一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自 小球藻（Chlorellavariabilis)的磷酸甘露糖异构酶基因ChloPMI的分离和克隆；含有 ChloPMI的原核表达载体的构建及其在ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性鉴定方面的应用；含 有ChloPMI的植物表达载体的构建，以及以ChloPMI为筛选标记，在植物遗传转化方面的应 用。
【背景技术】
[0002] 转基因技术，是20世纪80年代初发展起来的一种有效的植物定向改良方法。该 技术主要通过农杆菌介导、基因枪转化等方法将目的基因导入受体，经过标记筛选和分子 检测，获得稳定表达的转化体，实现目标性状的快速定向改良，具有可用基因资源广、改良 效率高等优点。转基因技术为农作物的产量提升、品质改良和抗性增强提供了新路径、开拓 了新空间。
[0003] 转基因食品对人类健康所引起的一个主要安全问题是抗生素标记基因。现有转基 因技术，主要使用抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基因一起 转入目标作物中，用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。标记 基因本身并无安全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道，存在与肠道微生物基因交换 产生耐药菌株的潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。为了替代抗生素抗性基因，其他类 型筛选标记基因被陆续研宄开发，如除草剂抗性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因 等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题，要么筛选效率和成本不适于规模化应用。
[0004] 而磷酸甘露糖异构酶是一种糖代谢基因。水稻等高等植物细胞虽能将甘露糖转化 为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸甘露糖异构酶，不能进一步将6-磷酸甘露糖转 化为6-磷酸果糖，从而进入糖酵解途径而被利用，因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标 记基因。与抗生素、除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露 糖异构酶，可以利用甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率高。同时，磷酸甘露糖异构酶的催 化产物6-磷酸果糖，是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。
[0005] 但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，可能 对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧。
【发明内容】
[0006] 针对上述问题，本发明希望分离植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因。更具体而 言，本申请的发明人通过不断尝试，终于从小球藻（Chlorellavariabilis)中分离和克隆 除了磷酸甘露糖异构酶基因ChloPMI。另外，本发明还构建了含有ChloPMI的原核表达载 体，应用于鉴定ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性；构建了含有ChloPMI的植物表达载体，并以 ChloPMI作为筛选标记，应用于植物遗传转化。
[0007]具体而言，在第一个方面，本发明提供一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因， 该基因具有如SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。为了便于表示，本发明将其命名为ChloPMI。
[0008] 在第二个方面，本发明提供一种ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性的鉴定方法， 通过设计ChloPMI原核表达引物，经亚克隆获得融合GST(谷胱甘肽巯基转移酶， glutathione-S-transferase)片段的原核表达载体，并转入大肠杆菌表达菌株BL21，通过 苯酚红颜色反应鉴定ChloPMI的活性。
[0009] 在第三个方面，本发明提供一种含有所述ChloPMI基因的植物表达载体。构建方 法是利用XhoI酶切位点，用XhoI酶切pCAMBIA1381载体并回收，由于合成的ChloPMI序 列两端加有XhoI酶切位点，可以利用1\连接酶将ChloPMI连接到pCAMBIA1381载体，得 到植物表达载体pCAMBIA1381-ChloPMI。
[0010] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的ChloPMI基因。
[0011] 在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-ChloPMI表达载体，获得可以 甘露糖为碳源的水稻转化细胞的方法，包括下述步骤：
[0012] (1)将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈 伤组织；
[0013] (2)将次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基预培养；
[0014] (3)将步骤（2)中获得的愈伤组织与携带ChloPMI筛选标记基因的农杆菌接触15 分钟；
[0015] (4)将步骤（3)的愈伤组织转移到上垫上三张无菌滤纸（加入2. 5-3. 5mL农杆菌 悬浮培养基）的培养皿中，21-23°C培养48小时；
[0016] (5)将步骤⑷的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天；
