一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种细胞的固定化方法，特别涉及一种含葡萄糖异构酶细胞的固定化 方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 葡萄糖异构酶（Glucoseisomerase，GI)，又称木糖异构酶，可以催化D-葡萄糖生 成D-果糖，是食品工业中以淀粉为原料生产高果糖衆（Highfructosecornsyrup，HFCS) 的关键酶之一。HFCS是一种天然食品添加剂（甜味剂），被广泛应用于食品、饮料行业。每 年，世界上生产的HFCS就有千万吨，人们对HFCS日益增长的需求和HFCS产业的蓬勃发 展，推动了对GI的深入研宄和固定化GI技术的飞速发展。何家明等（何家明等，申请号 85100412)用大孔强碱性苯乙烯系季氨基阴离子交换树脂吸附发酵液中的酶，制备固定化 GI。曹龙奎等（曹龙奎等，申请号200910073264. 9)利用磁性壳聚糖复合微球制备固定化 GI;吴敬等（吴敬等，申请号201210581801. 2)利用壳聚糖絮凝菌体，戊二醛交联絮凝物的 方法制备固定化GI。
[0003] 目前，Genencor/DuPont和NovozymesA/S两家公司生产的固定化GI酶制剂占据 市场的主导地位，其固定化方法均是使用戊二醛交联细胞的方法。NovozymesA/S是使用戊 二醛交联勾楽?细胞，结合使用阳离子絮凝剂（如壳聚糖）、无机载体；Genencor/DuPont使用 聚乙稀亚胺和戊二醛结合，并混合无机载体如膨润土、高岭土、娃藻土等。他们制备的固定 化GI性质十分稳定，在工业生产条件下，可以使用半年到一年之久。我国固定化GI完全依 赖进口，造成我国HFCS生产成本过高，竞争力减弱。
[0004] 在生产HFCS转化率较低，只能获得果糖浓度为42%的HFCS，想要得到高果糖浓度 的糖浆只有经过分离浓缩。异构化反应平衡随温度升高向果糖方向移动，如果GI在90~ 95°C依然稳定，则有可能直接生成果糖浓度为55%HFCS。
[0005] 因此，研宄一种成本低，在高温条件下转化率高、热稳定性好且可实现工业化生产 的GI的固定化方法具有非常重要的现实意义。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于克服GI催化生产高果糖浆转化率低等问题，提供了一种提高果 糖转化率的含GI细胞的固定化颗粒及固定化方法。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种含葡萄糖异构酶（GI)细胞的固定化方法，所述方法为：将含GI基 因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体加入缓冲液中，制成菌悬液；向菌悬液中添 加硅藻土，搅拌混匀，再加入聚乙烯亚胺，然后加入戊二醛进行交联，0~30°C(优选20~ 25°C)搅拌交联1~2h后，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤后用轴向挤压机挤压成长条状，室温风 干后，粉碎成粒（优选粒径为〇. 5~2_)，得含GI细胞的固定化颗粒；所述硅藻土与菌悬 液中湿菌体重量比为0. 01~0. 1 :1。
[0009] 进一步，所述GI基因的核苷酸序列为SEQIDNO. 1所示，编码蛋白的氨基酸序列 为SEQIDNO. 2 所示。
[0010] 进一步，所述缓冲液为pH= 6. 0 ~7. 5、50mMNa2HP04_NaH2P04缓冲液或pH= 6. 0 ~7. 5、50mMTris-HCl缓冲液。
[0011] 进一步，所述缓冲液体积用量以湿菌体湿重计为5~15mL/g。
[0012] 进一步，所述戊二醛以体积浓度25% (v/v)戊二醛水溶液形式加入，所述25% (v/ v)戊二醛水溶液体积用量以湿菌体重量计为0. 05~0. 3mL/g(优选0. 05mL/g)。
[0013] 进一步，所述聚乙烯亚胺以体积浓度10% (v/v)聚乙烯亚胺水溶液形式加入，所 述10 % (v/v)聚乙烯亚胺水溶液体积用量以湿菌体重量计为0. 1~0. 7mL/g(优选0. 2mL/ g)，本发明所述聚乙烯亚胺分子量70000,聚合度1600。
[0014] 进一步，所述重组基因工程菌构建方法为：将SEQIDNO. 1所示GI基因与PGEM-T 载体连接后导入E.coliJM109中，提取连接质粒并与质粒pET28b(+)-Nit进行双酶切 后，连接过夜，将连接产物导入宿主E.coliBL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI。
[0015] 进一步，所述湿菌体的制备方法为：
[0016] (1)将含GI基因的重组基因工程菌接种至斜面培养基，37°C培养12h，获得斜面菌 体；斜面培养基组成为：l〇g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/L琼脂，溶剂为去离 子水，pH自然。
[0017] (2)将斜面菌体接种至种子培养基，37°C培养8h，获得种子液；种子培养基组成： 10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水，pH自然。
[0018] (3)将种子液以体积浓度2%接种量接种至发酵培养基，37°C、400rpm条件下培养 3. 5h，然后加入终浓度10g/L乳糖诱导剂，在30°C、400rpm条件下诱导12h，取发酵液离心， 收集湿菌体；发酵培养基组成：甘油l〇g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl10g/L，KH2P04 1.36g/L，K2HP04 2.28g/L，MgS04 0 . 3 7 5g/L，（NH4)2S04 5g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。
