一种扩增链霉菌的pcr引物及检测链霉菌的方法及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明涉及微生物领域，公开了一对用于扩增链霉菌DNA的PCR引物，其上游引物序列如SEQ?ID?No.1所示，下游引物序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明还提供检测链霉菌的方法及试剂盒。本发明所述引物适合于纯化链霉菌扩增DNA，也适合于从混合菌群扩增链霉菌DNA，扩增链霉菌安全、准确、快速、稳定，特异性强，灵敏度高。
【专利说明】一种扩增链霉菌的PCR引物及检测链霉菌的方法及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物领域，具体涉及一种用于扩增链霉菌的PCR引物及检测链霉菌的方法及试剂盒。
【背景技术】
[0002]链霉菌属属于放线菌目的一科，链霉菌广泛存在于土壤中。由于链霉菌属的菌种数最多，分类鉴定比较困难，一般认为孢子丝的形状、孢子的表面结构、孢子的颜色和在有机培养基内是否产生类黑色素是最主要的分类指征。链霉菌大多在人工培养基上生长茂盛，少数是植物致病菌，但在液体培养基中由于其产生的抗生素能抑制链霉菌的生长，因此一般不用液体培养基进行培养分离。
[0003]链霉菌具有重要的应用价值，其中许多种是抗生素(如链霉素)的产生菌而且产生抗生素的种类最多而著名，代表种为白色链霉菌。另外链霉菌能降解及利用一些环境污染物及有机物，比如含氮杂环化合物和原油，因此链霉菌日益受到人们的关注。
[0004]现有技术中，有如下两种常用的对链霉菌进行鉴定的方法:
[0005]1、生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法，此方法需要得到菌株的纯培养物，且实验周期长，实验结果受人为观察影响因素较大，准确性不高。
[0006]2、提取菌株DNA进行测序。目前是用16SrRNA基因引物进行PCR扩增，将扩增出的DNA片段进行测序。此方 法结果比较准确。但仍需要得到菌株的纯培养物，无法从混合样品中快速鉴定是否含有链霉菌。目前本领域迫切需要开发出一种能够快速、准确判定链霉菌的方法。
【发明内容】
[0007]本发明针对现有技术鉴定链霉菌试验周期长、适用范围窄的不足，提供一种能够快速、准确、方便，可对混合样品如土壤、海底沉积物、水中是否含有链霉菌进行快速判定的方法。
[0008]为了实现上述目的，本申请的发明人设计了一对针对链霉菌16SrDNA基因部分片段的 PCR 引物，设计简并引物:Str-F:5，-GGGTCTAATACCGGATA-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)，Str-R:5，-CCGTCGTCGCCTTGGT-3，(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0009]所述16S rDNA基因是指基因组中编码16S核糖体RNA (rRNA)分子的对应的DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因。本发明所述引物的16S rDNA目的基因具体如下:
[0010]TCCAGTAAAGTGACGTATTACCATGCAGTCGACGATGAACCA CTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCA ATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATA CCGGATAACACTTCCACTCGCATGGGTGGAGGTTAAAAGCTCCGG CGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAA TGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGAC CGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGC GACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTC AGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGC CGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAA GCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTCTG TCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATT CGATACGGGCAGACTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTG GTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGC GAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGC GTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC
GCCGTAA acggtgggaactaggtgttggcgacattccacgtcgtcggtgccg cagctaacgcattaagttccccg
CCTGGGGGAGTACGGCCGCAAG GCTAAAACTCAAGAGAATTGGGAACGGGAA (如 SEQ ID N0.3 所示)。
[0011]本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3'端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。
[0012]本发明还提供一种检测链霉菌的试剂盒，包含用于扩增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]本发明提供一种检测链霉菌的方法，包含以下步骤:
[0014]步骤1:配制PCR反应体系，94°C预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72°C延伸10分钟；所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如 SEQ ID N0.2 所示； [0015]步骤2:检测扩增结果并进行测序比对。
[0016]作为优选，步骤I所述PCR循环参数为:94°C变性lmin、54°C复性lmin、72°C延伸lmin。
[0017]作为优选，步骤I中所述PCR反应体系为:
[0018]PCR 缓冲液:5 μ L
[0019]dNTP: 4 μ L
[0020]Primer F 上游引物:1μ?
