3°C培养48小时；
[0023] (6)将步骤（5)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上培养（优选5-7天）；
[0024] (7)将步骤（6)处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所 述筛选培养基中包含甘露糖，所述抗性愈伤组织为能够代谢甘露糖的植物转化细胞，
[0025]其中所述步骤（1)中的种子是水稻成熟种子；所述步骤（1)、（2)中的诱导培养基 是说明书表1所列出的诱导培养基；所述步骤（4)中的与农杆菌接触是将愈伤组织浸泡在 所述农杆菌悬浮液中；所述步骤（5)中的农杆菌悬浮培养基是说明书表1所列出的悬浮培 养基；所述步骤（6)中的前筛选培养基是说明书表1所列出的前筛选培养基；所述步骤（7) 中的筛选培养基是说明书表1所列出的筛选培养基。
[0026]另一方面，本发明提供一种上述基因、表达盒或载体的应用，其特征在于，所述应 用包括利用所述0sPMI2基因作为筛选标记，基于上述方法获得植物（尤其是水稻）抗性愈 伤组织，然后利用植物抗性愈伤组织获得转基因植物或植物部分。
[0027] 优选地，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花丼作物、能源作物。
[0028] 优选地，所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞块、 胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。
[0029] 在优选的实施方案中，其中所述水稻是粳稻，更优选地，所述水稻是粳稻品种日本 晴。
[0030] 下面的表1中给出了在一种优选实现方式中，本发明所采用的培养基的示例性配 方。本领域技术人员应该理解，各培养基除了采用本发明的特殊配方之外，还可以采用普通 的培养基，其也能够实现本发明的目的，只是效果上存在一定差异。
[0031] 表1培养基的示例性配方
【主权项】
1. 一种高等植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2,其特征在于，所述磷酸甘露糖 异构酶基因0sPMI2来自水稻，能够在植物遗传转化过程中作为筛选标记。
2. 根据权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2,其特征在于，所述磷酸甘露 糖异构酶基因0sPMI2的DNA序列与SEQIDNo: 1所示的DNA序列有至少90%同源性； 或者，所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2为在SEQIDNo: 1所示的DNA序列中添加、 取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物； 或者，所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2包含与SEQIDNo: 1所示的DNA序列杂交的 产物。
3. 根据权利要求2所述的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2,其特征在于，所述磷酸甘露 糖异构酶基因0sPMI2的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示，优选地，在提取所述磷酸甘露糖 异构酶基因0sPMI2时，所采用的引物为正向引物5'-ATGGAGGACCCGCCGCCGCCGC-3'，反向引 物 5' -TTAACTGAAGAATCTGCTGTTT-3'。
4. 一种原核表达载体，其特征在于，所述原核表达载体包含权利要求1-3之一所述的 磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2。
5. -种用于鉴定所述磷酸甘露糖异构酶的酶活分析方法，其特征在于，所述鉴定方法 包括：利用两步偶联法对包含权利要求1-3之一所述的磷酸甘露糖异构酶基因的编码蛋白 或权利要求4所述的原核表达载体的表达蛋白进行酶活分析。
6. -种表达盒，其特征在于，所述表达盒中包含权利要求1所述的磷酸甘露糖异构酶 基因OsPMI2。
7. -种植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体包含权利要求1-3之一所述的 磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2和/或权利要求6所述的表达盒。
8. -种利用含有权利要求1中所述的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2的植物表达载体 获得植物转化细胞或植物部分的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤： (1) 利用植物种子以及愈伤组织诱导培养基制备相应的次级愈伤组织； (2) 对所述次级愈伤组织进行进一步预培养，获得能够用于转化的愈伤组织； (3) 利用所述的磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2制备植物表达载体 pCAMBIA1381-〇sPMI2,其中，pCAMBIA1381 为现有植物载体； (4) 将所述植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI2转入根癌农杆菌中，并且将步骤（2)中 获得的愈伤组织与转入了所述植物表达载体pCAMBIA1381-〇sPMI2的根癌农杆菌相接触； (5) 将步骤（4)处理后的愈伤组织转移到其上垫有无菌滤纸的培养皿中进行培养； (6) 将步骤（5)处理后的愈伤组织置于前筛选培养基上进行培养； (7) 将步骤（6)处理后的愈伤组织转移至筛选培养基上，以获得抗性愈伤组织，所述筛 选培养基中包含甘露糖，所述抗性愈伤组织为能够代谢甘露糖的植物转化细胞， 优选地，所述植物为水稻，所述植物转化细胞为水稻转化细胞。
9. 一种权利要求1所述磷酸甘露糖异构酶基因0sPMI2、权利要求4所述的表达盒、权 利要求5所述的植物表达载体的应用，其特征在于，所述应用包括利用所述磷酸甘露糖异 构酶基因0sPMI2作为筛选标记，基于权利要求6所述的方法获得植物转化细胞，并利用所 述植物转化细胞获得转基因植物或植物部分。
10. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物包括：粮食作物、蔬菜作物、花 丼作物、能源作物；所述植物部分包括：细胞、原生质体、细胞组织培养物、愈伤组织、细胞 块、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、叶、根、根尖、花药和种子。
【专利摘要】本发明提供了一种植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2，该磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2分离、克隆自水稻。本发明的磷酸甘露糖异构酶基因OsPMI2的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明还提供一种含有OsPMI2的原核表达载体。本发明还提供一种磷酸甘露糖异构酶的酶活分析方法。并且本发明提供一种含有OsPMI2的表达盒和一种植物表达载体，以及该表达盒和表达载体在植物遗传转化方面的应用。本发明利用OsPMI2基因构建的植物表达载体，以甘露糖为筛选剂，成功实现了转化水稻细胞。本发明成功分离和克隆出植物来源的磷酸甘露糖异构酶基因，由于该磷酸甘露糖异构酶基因来源于植物(水稻)，对人类没有潜在危险。可以用于替代来自大肠杆菌的磷酸甘露糖异构酶，从而降低潜在的安全风险。
【IPC分类】C12N15-61, C12Q1-533, C12N15-84, C12N5-10
【公开号】CN104762309
【申请号】CN201510161836
【发明人】李 浩, 杨剑波, 魏鹏程, 李莉, 李娟 , 杨亚春, 马卉, 秦瑞英
【申请人】安徽省农业科学院水稻研究所
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月7日