专利名称：甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学中的基因领域，特别是关于甘蔗水分胁迫 相关的锌指蛋白基因序列。
背景技术：
甘蔗是我国最重要的糖料作物，甘蔗糖占我国食糖总量的90% 以上，同时甘蔗也是一种重要的能源植物。但我国甘蔗生产的立地条 件差，旱地蔗面积占全国植蔗面积的85%以上，因此干旱是我国甘蔗 生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，并严重影响甘蔗的产量和 品质。克隆与表达甘蔗干旱胁迫相关的某些基因，已经成为当前研究 热点之一。
干旱会导致植物失水而引发渗透势的变化，引起渗透胁迫。植物 感受干旱后，胁迫信号经历一系列传递过程，最后诱导特定功能基因 的表达，在生理生化上作出调节反应。研究表明，转录因子在抗旱基 因表达调控中起着重要的作用。其中锌指蛋白是一类在真核细胞中普 遍存在，作为基因转录因子参与细胞内基因表达调控的核酸结合蛋白 质，是真核细胞基因调控中起关键作用的一类调控因子。目前，人们 已经从拟南芥、矮牵牛、水稻、大豆、棉花等植物中克隆了许多编码
锌指蛋白的基因，并对其结构及功能进行了研究；利用转基因技术， 也将一些与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因在目标植物中过量表达后，
能对植物起到增强抗逆性的作用，说明锌指蛋白在增强植物逆境抗性 方面有着广阔的应用前景。因此，克隆甘蔗水分胁迫相关的锌指蛋白 基因将有利于研究甘蔗锌指蛋白基因在甘蔗抗旱反应中的作用，进而 为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFPl基 因序列，是通过以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因的CDS序列 保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘 蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因的全长表达序列。其核苷酸序列如序列 表中SEQ ID NO.l所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2 所述。
本发明的目的通过以下技术措施实现
1、总RNA的提取
甘庶茎节总RNA的提取采用Invitrogen公司的TRIzol试剂，试 验步骤参照TRIzol试剂说明书。
2、 cDNA第一链的合成
采用Invitrogen公司的Superscript TM III反转录试剂盒进行反 转录合成cDNA第一链(方法见说明书)。
3、 引物设计与引物合成
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的水分胁迫相 关锌指蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对， 确定保守区，根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为
256bp。引物设计后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。 引物序列为
ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC國3' ShZFP 1 R: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC誦3'
4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用简并引物进行PCR扩 增，所扩增的PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶 中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体 中，转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。 经简并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA交由上海生工 生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
根据己得到的cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末 端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的 基因的3'和5'末端进行PCR扩增。
在此3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由 外侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物作为模板，利用内侧 引物和接头引物再进行PCR扩增。 基因外侧引物5'-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3 ， 基因内侧引物5' -ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3 ， 接头引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC-3，
在5'RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C) 尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG
进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再用内侧引物和OligodG进行 第二次PCR扩增。
基因外侧引物5，-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3 ，
基因内侧引
;，-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3'
Oligo匿dG: 5，-GGGGGGGGGGGGGGGH隱3'
所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化并克隆到pMD-18T载体中转化大肠杆菌DH5 a感受态细胞，挑取阳性克隆，交给上海生工生物工程技术服务有限 公司进行双向测序，测序所得序列再与简并引物扩增所得的序列利用 Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗锌指蛋白基因的测定
将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为甘蔗锌指 蛋白基因序列。比对结果
