抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体的用途
【专利摘要】本发明提供了一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI或G6PI）单克隆抗体在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。采用鼠抗重组人GPI单克隆抗体或人源性抗GPI单克隆抗体作用于分离培养的RA-FLS和OA-FLS，作用72小时后RA-FLS、OA-FLS的增生受到明显抑制、细胞凋亡增加，且细胞培养上清中IL-1、TNF-α含量显著降低。本发明为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，针对RA最主要的病理变化，即受累关节滑膜组织炎症、增生提供了一个全新、有效的防治新技术，为后续研发人源性GPI单抗治疗RA奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
【专利说明】抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体的用途
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞生物学领域，尤其涉及一种关于细胞增殖、凋亡和分泌的小分子蛋白，具体来说是一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体(抗GPI单抗)在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。
【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、全身性、自身免疫性疾病，其特征是外周关节的非特异性、对称性慢性炎症，关节滑膜的慢性炎症、增生，形成血管翳，侵犯关节软骨、软骨下骨、韧带和肌腱等，造成关节软骨、骨和关节囊破坏，最终导致关节畸形和功能丧失，部分患者伴不同程度的全身表现。
[0003]类风湿关节炎(RA)在中国是一个常见的多发性自身免疫疾病，患病率约为
0.3%~0.4%，美国本病患者约占人群的I %，女性发病率较男性高2~3倍。各年龄组人群均可发病，但25~50岁为本病的好发年龄。RA关节病变是从滑膜开始的，滑膜充血、水肿、滑膜表面有纤维蛋白渗出物覆盖；滑膜表层细胞增生、滑膜组织内各种炎症细胞浸润、血管新生。随着炎症持续和反复，在新生血管周围的滑膜成纤维样细胞增生明显，形成肉芽肿，与软骨粘连，并侵蚀软骨。滑膜增生逐渐向软骨中心部位蔓延，阻断了软骨由滑液中吸收营养，软骨逐步被吸收。同时由于溶酶体内的蛋白降解酶、胶原酶的释放，使软骨基质破坏、溶解，导致关节软骨广泛破坏，关节间隙变窄，关节面粗糙 不平，血管翳机化后形成粘连，纤维组织增生，关节腔内形成广泛粘连，而使关节功能明显受限，形成纤维性强直。从RA受累关节病理变化过程可看出，关节滑膜炎症、成纤维样细胞增生和血管新生是导致RA关节不可逆病变的根源。
[0004]本发明人近十年致力于有关RA实验室诊断指标试剂盒研发及RA生物治疗药物的研发。在辅助诊断生物指标上，已成功获得发明专利两项，《变性变构型环瓜氨酸多肽及其融合蛋白、技术和试剂盒》(中国专利号200810203396.4)和《GPI抗原酶联免疫法体外定量测定诊断试剂盒》(中国专利号CN200410016140.4)。GPI (又称G6PI)ELISA检测试剂已经临床应用，检测诊断RA敏感度为76.1%、特异性达93.5%，血清GPI含量与RA病情活动状态相关、且在血清GPI阳性的RA患者关节液中也检测到GPI浓度异常升高(Fan LY, et al.ClinicaChimicaActa2010, 411:2049-2053)。
[0005]本发明是在前期有关RA实验室诊断指标专利发明基础上向RA治疗领域的拓展。GPI是一个多功能蛋白，在细胞内是糖酵解和糖异生的关键酶，催化葡萄糖6磷酸与6磷酸果糖间转化；在细胞外，GPI分子与两个细胞外因子，自分泌蠕动因子(Autocrine MotilityFactor,AMF)和神经介素(neuroleukin, NLK)高度同源，三者是同一基因的产物(Watanabe
H,et al.Cancer Resl996, 56:2960-2963.)。AMF是肿瘤细胞分泌的自分泌细胞因子，能够通过受体(AMFR)介导的信号途径刺激肿瘤细胞，在多种肿瘤研究中显示(包括胃癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和肝癌等)与肿瘤细胞生长、进展和转移相关(Tsutsumi S, et al.ClinCancer Res2004，10:7775-7784.Jiang WGj et al.J Histochem Cytochem2006, 54:231 -241.)。本发明人发现在人RA关节滑膜中也存在类似肿瘤中的现象，即重组人源性GPI能够促进分离培养的RA、骨关节炎(OA)关节滑膜成纤维样细胞(RA-FLS、OA-FLS)生长，而抗人源性GPI单抗则能有效地抑制RA-FLS、0A-FLS增生、促进细胞凋亡，同时还抑制FLS分泌炎症细胞因子IL-1、TNF-α。
