水稻磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术和植物基因工程技术领域。具体而言，本发明涉及一种来自 水稻（Oryza sativa)的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2的分离和克隆及应用。
【背景技术】
[0002] 在转基因技术中人们常常使用标记基因来筛选转化细胞或组织。筛选标记基因的 潜在安全风险是目前公众对转基因技术担忧的一个重要方面。现有转基因技术，主要使用 抗生素抗性基因作为筛选标记。抗生素标记基因与插入的目的基因一起转入目标作物中， 用于帮助在植物遗传转化筛选和鉴定转化的细胞、组织和再生植株。标记基因本身并无安 全性问题。但该类基因可能随食物进入肠道，存在与肠道微生物基因交换产生耐药菌株的 潜在风险，以致影响抗生素的医用效果。因此，常用的筛选标记基因尤其是抗生素抗性基因 的使用往往对环境及植物体的生长发育产生不良影响，且影响基因多重转化。
[0003] 为了替代抗生素抗性基因，其他类型筛选标记基因被陆续研宄开发，如除草剂抗 性基因、氨基酸代谢筛选基因、可视标记基因等，但这些筛选标记基因要么存在类似问题， 要么筛选效率和成本不适于规模化应用。
[0004] 为避免对抗生素等传统筛选剂的依赖，降低抗生素抗性基因等筛选标记的潜在风 险，近年来一些安全性更好的筛选标记基因应用于转基因作物的研发，并取得了很好的效 果。如磷酸甘露糖异构酶（phosphate mannose isomerase，PMI)基因是一种糖代谢基因， 水稻等许多高等植物细胞虽能将甘露糖转化为6-磷酸甘露糖，但由于细胞自身缺乏磷酸 甘露糖异构酶，或者表达量很低，不能进一步将6-磷酸甘露糖转化为6-磷酸果糖，从而进 入糖酵解途径而被利用。因此磷酸甘露糖异构酶可以作为筛选标记基因。而且与抗生素、 除草剂等负选择不同，甘露糖是进行正选择，转化的细胞表达磷酸甘露糖异构酶，可以利用 甘露糖为碳源而正常生长，筛选效率较高。甘露糖广泛存在于海藻、蕨类等植物中，同时PMI 的催化产物6-磷酸果糖是蜂蜜和果浆的主要成份，二者都是环境友好的天然物质。因此 PMI基因是一种安全筛选标记，有效避免了抗生素、除草剂等抗性基因存在的潜在风险。目 前，PMI筛选标记基因已在水稻、小麦、玉米、马铃薯等作物中得到成功应用，在开发安全性 较好的转基因作物及其产品方面，具有广泛的应用前景。
[0005] 但现在广泛使用的磷酸甘露糖异构酶是从原核生物大肠杆菌中分离而来的，这是 因为目前人们还没有意识到从原核生物大肠杆菌中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转 化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全性的担忧，或者是人们对这种从原核生 物大肠杆菌中分离出的PMI的安全性没有引起足够的重视。因此，本领域有对安全性更好 的高等植物源PMI筛选标记基因的迫切需求，但目前还没有高等植物源的PMI筛选标记基 因的报道。
【发明内容】
[0006] 基于本申请的发明人在转基因领域多年的研宄经验，意识到从原核生物大肠杆菌 中分离出的磷酸甘露糖异构酶可能对转化受体基因组造成不利影响，还可能引发对其安全 性的担忧。
[0007] 针对目前使用的PMI筛选标记主要来自大肠杆菌而缺乏高度植物来源的PMI筛选 标记基因的现状，本发明希望获得高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，并以其为安全 的筛选标记基因进行植物遗传转化。出于该目的，本申请的发明人针对可能含有磷酸甘露 糖异构酶基因的不同植物，进行了大量植物提取实验和酶活分析，并最终从水稻中成功分 离、克隆了磷酸甘露糖异构酶基因〇sPMI2,并以其作为筛选标记基因，成功获得了转基因植 物。
[0008] 更具体而言，本发明提供一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因OSPMI2,其 特征在于，
[0009] 所述磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2能够在植物遗传转化过程中作为筛选标记。
[0010] 优选地，所述磷酸甘露糖异构酶基因OSPMI2的DNA序列与SEQ ID No:l所示的 DNA序列有至少90%同源性；
[0011] 或者，所述磷酸甘露糖异构酶基因〇sPMI2为在SEQIDN〇:l所示的DNA序列中添 加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；
[0012] 或者，所述磷酸甘露糖异构酶基因OSPMI2包含与SEQ ID No:l所示的DNA序列杂 交的产物。
[0013] 优选地，所述磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2的核苷酸序列如SEQIDNO:l所 示，优选地，在提取所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2时，所采用的引物为正向引物 5' -ATGGAGGACCCGCCGCCGCCGC-3'，反向引物 5' -TTAACTGAAGAATCTGCTGTIT-3'。
[0014] 另一方面，本发明还构建了含有OsPMI2的原核表达载体，应用于OsPMI2蛋白的酶 活分析。并且本发明构建了含有〇sPMI2的植物表达载体，并以其作为筛选标记，应用于植 物遗传转化。构建植物表达载体的方法是利用Xhol酶切位点，用XhoI酶切pCAMBIA1381 载体并回收大片段，由于克隆的0sPMI2序列两端加有Xhol酶切位点，可以利用T4连接酶 将0sPMI2连接到pCAMBIA1381载体上，得到植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI2。
[0015] 另一方面，本发明提供一种水稻磷酸甘露糖异构酶的酶活鉴定方法，通 过设计0sPMI2原核表达引物，经亚克隆获得融合GST (谷胱甘肽巯基转移酶， glutathione-S-transferase)片段的原核表达载体，并转入大肠杆菌表达菌株BL21，通过 两步偶联法鉴定酶活。
[0016] 另一方面，本发明提供一种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含上述的0sPMI2 基因。
[0017] 在另一个方面，本发明提供一种利用pCAMBIA1381-〇sPMI2表达载体，获得可以甘 露糖为碳源的水稻转化细胞的方法，包括下述步骤：
[0018] (1)利用植物种子以及愈伤组织诱导培养基制备相应的次级愈伤组织；
[0019] (2)对所述次级愈伤组织进行进一步预培养，获得能够用于转化的愈伤组织； [0020](3)利用所述的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2制备植物表达载体 pCAMBIA1381-〇sPMI2,其中，pCAMBIA1381 为现有植物载体；
[0021] (4)将所述植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI2转入根癌农杆菌中，并且将步骤 (2)中获得的愈伤组织与转入了所述植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI2的根癌农杆菌相 接触（优选15分钟）；
[0022] (5)将步骤（4)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中进行培养 (优选地，在加入2. 5-3. 5mL农杆菌悬浮培养基的滤纸上，21-2