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本发明的优点
干旱是我国甘蔗生产上长期存在的主要的非生物胁迫因素，严重 影响甘蔗的产量和品质。培育丰产优质抗旱的甘蔗新品种、提高甘蔗
的水分利用效率是提高我国甘蔗糖业国际竞争力的核心技术。因此， 本基因的获得，不仅为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在甘蔗抗 旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理奠定基础，而且还将 为甘蔗抗旱遗传改良提供参考。
具体实施方式
下面用实施例对本发明作进一步说明。
1、 总RNA的提取
取甘蔗茎节约O.lg于液氮中研磨成粉,加入lml Trizol进行匀浆， 按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2、 cDNA第一链的合成
取甘蔗总RNA约5ug与反转录引物(oligo-dT接头引物)lpL (10pmol/L)混合，7(TC加热5min后，立即放置冰上，然后加入 5xbuffer 5jiL， 10mmol/L dNTP混合液2.5pL， Ribonuclease inhibitor 0.5pL， M-MLV反转录酶0.5)iL，反应体系为25pL。反应过程为42°C 60min， 70°C 15min，最后放入-80。C保存备用。
3、 引物设计与引物合成
从GenBank中下载近源物种(如玉米、水稻等)的锌指蛋白同 源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区， 根据保守区序列设计简并引物，扩增片段大小约为256bp。引物设计 后交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
引物序列为
ShZFP 1F: 5'-AGATGATAATGARGCAGGAGC-3'
ShZFPlR: 5'-AATCCTHTAAGTCVAACCCTC-3'
4、锌指蛋白基因cDNA全序列的克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用保守引物进行PCR扩 增，反应体系为10xPCR反应缓冲液5|iL， 25mmol/L MgCl2 3(iL， 2.5mmol/L dNTP 2(iL， lOnmol/L引物ShZFPlF和ShZFPIR各2|iL， Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50pL。反应条件为l个 循环，94。C变性2min; 30个循环，94。C变性45s， 56"C退火45s， 72°C 延伸45s; l个循环，72。C延伸7min; 4。C保温。所扩增的PCR产物 用1.2%的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后 将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5感 受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经酶切检测后，将具有 插入片段的质粒DNA交上海生工生物工程技术服务有限公司进行双 向测序。
根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，禾!J用cDNA末 端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends, RACE)对目的 基因的3'和5'末端进行PCR扩增。
在3，RACE中，利用半巢式(semi-nested) PCR方法，首先由外 侧引物和接头引物进行PCR反应，所得产物稀释100倍后，取lpL 作为模板，禾U用内侧和接头引物再进行PCR扩增。
反应体系为10xPCR反应缓冲液5pL， 25mmol/L MgCl2 3pL， 2.5mmol/LdNTP2jiL， 10nmol/L正反向引物各2|iL， Taq酶1.2U，用 PCR水将反应体系补充至50!iL。
反应条件为1个循环，94。C变性5min; 30个循环，94。C变性 45s， 57。C退火45s， 72。C延伸lmin; 1个循环，72。C延伸7min; 4°C 保温。
基因外侧引物5，-AGATGATAATGAAGCAGGAGC-3， 基因内侧引物5'-ATCGACAGCATCGTCAATGGC-3， 接头引物5'-GGCCACGCGACTAGTAC-3， 在5'RACE中，利用末端转移酶和dATP在cDNA末端加上poly (C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和 OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1 u L作为模板，再 利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。反应体系及反应条 件同3'RACE 。
基因夕卜侦U弓I物5 ，-AATCCTGTAAGTCCAACCCTC-3 ， 基因内侧引物5 ，-TGCAAGTGCTGCACCGGTTC-3 ， Oligo-dG: 5，-GGGGGGGGGGGGGGGH-3， 所得到的PCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测 后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆，交上海生工生物工程技术服务有 限公司进行双向测序，测序所得序列再与保守区引物扩增所得的序列 利用Clustal W软件进行拼接。
5、对甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白(ShZFPl)基因的测定 将拼接结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为甘蔗锌指 蛋白基因序列。比对结果Score E
Sequences pmduciKQ significant srigmierits:(Sits)ref!買P 00l:iD52:4.S,l量liypDtheticsl protein LOC5^215SZes脆vs
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dbl^BI31S53,l霎zinc f.incjer protein『Camellia sinensis!21.4le-53
序列表
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所
<120>甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFPl基因序列
<160>2
<210>1
<211>1008
<212>RNA
<213>甘蔗(&3Cc/Z(3rWW Oj^ C/W(37"MOT丄.)