[0006]本发明针对RA最主要的病理变化提供了一个全新、有效的防治新技术，不仅为GPI参与RA发病机制提供了实验依据，而且为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，为后续建立人源性GPI单抗治疗RA生物疗法奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
【发明内容】
[0007]为了解决现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体(抗GPI单抗)在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。所述的这种抗GPI单抗能明显抑制RA-FLS、0A-FLS的增生，显著降低I L_l、TNF_a的含量。
[0008]本发明的目的在于提供一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。
[0009]具体的，所述的抗体为鼠抗重组人GPI单克隆抗体或者人源性抗GPI单克隆抗体。
[0010]从RA、OA患者关节手术切除的关节滑膜组织中分离培养关节滑膜成纤维样细胞(RA-FLS, OA-FLS)ο采用重组人GPI作用于分离培养的RA-FLS和OA-FLS (均为第四代细胞)，结果GPI促进两种FLS增生，促进FLS分泌炎症因子IL-1、TNF- a。
[0011]在此基础上分别采用鼠源性抗重组人GPI单抗和人源性抗GPI单克隆抗体作用于上述细胞，作用72小时后RA-FLS、0A-FLS的增生受到明显抑制、细胞凋亡增加，且细胞培养上清中IL-UTNF-a含量显著降低。
[0012]本发明和已有技术相比，其技术效果是显著的。本发明为RA诊断、预防和治疗提供了新的疾病靶标，针对RA最主要的病理变化，即受累关节滑膜组织炎症、增生提供了一个全新、有效的防治新技术，为后续研发人源性GPI单抗治疗RA奠定了必要的基础，有广泛的临床应用前景。
[0013]如图说明
[0014]图1显示了培养的关节滑膜成纤维样细胞(X400)。
[0015]图2显示了培养的FLSs (第三代)流式细胞仪检测结果。
[0016]图3显示了 FLSs培养上清液中GPI含量。
[0017]图4 显示了 GPI 促进 RA-FLS、OA-FLS 增殖。
[0018]图5显示了 GPI抑制ADR诱导FLSs凋亡。
[0019]图6显示了鼠源性GPI单抗能显著抑制RA-FLS和0A-FLS增生。
[0020]图7显示了鼠源性抗GPI单克隆抗体促进RA-FLS、OA-FLS凋亡。
[0021]图8显示了人源性GPI单抗对RA-FLS、0A-FLS凋亡的影响。(A:RA1 (GPI high inserm), B:RA3 (GPI low in serm), C:0A1)
[0022]图9 显示了 GP1、GPI 单抗对 RA-FLS、OA-FLS 分泌 IL-1、TNF- a 影响。
【具体实施方式】[0023]实施例1
[0024]1.临床资料:
[0025]8例患者均来自上海市东方医院风湿科和骨科2011年住院病人，诊断均符合1987年美国风湿病学会修订的RA诊断标准。其中女性6例，男性2例，年龄46~74岁，病程6月~4年。另取年龄与性别相匹配的6例骨关节炎(osteoarthritis,0A)患者为对照组,其中女性4例，男性2例，年龄48-75，均为上海市东方医院运动医学科2011年住院病人。关节置换术或关节镜下滑膜清除术后病理检查的剩余滑膜组织，放入1640培养基中4~10°C保存。
[0026]附表1.RA、OA患者临床资料
[0027]
【权利要求】
1.一种抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体在制备促进类风湿关节炎滑膜成纤维细胞凋亡的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，所述的抗人葡萄糖-6-磷酸异构酶单克隆抗体为鼠抗重组人GPI单克隆抗体或者人源性抗GPI单`克隆抗体。
【文档编号】A61K39/395GK103656637SQ201310542549
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月5日 优先权日:2013年11月5日
【发明者】范列英, 刘颖冰 申请人:范列英, 刘颖冰