[0019] 本发明所述重组基因工程菌最优选在85°C下果糖转化率为55%的产耐热GI的重 组大肠杆菌E.coliBL21 (DE3)/pET-28b-TEGI，所述重组大肠杆菌是以E.coliBL21 (DE3) 为宿主，引入嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus的耐热GI基因（核苷酸 序列为SEQIDNO. 1所示，氨基酸序列为SEQIDNO. 2所示）构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-TEGI(郑裕国等：葡萄糖异构酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用，专 利申请号 201410484596)。
[0020] 本发明所述硅藻土分子式为Si02，分子量为60. 08,中位粒径19. 6ym，比重0. 32 能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，优选购自阿拉丁公司。
[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
[0022] 本发明所述GI的固定化方法简单易操作，经济实用。用该法制备的固定化GI，机 械强度满足填充床使用的要求，在85°C条件下催化葡萄糖生成果糖，转化率高达54%，重 复使用10批，仍有90%的残余酶活，室温保存30天后，酶活没有明显变化。 (四）【附图说明】
[0023]图1为固定化葡萄糖异构酶的制备过程图，a交联的菌体，b抽滤后的滤饼，c挤压 成型，d干燥后的颗粒。 (五）【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0025] 本发明实施例所用娃藻土分子式为Si02，分子量为60. 08,中位粒径19. 6ym，比重 〇. 32能吸收大于本身4倍的水；溶于浓碱和氢氟酸，不溶于水、酸或稀碱，购自阿拉丁公司。
[0026] 实施例1重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3) /pET-28b-TEGI的构建及湿菌体的制备 及性能测定
[0027] 以本实验室构建的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET-28b-TEGI为生产菌种， 方法为：
[0028] (1)重组菌的构建：将嗜热厌氧乙醇菌Thermoanaerobacterethanolicus的耐热 GI基因TEGI(核苷酸序列为SEQIDNO. 1所示，已在中国专利201410484596中公开）与 PGEM-T载体进行连接后导入E.coliJM109中，对TEGI/PGEM-T和质粒pET28b(+)-Nit进行 双酶切，连接酶连接过夜，将连接产物pET28b(+)-TEGI导入宿主E.coliBL21(DE3)中，获 得重组大肠杆菌E.coliBL21(DE3)/pET28b(+)-TEGI。
[0029]PGEM-T载体连接条件为：10yL连接体系在PCR管中依次加入2XBuffer5yL， T4连接酶1yL，GI目的基因3yL，PGEM-T载体1yL;振荡器上充分混匀后16°C条件下连 接过夜。
[0030] 双酶切体系：首先对目的基因进行双酶切，60yL双酶切体系在PCR管中依次加入 GI目的基因 40yL，2XBufferTango12yL，NcoIlyL，XhoIlyL，ddH20 6yL，振荡 器上充分混匀；然后对表达载体进行双酶切，60yL双酶切体系在PCR管中依次加入pET28b 40yL，2XBufferTango12yL，NcoIlyL，XhoIlyL，ddH20 6yL，振荡器上充分混匀； 分别将其放在37°C，200rpm条件下酶切4~5h。
[0031] (2)湿菌体的制备
[0032] 将重组大肠杆菌E.coliBL21 (DE3) /pET28b(+) -TEGI接种至斜面培养基，37°C培 养12h，获得斜面菌体；斜面培养基组成为：10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，20g/ L琼脂，溶剂为去离子水，pH自然；将斜面菌体接种至种子培养基，37°C培养8h，获得种子 液；种子培养基组成：l〇g/L蛋白胨，10g/L氯化钠，5g/L酵母粉，溶剂为去离子水，pH自然。
[0033]将种子液以体积浓度2%接种量接种至发酵培养基，37 °C，150rpm条件下培养 3. 5h，然后在30°C，400rpm条件下，添加终浓度10g/L乳糖诱导12h，取发酵液离心，收集 湿菌体；发酵培养基组成：甘油l〇g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，KH2P04 1.36g/L，K2HP04 2.28g/L，MgS04 0 . 3 7 5g/L，（NH4)2S04 5g/L，溶剂为去离子水，pH 7.0。
[0034] 实施例2
[0035] (1)取实施例1方法获得的湿菌体，按菌体湿重：Tris-HCl缓冲液（pH= 7. 5， 50mM) =l:10(m/v)混合，S卩取10g湿菌体加入100mLTris-HCl缓冲液中制成100mL菌悬 液。
[0036] (2)向步骤（1) 100mL菌悬液中添加0? 6g娃藻土，磁力搅拌器上混合均勾，再与 3mL浓度为10% (v/v)的聚乙烯亚胺水溶液，然后加入lmL浓度为25% (v/v)的戊二醛水 溶液，20°C交联2h后，反应液抽滤