一种转基因甘蔗目的基因元件多重pcr快速筛查方法
【专利摘要】以甘蔗内源基因ALS和外源基因元件（包括Ubiquitin启动子，NOS启动子、NOS终止子，Bar基因和Bt基因）设计多重PCR引物。通过对多重PCR反应体系进行优化建立了添加60%PremixTaqTM体积、0.3μM引物浓度、150ngDNA模板和设定56℃的退火温度的多重PCR反应体系，一次PCR反应可同时检测一个甘蔗内标准基因（ALS基因）和5个外源转基因元件（Ubi启动子、Bt基因、Bar基因、NOS启动子、NOS终止子），并且检测极限可达模板DNA含量的1%。本实验建立的多重PCR反应体系不仅可以检测转基因甘蔗外源基因成分，而且还能有效的检测其它转基因作物。
【专利说明】—种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法
[0001]【技术领域】
本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法。
[0002]【背景技术】
转基因技术越来越成熟，转基因甘蔗的种类也日趋多样。目前，抗除草剂、抗虫、抗病转基因甘蔗已经在包括美国、澳大利亚、印度、巴西在内的14个国家进行田间试验，为转基因甘蔗商业化栽培创造了条件。在我国，甘蔗基因克隆和转基因研究则是在20世纪90年代中期才开始的，虽然起步较迟，但进展较快，已经获得的转基因甘蔗有抗虫转基因甘蔗、抗旱转基因甘蔗、耐除草剂转基因甘蔗、抗病毒病转基因甘蔗、抗真菌病转基因甘蔗、抗细菌病转基因甘蔗等。随着世界范围内转基因作物的不断增多，建立转基因快速检测方法显得尤为重要。由于甘蔗染色体复杂，插入的外源基因的检测比其它作物困难得多。目前，国内外实验室和国家检测部门应用最广泛的还是核酸PCR技术，对多种靶序列通常采用单一PCR检测的方式，这样不仅耗时，而且检测成本也很高，同时，在转基因作物育种中为了避免多价转基因作物基因之间产生的“反式失活”，人们在转基因作物育种中避免使用相同的启动子，这样就进一步增加了多价转基因作物检测的靶序列。虽然Dietrich等利用实时荧光定量PCR法、陈茹等利用PCR-ELISA技术建立了高敏感性的检测转基因作物体系，但是其操作过程复杂，检测成本较高，对操作人员要求也较高，并且仍然未摆脱对靶序列逐一检测的方式。
[0003]甘蔗属异源多倍体植物，由于染色体数目多且遗传机制十分复杂，转基因甘蔗的检测仍存在一定难度，对于转基因甘蔗外源基因元件进行多重PCR快速筛查迄今没有研究报道。加之目前基因工程趋向于多价转基因改造，一次可以检测多个外源基因的PCR方法更能提高效率。本发明利用多重PCR技术意在建立一种快速、简单、高效和低成本的转基因甘蔗目的基因检测方法，同时检测转ifer、Bt基因的双抗甘蔗的6个基因元件。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为转基因甘蔗PCR检测提供一种利用多重PCR方法快速筛查多个目的基因元件的方法。本发明在同一次PCR反应可以同时检出6个参数，既可以检测转基因作物内源基因，也可以检测常见的转基因调控元件和目的基因，6个参数只需要一次电泳分析，且PCR产物可直接上样进行电泳分析，不需要添加显色液等，可大大节省时间，节省试剂。
[0005]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
多重PCR反应体系:以总体积30 ii L计算,含60% Premix Taq?体积、热循环的退火温度56°C、引物浓度为0.3 ii M、DNA模板含量为150 ng。
[0006]转基因甘蔗外源基因元件多重PCR快速筛查方法，包括PCR反应体系和扩增条件，具体如下:
(I)PCR反应体系:反应体系总体积为30 u L，60%体积/Tagm,上、下游引物各0.6uL,模板3uL(50 ng/ y L)，用ddH20将终体积调整到30 u L ；
(2)PCR 扩增条件:95°C预变性 6 min，94°C变性 40 s，56°C退火 35 s，72°C延伸 35 s,共36个循环，最后72°C延伸10 min。
[0007]所述的一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法包含6种基因元件，分别是甘蔗也S基因、Ub i启动子、价基因、fer基因、NOS启动子和NOS终止子。
[0008]本发明的优点在于:
(1)效率高:在同一次PCR反应可以同时检出6个参数，包括甘蔗也S基因、Ubi启动子、NOS启动子，NOS终止子、价基因、fer基因；
(2)适用性广:既可以检测转基因作物内源基因，也可以检测常见的转基因调控元件和目的基因，包括甘蔗内源基因基因、常用的启动子和终止子如Ubi启动子、NOS启动子、NOS终止子；使用广泛的筛选基因fer基因；使用最多的功能基因At基因。