[0017] (6)将步骤（5)的愈伤组织转移至含有甘露糖的筛选培养基上，以获得可利用甘 露糖为碳源的水稻抗性愈伤组织（水稻细胞）。
[0018]其中所述步骤（1)中的种子是成熟种子；所述步骤（1)、（2)中的诱导培养基是说 明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤（3)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在所述 农杆菌悬浮液中；所述步骤（4)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培养基； 所述步骤（5)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤（6)中的 筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基。
[0019] 在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻品种日本 晴。
[0020] 另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应 用包括利用所述ChloPMI基因作为筛选标记，参照上述方法获得植物转基因细胞，进而通 过植物转基因细胞获得转基因植物或植物部分。
[0021] 优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花丼作物、能源作物。
[0022] 优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。
[0023] 下面的表1中给出了在一种优选实现方式中，本发明所采用的培养基的示例性配 方。本领域技术人员应该理解，各培养基除了采用本发明的特殊配方之外，还可以采用普通 的培养基，其也能够实现本发明的目的，只是效果上存在一定差异。
[0024] 表1培养基的示例性配方
[0025]
【主权项】
1. 一种来自小球藻的磷酸甘露糖异构酶基因，所述磷酸甘露糖异构酶基因的核苷酸序 列如SEQ ID N0:1所示。
2. -种原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体包含权利要求1所述的磷酸甘 露糖异构酶基因。
3. -种用于鉴定所述磷酸甘露糖异构酶基因代谢甘露糖活性的原核鉴定方法，其特征 在于，所述鉴定方法包括：利用苯酚红颜色鉴定方法对包含权利要求1所述的磷酸甘露糖 异构酶基因或权利要求2所述的原核表达载体的表达菌株进行颜色鉴定。
4. 一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶 基因。
5. -种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包含权利要求1所述的磷酸甘 露糖异构酶基因或权利要求4所述的表达盒。
6. -种利用含有权利要求1中所述的磷酸甘露糖异构酶基因的植物表达载体 pCAMBIA1381-Chl 〇PMI，通过甘露糖筛选，获得水稻转化细胞的方法，包括下述步骤： (1) 将水稻种子去壳、灭菌后将胚分离出来，置于愈伤组织诱导培养基上以产生次级愈 伤组织； (2) 将所述次级愈伤组织转移至新的愈伤组织诱导培养基进行预培养，获得可用于转 化的愈伤组织； (3) 将步骤（2)中获得的愈伤组织与农杆菌接触15分钟，其中，所述农杆菌中引入了所 述植物表达载体，所述表达载体中携带所述磷酸甘露糖异构酶基因； (4) 将步骤（3)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中，21-23°C培养 48小时； (5) 将步骤（4)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养5-7天； (6) 将步骤（5)处理后的愈伤组织转移筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，即可代谢 甘露糖的水稻转化细胞。
7. -种权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因、权利要求4所述的表达盒、权利要求 5所述的植物表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述磷酸甘露糖异构酶基因 作为筛选标记，基于权利要求6中所述的方法，获得植物转化细胞，并利用所获得的植物转 化细胞获得转基因植物或植物部分。
8. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花丼 作物、能源作物。
9. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞 组织培养物、愈伤组织、细胞块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种 子。
【专利摘要】本发明提供了一种来自小球藻(Chlorella variabilis)的磷酸甘露糖异构酶基因，本文将其命名为ChloPMI。本发明还提供一种含有ChloPMI的原核表达载体，其可以用于鉴定ChloPMI蛋白代谢甘露糖活性。并且本发明提供一种含有ChloPMI的表达盒和一种植物表达载体，以及该表达盒和表达载体在植物遗传转化方面的应用。本发明利用ChloPMI基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。本发明从小球藻中成功分离和克隆出了植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，由于该磷酸甘露糖异构酶基因来源于小球藻，环境友好，对人类没有潜在危险，更加有利于转基因产品的推广利用，消除人们对转基因的疑虑。
【IPC分类】A01H5-00, C12N9-90, A01H5-06, C12N15-61, A01H5-10, C12N15-63, C12N15-82, A01H5-02, C12N5-10
【公开号】CN104531656
【申请号】CN201510002583
【发明人】李莉, 杨剑波, 魏鹏程, 李 浩, 杨亚春, 李娟
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月5日