钟； 3)再加入权利要求2或3所述的反应液II2^3μ ,权利要求2或4所述的反应液III15 17μ ，按如下程序进行 PCR扩增预变性 94°C 4min ；94°C 40s, 60°C lmin,72°C 30s，循环35次；72°C延伸5min ； 4)根据扩增结果判断待检甘蔗是否为转BT甘蔗。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)的具体操作为将步骤3)的扩增产物在Agrose凝胶上进行电泳分离，所得的Agrose凝胶置于成象系统上进行检测。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤4)的具体操作为 (1)配制O. 8-1. 2%Agrose 胶，加入 EB 替代染料 3μ /1OOmL ； (2)上样每个PCR管加入上样缓冲液5_8μ ，混匀后在点样孔上点样8_12μ 7孔； (3)电泳在电压4 5V/cm条件下30 40min； (4)检测分析在凝胶成象系统上进行观察、照相保存。
全文摘要
本发明公开了一种转BT基因甘蔗的检测引物组、检测试剂盒和利用根尖快速鉴定转Bt基因甘蔗的方法。该方法以甘蔗根尖为材料，操作简便，不用提取基因组DNA即可直接进行PCR检测，3小时可以得到检测结果，特异性与灵敏度高，省时省力，而且材料用量极少，不会伤害、影响被取材植株的生长。
文档编号C12N15/11GK102618648SQ20121009492
公开日2012年8月1日 申请日期2012年4月1日 优先权日2012年4月1日
发明者劳方业, 邓海华, 陈健文, 陈勇生 申请人:广州甘蔗糖业研究所