[0021]Primer R 下游引物:1 μ L
[0022]样品DNA:lyL
[0023]Taq:0.5μ L
[0024]ddH20:37.5 μ L
[0025]其中，样品DNA浓度为10-200ng/yL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μ L0
[0026]作为优选，步骤2所述检测为琼脂糖电泳检测230bp的条带出现。
[0027]本发明与现有的技术相比具有如下有益效果:
[0028]1.本发明所述的链霉菌属检测方法，操作简单，耗时少，结果更精确。
[0029]2.本发明所设计的引物目标位于16S rDNA基因，该基因在进化中较为保守，是分类学研究中常用的研究对象，具有较好的特异性。
[0030]3.本发明试验周期短，能在3小时内得出结果、适用范围广，无需分离纯菌株即可对各种环境样品中是否含有链霉菌属细菌进行检测。
【专利附图】
【附图说明】[0031]图1为本发明所述引物以混合菌株DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；
[0032]图2为本发明所述引物以土壤DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1_4分别为不同土壤的DNA样品；
[0033]图3为本发明所述引物以混合菌株DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；其中泳道I和泳道2为同一 DNA样品；
[0034]图4为本发明所述引物以链霉菌DNA配制的梯度浓度的DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1-6中所含DNA含量分别为200ng，200X 10 —1IigdOOX 10 —2ng、200 X 10 — 3ng、200 X 10 — 4ng、200 X 10 — 5ng。
【具体实施方式】
[0035]本发明公开了一种用于扩增链霉菌的PCR引物及检测链霉菌的方法及试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0036]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0037]实施例1:以纯培养物基因组DNA为模板用本发明所述引物进行PCR扩增
[0038]步骤1:选取含有链霉菌的混合菌培养物，提取其基因组DNA。提取方法参照TAKARA公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，得到混合菌的基因组DNA.[0039]步骤2:以步骤I得到的DNA为模板，配制为100_200ng/ μ L的DNA样品，与10-20pmol/μ L的PCR引物配成如下50 μ L反应体系，进行PCR扩增反应:
[0040]PCR buffer:5 μ L
[0041]dNTP:4μ L
[0042]Primer F 上游引物:1 μ L
[0043]Primer R 下游引物:I μ L
[0044]DNA: I μ L
[0045]Taq:0.5 μ L
[0046]ddH20:37.5 μ L
[0047]步骤3:按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:[0048]I预变性94eC 10分钟
2变性 94°C I分钟
3复性 54eC I分钟
4延伸 72°C I分钟
2至4循环30次
5延伸 72iC IO分钟
[0049]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0050]步骤4:电泳观察。取出PCR终产物5 μ L与I μ L上样缓冲液混合，80V, 1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图1所示，其中，泳道M为marker，泳道I为含有链霉菌的混合菌DNA样品，可见泳道I特异扩增出230bp的条带。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的230bp条带即为引物设计时链霉菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示；230bp条带为目标基因片段。
[0051 ] 实施例2:以土壤细菌基因组DNA为模板进行PCR扩增
[0052]步骤1:取I至2克土壤样品，提取其微生物总DNA。提取方法参照DNA Recoveryfrom Soils of Diverse Composition (JIZH0NG ZHOU, 1996),得到土壤总 DNA 溶液。
[0053]步骤2:以步骤I得到的DNA为模板，配制为100_200ng/ μ L的DNA样品，与10-20pmol/μ L的PCR引物配成如下50 μ L反应体系，进行PCR扩增反应:
[0054]PCR buffer:5 μ L
[0055]dNTP:4μ L`
[0056]Primer F 上游引物:1 μ L
[0057]Primer R 下游引物:I μ` L
[0058]DNA: I μ L
[0059]Taq:0.5 μ L
[0060]ddH20:37.5 μ L
[0061]步骤3:按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:
[0062]
I预变性94? 10分钟
2变性 94t I分钟
3复性 54°C I分钟
4延伸 IYC I分钟
2至4循环30次
5延伸 72 O 10分钟
