一种多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制备和分析方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微流控核酸分析芯片的技术领域，具体涉及一种具有样品前处理，核酸提取与纯化，核酸扩增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制备和分析方法。
【背景技术】
[0002]核酸作为基本的遗传物质，携带着各种信息，对其结构、功能的认识，有利于研究物种的遗传、进化以及疾病诊断等。微流控芯片在核酸分析方面有着广泛和极其重要的应用，如基因突变检测、病原体基因鉴定、食品安全检验。传统的PCR技术虽然能实现DNA的扩增检测，但需要人工进行复杂的实验操作，如样品前处理，核酸提取，DNA扩增等多个步骤，而且需要核酸提取仪，PCR扩增仪，基因分析仪等多台仪器，其检测结果受人为因素的影响较大，需要专业技术人员和专业的实验室设备。微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高等特点，它可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析，并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程。PCR技术和微流控技术的相结合，能实现核酸操作过程的自动化、全封闭，简化了人工的操作过程，避免了过程污染，提高了核酸检测的效率和准确性。
[0003]集成化的微流控芯片通常将微流体控制与分析单元集成在芯片上，如微栗、微阀、微传混合器、微流量控制器等，使体积微型化和功能集成化，在较短时间内精确完成从样品制备到结果显示的全部过程。尽管大规模集成的微全分析系统还处在实验室研究阶段，但随着微流控芯片的运用与发展，针对特定功能的微流控芯片及系统发展迅速，如静态腔式微流控PCR系统、具有样品前处理功能的核酸提取系统、集成化的温控系统、微型化的检测系统。目前，由于各功能模块的研究突破，促进了集成化的发展，但形成一个完整的集成化系统还存在着很大的技术难度。
[0004]为了实现具有多功能的集成化微流控核酸分析芯片，本研究团队早已开展过特定功能的微流控核酸分析芯片研究，如赵树弥等在分析化学上发表的《集成核酸提取的实时荧光PCR微全分析系统》。此论文报道的集成核酸提取芯片是针对血液裂解液，在芯片上做核酸提取与PCR反应，不能对血液样品直接进行测试。Emily A.0blath等在Lab ona chip 上发表的〈〈A microfluidic chip integrating DNA extract1n and real-timePCR for the detect1n of bacteria in saliva》，文中的这种微流控芯片虽然能够实现对样品的直接处理，但是氧化铝膜易碎，芯片制作困难，而且芯片是开腔式设计，易造成气溶胶污染，影响检测结果的准确性。Wu Qingqing等在Analytical chemistry上发表的((Integrated glass microdevice for nucleic acid purificat1n, loop-mediatedisothermal amplificat1n, and online detect1n》，文中的这种芯片是集核酸抽提，环介导等温扩增及在线分析的整合芯片，但是该芯片采用微柱法提取核酸，提取效率和微柱的可靠性需进一步研究，芯片上没有集成裂解功能，样品需要手工裂解后再加入到芯片中，而且只能做等温扩增，使用条件有限。
【发明内容】
[0005]本发明技术解决问题:克服上述现有技术的缺陷，提供一种具有样品前处理，核酸提取与纯化，核酸扩增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片及制备和分析方法。
[0006]本发明采用的技术方案为:一种多功能的集成化微流控核酸分析芯片，所述芯片是在同一块微流控芯片上将样品前处理、DNA提取、扩增功能模块集成，能实现核酸分析结果输出的多功能的集成化微流控核酸分析芯片；
[0007]所述芯片包括基底，液路层基片，弹性薄膜，气路层基片四层结构；
[0008]液路层基片的上表面嵌有多个试剂腔、多个混合腔和DNA提取腔，下表面嵌有裂解腔、废液腔和多个扩增反应腔，上下表面腔体间的连接通过微通道和微孔道实现；
[0009]气路层基片下表面含有凹陷的多个微阀气腔和上表面凸起的卡合接头，气路层基片中心以微孔道贯穿；