<220>
<221>3'UTp
<222> (643) ... (1008) <220>
<221>5，UTp
<222> (1)…(126)
<220>
<221>CDS
<222> (127) ... (642) <220>
<221>PolyA site
<222> (984) ... (1008) <400>1
acgcggggcc gtttcgaagc ccgccgaatt ccctgcgatt cctctcccct cgcctcctcg 60 tcttccccta ggggatcgcc ggagaggaat cgcaaagagg gccgtctcat ccgagttaag 120
gaagcc atg gag cac aag gag act gga tgc cag gcc cct gag gga 165 Met Glu His Lys Glu Thr Gly Cys Gin Ala Pro Glu Gly 1 5 10
ccc ate ctt tgc ate aat aac tgc ggc ttc ttc gga age gca get 210 Pro lie Leu Cys lie Asn Asn Cys Gly Phe Phe Gly Ser Ala Ala 14 19 24
acc atg aac atg tgc tec aag tgc cac aag gag atg ata atg aag 255 Thr Met Asn Met Cys Ser Lys Cys His Lys Glu Met lie Met Lys 29 34 39
cag gag cag gcc aag ctg get gcc tec tct ate gac age ate gtc 300 Gin Glu Gin Ala Lys Leu Ala Ala Ser Ser lie Asp Ser lie Val 44 49 54
aat ggc aac gat get gtc atg gaa cca gtt gtt tct ggc aac aca 345 Asn Gly Asn Asp Ala Val Met Glu Pro Val Val Ser Gly Asn Thr 59 64 69
gtg gt3 3Ct gtt get C33 gtC g3g ttg C33 3tg gtg C3g 390
Val Val Thr Val Ala Gin Val Glu Leu Gin Thr Met Asn Val Gin 74 79 84
ccc act gat gtt gcg gga cct age gag ggg gcg gca gtg ate tec 435
Pro Thr Asp Val Ala Gly Pro Ser Glu Gly Ala Ala Val lie Ser 8994 99
aaa ggg aag gta ggg ccg aac egg tgc age act tgc agg aag agg 480
Lys Gly Lys Val Gly Pro Asn Arg Cys Ser Thr Cys Arg Lys Arg 104 109 114
gtt gga ctt aca gga ttc aac tgc egg tgt ggg aac ttg tat tgt 525
Val Gly Leu Thr Gly Phe Asn Cys Arg Cys Gly Asn Leu Tyr Cys
119 124 129
gca etc cac cgc tac tec gac aag cat gac tgc aag ttc gac tat 570 Ala Leu His ARG Tyr Ser Asp Lys His Asp Cys Lys Phe Asp Tyr 134 139 144
egg act get get agg gat gcc att gcc aag get aat cca gtg gtg 615 Arg Thr Ala Ala ARG Asp Ala lie Ala Lys Ala Asn Pro Val Val
149 154 159
aag gcg gac aaa etc gac aag ate tag ggtttcctac ggttggctca 662 Lys Ala Asp Hys Leu Asp Lys lie 164 169
aggaagattg caacctgtgg tacttcttca tcatgcggaa ttgctgcttt gcccatgcct 722
ttccctttca tgtttgctgc tacaatcttg ttcggcattg cagtgcgtgg tgcacacttc 782
cgcagcctgc ctcsagaatt cttctcgcct ctgcatctgg tcagttcasa tgatttgcat 842
gttggctatg ttgtgtaagc ttttatttat ggtcgtctcg etcagaeggt atttggcttc 902
gcatttagct agctatgtga tgtactattg tccctggtgt gttacactgc aaccagtaat 962
吗taagctgc aactgtccgt caaaaaaa犯aa咖aaaaa a犯aaa 1008
<210> 2 <211>171 <212> PRT
<213>甘庶(Sacc/zorw/w q^cz'warww丄.) <400> 2
Met Glu His Lys Glu Thr Gly 1 6 Leu Cys lie Asn Asn Cys Gly 16 21 Asn Met Cys Ser Lys Cys His 31 36 Gin Ala Lys Leu Ala Ala Ser 46 51 Asn Asp Ala Val Met Glu Pro
12
Cys Gin Ala Pro Glu Gly Pro lie 12
Phe Phe Gly Ser Ala Ala Thr Met 27
Lys Glu Met lie Met Lys Gin Glu 42
Ser lie Asp Ser lie Val Asn Gly 57
Val Val Ser Gly Asn Thr Val Val
616672
ThrVal Ala Gin Val Glu Leu Gin Thr Met AsnValGin Pro Thr
768187
AspVal Ala Gly Pro Ser Glu Gly Ala Ala VallieSer Lys Gly
91恥102
LysVal Gly Pro Asn Arg Cys Ser Thr Cys Arg LysArg Val Gly
106111117
LeuThr Gly Phe Asn Cys Arg Cys Gly Asn LeuTyrCys Ala Leu
121126132
HisARG Tyr Ser Asp Lys His Asp Cys Lys PheAspTyr Arg Thr
136141147
AlaAla ARG Asp Ala lie Ala Lys Ala Asn ProValVal Lys Ala
151156162
AspLys Leu Asp Lys lie
166m
权利要求
1、一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，其特征在于其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、 一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFPl基因序列，其特征 在于其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
全文摘要
本发明公开了一种甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白ShZFP1基因序列，是以近源物种水分胁迫相关锌指蛋白基因CDS序列的保守区设计简并引物，从受干旱处理的甘蔗组织中提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到甘蔗受水胁迫相关的锌指蛋白(ShZFP1)基因的全长表达序列。本发明为研究甘蔗水分胁迫相关锌指蛋白基因在抗旱反应中的作用，进而为探讨甘蔗抗旱发生机理及为甘蔗抗旱性遗传改良的研究奠定基础。
文档编号C07K14/415GK101381729SQ20081010907
公开日2009年3月11日 申请日期2008年5月22日 优先权日2008年5月22日
发明者张树珍, 杨本鹏, 蔡文伟, 萍 陈 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所