[0063]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)[0064]步骤4:电泳观察。取出PCR终产物5 μ L与I μ L上样缓冲液混合，80V, 1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察，结果见图2所示，其中，泳道M为marker，泳道1-4为土壤样品。可见泳道I和泳道3可特异性扩增出230bp的条带，泳道2和泳道4未有目标条带出现。将扩增出的条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的230bp条带即为引物设计时链霉菌属的目标基因片段，其序列如SEQ ID N0.3所示，为链霉菌DNA扩增产物。则据此判定泳道I和泳道3的土壤样品含有链霉菌，泳道2和泳道4的土壤样品则不含有红球菌。
[0065]对泳道1-4的样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果—致。
[0066]实施例3:本发明所述引物扩增链霉菌DNA的稳定性试验
[0067]参照实施例1和实施例2，选取含有链霉菌的混合菌株纯培养物，提取其基因组DNA。
[0068]步骤2:以步骤I得到的DNA为模板，配制为100_200ng/ μ L的DNA样品，与10-20pmol/μ L的PCR引物配成如下50 μ L反应体系，进行PCR扩增反应:
[0069]PCR buffer:5 μ L
[0070]dNTP:4μ L
[0071]Primer F 上游引物:1 μ L
[0072]Primer R 下游引物:I μ L
[0073]DNA: I μ L
[0074]Taq:0.5μ L
[0075]ddH20:37.5μ L
[0076]步骤3:按照上述体系混合之后，将PCR管放入PCR仪器进行扩增。PCR程序如下:
[0077]
I预变性WC IO分舞
[0078]
2变性 940C I分钟
3复性 54°C I分钟
4延伸 72°C I分钟
2至4循环30次
5延伸 72°C 10分钟
[0079]PCR 酶采用的是 Taq 酶(TAKARA)
[0080]步骤4:电泳观察。取出PCR终产物5 μ L与I μ L上样缓冲液混合，80V, 1%琼脂糖凝胶电泳30分钟，在凝胶电泳成像仪下紫外观察。结果见图3所示，其中，泳道M为marker，泳道I和2为同一混合菌基因组DNA样品。可见泳道I和泳道2均可特异性扩增出230bp的条带。将扩增出的条带回收后进行测序。将扩增出的230bp条带回收后进行测序。测序结果表明，所扩增的230bp条带为引物设计时链霉菌属的目标基因片段，其序列如SEQ IDN0.3所示，为链霉菌DNA扩增产物。对样品进行培养鉴定，与用本发明所述引物进行PCR扩增的鉴定结果一致。说明本发明所述引物扩增链霉菌DNA重复性好，结果稳定。
[0081]实施例4:本发明所述引物扩增链霉菌DNA的灵敏度试验
[0082]取纯化的链霉菌基因组DNA配制梯度浓度的DNA溶液，原液所含DNA为200ng，依次稀释为 DNA 浓度为 200 X 10 — Sg、200 X 10 — 2ng、200 X 10 — 3ng、200 X 10 — 4ng、200 X 10 —5ng,参照实施例1所述方法进行PCR扩增，取扩增产物进行凝胶电泳，结果可见在DNA含量在200X 10 —3ng处，仍可扩增出450bp目的条带，而DNA含量在200X 10 —4ng和200 X 10 一5ng处，无任何条带出现，说明在DNA模板含量为200 X 10 — 3ng时，引物仍可准确扩增出红球菌目标条带，灵敏度闻。
[0083]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范 围。
【权利要求】
1.一对扩增链霉菌DNA的PCR引物，其特征在于，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
2.一种检测链霉菌的试剂盒，其特征在于，包含用于扩增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQ ID N0.2所示。
3.—种检测链霉菌的方法，包含以下步骤: 步骤1:配制PCR反应体系，94°C预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72°C延伸10分钟；所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID N0.1所示，下游引物序列如SEQID N0.2 所示； 步骤2:检测扩增结果并进行测序比对。
4.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤I所述PCR循环参数为:94°C变性lmin、54°C复性 lmin、72°C延伸 lmin。
5.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤I中所述PCR反应体系为: PCR缓冲液:5 μ L
dNTP:4y L
上游引物:luL
下游引物:I μ L
样品 DNA:lyL
Taq:0.5 μ L
ddH20:37.5 μ L 其中，样品DNA浓度为lOIOOng/yL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μ L。
6.根据权利要求3的方法，其特征在于，步骤2所述检测为琼脂糖电泳检测230bp的条带出现。
【文档编号】C12Q1/04GK103667461SQ201310606951
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月25日 优先权日:2013年11月25日
【发明者】郝纯, 邓诗财, 梅海, 李雪 申请人:盎亿泰地质微生物技术（北京）有限公司