[0010]液路层基片的下表面与基底键合，上表面与弹性薄膜下表面键合，以气路层基片的下表面与弹性薄膜上表面键合形成一块完成的多功能的集成化微流控核酸分析芯片。
[0011]所述基底是硅片、玻璃，或能与液路层基片材料键合的材料。
[0012]所述液路层基片和气路层基片的材料是PDMS，PC, PMMA或PS多种聚合物材料。
[0013]所述卡合接头为卡合结构，利用PDMS具有的弹性，实现接口密封。
[0014]—种多功能的集成化微流控核酸分析芯片的方法，实现步骤如下:
[0015](1)液路层基片通过模具生成，此模具分上模具和下模具两种，结构为尺寸与基片凹陷大小相同的凸显结构，两者构成组合模具，使用该组合模具通过注塑法可快速生成液路层基片；
[0016](2)气路层基片也是通过模具生成，此模具分为上模具和下模具两种，结构尺寸与基片凸凹大小相同但相反的凹凸结构，两者构成组合模具，使用该组合模具通过注塑法可快速生成气路层基片；
[0017](3)以等离子体清洗基底、液路层基片、弹性薄膜、气路层基片键合成一块完整的微流控核酸分析芯片。
[0018]—种多功能的集成化微流控核酸分析芯片进行分析的方法实现:
[0019](1)样品加载
[0020]芯片上核酸分析所需要的试剂事先加载到多个试剂腔里，而样品直接加载到起始的试剂腔即可；
[0021](2)裂解试剂混合
[0022]裂解所试剂在受外力的驱动下，从每个试剂腔流经微通道进行扰动混合，流动到对应的混合腔进行开口比混合和自由扩散混合，混合后进行到裂解腔内；
[0023](3)加热裂解
[0024]根据试剂里面的酶活性需求，对裂解腔内的试剂加热，DNA被释放到溶液中；加热裂解后的溶液与每个试剂腔的试剂在对应的混合腔进行扰动和自由扩散混合，又经过开口比的混合形式被驱动到DNA提取腔内；
[0025](4)硅胶膜上DNA吸附、清洗、洗脱
[0026]在提取控内，基于固相萃取法，采用硅胶膜提取核酸，DNA在高盐(3-5M盐酸胍)低pH(5.0-6.5)条件下能吸附在硅胶膜上，低盐(2.5mMtris-HCL或者水溶液)高pH(8-8.5)条件下被释放，可纯化DNA，获得高质量DNA ;提取后的DNA在其中一个试剂腔的清洗试剂I进行清洗，在另一个试剂腔的清洗试剂II又再一次清洗去除杂质，清洗后的废液均被抽至废液腔内，然后再经另外试剂腔中的洗脱试剂进行DNA的洗脱；
[0027](5)反应试剂的混合以及扩增反应
[0028]基于PCR或等温扩增技术用于扩增硅胶膜上洗脱下来的DNA上的一段特异的基因片段，在其中一个试剂腔的试剂一部分进入一个扩增反应腔，另一部分与DNA溶液混合进入另一个扩增反应腔，相同温控条件下进行扩增反应，根据扩增的结果可判别特定基因的存在性以及含量的相对量。
[0029]本发明的原理在于:
[0030](1)该微流控芯片由4层构成，液路层基片和气路层基片分别通过模具注塑生成，整块微流控芯片以等离子体清洗基底、液路层基片、弹性薄膜、气路层基片等键合生成。
[0031](2)基于固相萃取法，采用硅胶膜提取核酸，DNA在高盐(3-5M盐酸胍)低pH(5.0-6.5)条件下能吸附在硅胶膜上，低盐(2.5mMtris-HCL或者水溶液)高pH(8-8.5)条件下被释放，可纯化DNA，获得高质量DNA。
[0032](3)基于PCR或等温扩增技术用于扩增一段特异的基因片段，根据扩增的结果可判别特定基因的存在性以及含量的相对量。
[0033]本发明与现有技术相比的优点在于:
[0034](1)相对于传统的核酸实验操作方法，本发明的微流控芯片核酸分析方法操作简单，只需要添加样品即可，在芯片内部就能实现样品的处理，核酸提取与扩增反应，直接给出结果。
[0035](2)液路层基片和气路层基片可通过组合模具通过注塑法生成，快捷简单。
[0036](3)与现有的技术报道的芯片不同之处，本发明还具有血液裂解等样品前处理功會泛。
[0037](4)本发明有两个扩增反应腔可进行对照组实验，不需要在进行手工实验对照，而且本发明不仅可用于PCR的扩增检测，还可用于诸如环介导等温扩增(如LAMP)等核酸等温扩增检测。
[0038]总之，本发明提供了一种具有样品前处理，核酸提取与纯化，核酸扩增等多功能的集成化微流控核酸分析芯片，实现了“样品进-结果出”的自动化、全封闭操作，避免了繁琐复杂的人工操作，提高了检测效率。
【附图说明】
[0039]图1为本发明的微流控芯片结构图；
[0040]图2为本发明的微流控芯片解析层图；
[0041]图3为本发明中液路层下模具结构图；
[0042]图4为本发明中液路层上模具结构图；
[0043]图5为本发明中气路层下模具结