一种用于检测牛gart突变基因型的引物对和检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学，具体地说，涉及一种用于检测牛GART突变基因型的引物 对和检测方法。
【背景技术】
[0002] 近几十年来，奶牛群体改良成效显著，通过对产奶性能的高强度选择，奶牛的产奶 量、乳脂率、乳蛋白率等经济性状都得到了大幅提高。然而，人们在育种过程中对种公牛的 选择总是局限在一部分优秀家系，导致奶牛的基因库在逐渐缩小。同时，人工授精技术的广 泛使用，不仅使奶牛群体的近交程度不断增加，而且使群体内遗传缺陷基因快速扩散的风 险也随之增大。自上世纪90年代以来，先后有多种遗传缺陷被报道，包括脊椎畸形综合征 (CVM)、白细胞黏附缺陷（BLAD)、短脊柱综合征（BY)、遗传缺陷单倍型（HH1、HH2、HH3)等。 这些缺陷基因呈隐性遗传模式，携带者表现正常，但如果缺陷等位基因纯合，将造成胚胎早 期死亡、发育畸形、母牛流产或者死胎等，给奶牛养殖带来严重经济损失。因此，必须建立 准确的检测手段，在群体中筛查遗传缺陷基因的携带者，通过逐步淘汰携带者，降低群体频 率；同时，实施科学选配方案，避免携带者之间交配，从而防止出现遗传缺陷的纯合子。
[0003] 2013年，法国科学家Fritz等报道荷斯坦品种奶牛中存在一种隐性致死遗传缺 陷单倍型，命名为HH4,该单倍型纯合后，导致母牛因胚胎早期死亡而流产。统计分析发 现，该遗传缺陷在法国荷斯坦牛群中的频率为3.6%。HH4的分子机理为，1号染色体的 GART(GlycinAmideRibonucleotideTransformylaseprotein，甘氨酰胺转甲酰基酶）基 因编码区内的A/C突变，导致编码氨基酸从天冬酰胺突变为苏氨酸。由于GART在嘌呤的生 物合成中起关键作用，发生突变后GART功能丧失，最终导致胚胎在妊娠早期死亡。
[0004]Fritz等（2013)报道了基于SNP单倍型的HH4检测方法。该方法需要首先对待检 样本进行SNP芯片检测，然后通过统计学方法推断单倍型，进而判定个体携带HH4的概率。 此方法不仅因依赖芯片检测而成本很高，同时还需事先建立参考群体的基因型数据库。
[0005] 因此，亟需一种操作简单、准确高效筛查牛GART突变型等位基因携带者的分子检 测方法。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种用于检测牛GART突 变基因型的引物对和检测方法。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于检测牛GART突变基因型的引物 对，所述引物对具体为：
[0008]上游引物GART-F:5 ' -GAAGGTGTCCTCTATGCTGG-3 ' ；
[0009]下游引物GART-R:5 ' -TITTAAGAAGTGGGAGGATC-3 '。
[0010] 本发明还提供了一种检测牛GART突变基因型的方法，所述方法包括以下步骤：
[0011] 1)PCR扩增：以待测样本基因组DNA为模板，利用前述引物对进行PCR扩增，得到 PCR扩增产物；
[0012] 2)扩增产物酶切：用限制性内切酶MseI对PCR扩增产物进行酶切消化，得到酶 切产物；
[0013] 3)电泳检测：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察酶切产物的电泳条带， 判断待测样本的基因型。
[0014] 进一步地，通过观察酶切产物的电泳条带是否存在长度为117bp的条带，判断待 测样本是否为突变基因型。
[0015] 进一步地，PCR反应体系以25yL计为：
[0018] 进一步地，PCR反应条件为：95°C预变性8min;95°C变性30sec，60°C退火30sec， 72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸lOmin。
[0019] 进一步地，酶切反应体系以20yL计为：
[0021] 进一步地，酶切反应条件为：在水浴锅中37°C消化2小时。
[0022] 进一步地，所述扩增产物在进行酶切之前，利用凝胶电泳检测长度为276bp的条 带存在。该条带即为PCR扩增产物片段。
[0023] 牛GART基因隐性有害突变携带者部分测序结果见图1，上述PCR扩增产物片段的 野生型等位基因有3个MseI酶切位点（见图2)，可进行酶切反应将276bp的片段切为4 个片段，即154bp、59bp、58bp和5bp;突变型等位基因，由于A-C突变，导致1个酶切位点 消失，从而只产生3个片段（154bp、117bp和5bp)。因此通过观察酶切产物是否存在117bp 条带，即可筛查突变型等位基因的携带者。
[0024] 理论上，野生型纯合子酶切后产生4个片段，S卩154bp、59bp、58bp和5bp;突变型 携带者酶切后有5个片段，即154bp、117bp、59bp、58bp和5bp。但由于琼脂糖凝胶电泳分辨 率较低，在胶图上无法清晰地观察到5bp片段；同时，相差只有lbp的58bp片段与59bp片 段，在琼脂糖凝胶上也无法分开。因此，通过胶图，野生型纯合子能呈现较清晰的2条带，即 154bp，58bp/59bp;而突变型携带者除了这2条之外，还有117bp条带。突变型纯合子的胚 胎不可存活，在妊娠期流产，因此试验中不会观察到突变型纯合子的基因型。
[0025] 所述基因组DNA米用尚盐法从牛冻精中提取。
[0026] 本发明还提供了一种含有前述引物对的试剂盒。
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] 本发明设计了基于聚合酶链式反应一限制性酶切多态性技术（PCR-RFLP)的GART 基因隐性致死突变的分子检测方法。该方法使用PCR仪、电泳仪、紫外凝胶成像系统等常规 仪器设备，操作简单，成本低廉；同时，所设计引物扩增效率好，扩增产物及酶切片段的琼脂 糖电泳分离后，条带判定清晰，结果准确可靠，适用于大规模的应用。
[0029] 本发明所设计的引物除了能够扩增牛GART基因的目的突变位点外，所扩增片段 内还包含另外2个相同的酶切位点，能够避免因酶切不完全或酶切反应失败而导致的假阳 性，从而确保检测的准确性。
【附图说明】
[0030] 图1为牛GART基因隐性有害突变携带者部分测序结果。箭头处为突变位点（A/C 突变）。该突变的基因组物理位置为牛1号染色体的第1277227位（牛UMD3. 1基因组图 谱http://www.ensembl.org)〇
[0031] 图2为本发明所用引物及酶切位点在牛GART基因序列上的位置（DNA序列来源于 牛UMD3.1基因组图谱http://www.ensembl.org)。下划线显示引物所在位置，阴影处为 MseI内切酶识别序列；第一个酶切位点是GART基因隐性有害突变位点的野生型序列，如 果是突变型等位基因（即TTAA-TTAC)，则该酶切位点消失。
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