[0009](3)特异性强:1次PCR反应检测6种基因(序列)，各扩增产物条带清晰，互不干扰，并且没有非特异扩增。
[0010](4)简便快速:6个参数只需要一次电泳分析，且PCR产物可直接上样进行电泳分析，不需要添加显色液等，可大大节省时间，节省试剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]图1转基因甘蔗FNSC15229的单一 PCR检测。其中泳道1-3、4_6、7_9、10-12、13-15、16-18分别为ALS基因、Bt基因、Bar基因、Ubiquitin启动子，NOS启动子和NOS终止子引物的单次PCR产物;1、4、7、10、13、16为FNSC15229 ;2、5、8、11、14、17为阴性对照(FN15) ;3、6、9、12、15、18 为空白对照；M:IOObp Ladder DNA Marker。
图2不同Premix TaqTM含量与退火温度对多重PCR的影响。泳道1~4:退火温度依次为60、58、56、55°C时FNSC15229 DNA的PCR扩增结果；泳道5:阴性对照FNl5 ;泳道6:空白对照；M:IOObp Ladder DNA Marker ；A 为 40%Premix TaqTM, B 为 50%Premix TaqTM, C 为60%Premix TaqTM。
[0012]图3不同Premix TaqTM含量和引物浓度对多重PCR的影响。泳道1-5:引物浓度依次为 0.1 u M、0.2 u M、0.3 u M、0.4 y M、0.5 y M 时 FNSC15229 DNA 的 PCR 扩增结果；泳道 6:阴性对照 FN15 ;泳道 1:空白对照；M:1OObp Ladder DNA Marker ；A 为 40%Premix TaqTM,B 为 50%Premix TaqTM, C 为 60%Premix TaqTM。
[0013]图4多重PCR检测极限测试。泳道1-5:FNSC15229 DNA质量分数依次为100%、3%、2%、1%、0.5% ;泳道 6:阴性对照 FNl5 ;泳道 7:空白对照；M:100bp Ladder DNA Marker。
[0014]图5多重PCR体系适用性和稳定性分析。泳道1-5:依次为转基因油菜MS1、MS8、转基因水稻金恢80229、转基因甘蔗FNSC39229、FNSC22229 ;泳道6:阳性对照FNSC15229 ；泳道7:阴性对照FNl5 ;泳道8:空白对照；M:100bp Ladder DNA Marker。
[0015]【具体实施方式】
为了充分公开本发明一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，以下结合实施例加以说明。
[0016]实施例1:
(I)甘蔗也^基因、Ubi启动子、 价基因、fer基因、NOS启动子的PCR扩增根据权利要求2所述的甘蔗外源基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于，引物序列及PCR预期扩增片段长度如下:
表1引物序列及PCR预期扩增片段长度
【权利要求】
1.一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于:多重PCR反应体系含60%体积Premix Taq?、热循环的退火温度56°C、引物浓度为0.3 ii M，一个反应体系内同时含有6种目的基因元件PCR引物；所述的6种目的基因元件，分别是甘蔗U基因、Ubiqui tin启动子、价基因、fer基因、NOS启动子和NOS终止子。
2.根据权利要求1所述的一种转基因甘蔗目的基因元件多重PCR快速筛查方法，其特征在于:包括PCR反应体系和扩增条件，具体如下: (1)PCR反应体系:反应体系总体积为30 U L ；60%体积Premix Taqm,上、下游引物各0.6 UL,模板3 ii L，用ddH20将终体积调整到30uL； (2)PCR扩增条件:95°C预变性 6 min，94°C变性 40 s，56°C退火 35 s，72°C延伸 35 s,共36个循环，最后72°C延伸10 min。
【文档编号】C12Q1/68GK103614471SQ201310607161
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月26日 优先权日:2013年11月26日
【发明者】陈平华, 张卓, 陈忠伟, 王恒波, 施桂姣, 项慰, 刘迪, 邰连赛, 林冰, 陈利平, 陈容, 高三基, 许莉萍, 陈如凯 申请人:福建农林大学