专利名称：用嗜酸链霉菌生产葡萄糖异构酶的方法
技术领域：
本发明是一种用嗜酸链霉菌(Streptomyces acidophilus)生产葡萄糖异构酶的方法，属生物工程技术领域。
1965年Tsumura(津村)Takasaki(高崎)等分别发现了适于工业生产的葡萄糖异构酶产生菌种-暗色产色链霉菌(Streptomyces phaeochromogenes)和白色链霉菌(Streptomyces albus)。
1970年以来，我国对玫瑰暗黄链霉菌Kc-13，玫瑰红链霉菌336，嗜热放线菌M1033以及米苏里游动放线菌等生产葡萄糖异构酶的条件、人工诱变育种和固定化技术作了研究。
张树政主编“酶制剂工业”(科学出版社，1984)一书中，特别是其中由胡学智编写的第十一章“葡萄糖异构酶”已对当前国内外这一领域的工业生产包括菌种、发酵工艺、固定化技术、检测方法等进展做了详述。
1984年Song H.Bok等报道从嗜酸性链霉菌(Acidophilic strep tomyces)耐酸链霉菌(Streptomyces acidodurans)筛选葡萄糖异构酶产生菌的方法(Appl.Environ.Microbiol.471213-1215，1984;U.S.patent 4，399，222，1983)。
本发明是一种用嗜酸链霉菌生产葡萄糖异构酶的方法，其目的在于用我们分离获得的嗜酸链霉菌菌种，通过发酵及固定化工艺制备葡萄糖异构酶制剂。本发明包括(1)依据pH值分段模式从土壤中分离嗜酸链霉菌，对于能够在pH5乃至pH4培养基上生长之菌株进行分析鉴别筛选出葡萄糖异构酶产生菌株。(2)经纯化的产酶菌株，在适宜培养条件下，依次经斜面孢子，摇瓶种子逐级扩大培养于含有适当碳源、氮源的接种培养基上，使种子生长旺盛。(3)生长良好的种子培养液接入发酵培养基中，在控制条件下进行发酵，从中收获葡萄糖异构酶，该酶经固定化后用于制备高果糖浆。
本发明中产生葡萄糖异构酶的链霉菌与其它已知的产生异构酶链霉菌迥然不同之处在于其原始菌株生长及产酶的培养基应保持在pH5.2以下，甚至低达pH4.0。其中一些产酶菌株，经过系列人工诱变之后，其适应pH范围为5.5-7.0。
凡在pH4.8培养基上生长，又在pH4.0培养基上生长的菌株，从中筛选酶活较高者。测定酶活的方法为间苯二酚法，初筛时做定性测定，复筛时做定量测定。最终由高压液相色谱分析测定酶活。
最初分离出的原始菌株，酶活高的可达5，000国际单位/升，经过一系列人工诱变和发酵工艺方面的改进，酶活提高到20，000国际单位/升。
下面为本发明产葡萄糖异构酶的嗜酸链霉菌株(Streptomyces acidophilus 10-168)CGMCC No.0142的微生物学特征。
1、形态学特征察氏培养基菌丝体生长迅速，并产生分枝，气生菌丝为白色，基丝由白色渐变为黄灰色。两周后气丝由顶端开始断裂，形成灰色孢子，形状椭园形，孢子丝弯曲，呈波浪状，菌落表面皱褶，边缘整齐。
高氏培养基生长较弱，气生菌丝为白色，基内菌丝灰色，无可溶性色素产生，菌落表面绒状，边缘整齐，呈同心园状，两周后，菌落中心凹下，菌落表面皱褶，中央灰色，孢子呈灰色，椭园形至园形。
2、培养特征(1)淀粉琼脂生长较弱，气丝白色，基丝由白色至浅灰色，未观察到可溶性色素。
(2)马铃薯浸汁生长良好，气丝由白色渐变为灰色，基丝褐色，观察到褐色可溶性色素。
(3)马铃薯块生长良好，气丝由白色至灰色，基丝褐色，产生褐色可溶性色素。
(4)Emerson培养基生长良好，气丝由白至灰色，基丝为褐色，产生大量深褐色可溶性色素。
3、生理特征(1)生长温度范围(采用酵母-麦芽浸汁琼脂培养基)可生长温度为18-38℃最适宜温度为28-32℃(2)淀粉水解琼脂产生淀粉酶，可以水解利用淀粉。
(3)明胶的液化作用阳性。
(4)脱脂奶的凝结和胨化作用有胨化现象。
(5)纤维素利用可分解利用纤维素，并有少量褐色素产生。
(6)Tresner培养基在生长过程中有H2S产生。
(7)碳源机用可利用淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、柠檬酸、麦芽糖、麸皮浸渍液、马铃薯浸汁、落叶松木屑水解液。
此外，嗜酸链霉菌所需氮源营养成分种类范围很宽。
有机氮源黄豆粉、黄豆饼粉、黄豆饼粉水解液、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、牛肉膏、麦芽浸汁、蚕蛹粉。
无机氮源硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、醋酸铵。
嗜酸链霉菌其生长及产酶的温度范围在24-36℃之间，较适宜的温度为27-33℃，其中以30-32℃为最适温度。
发酵时间依据菌种及培养基种类而变化，在本发明菌种试验范围为24-96小时，其中比较适宜时间为24-60小时，以36-56小时为最适发酵时间。过度延长发酵时间会导致酶活下降，菌丝断裂和自溶，为后工序一固定化工艺造成困难。当发酵周期超过48小时，碳源以分次加入对产酶较为有利。
现在，本发明将在有关实施例中进一步予以详细说明，但是，应该理解到本发明决不只限于这些特殊实施例。
例1从石家庄效区玉米地土壤中(pH6.4)采取土样，在无菌操作条件下，将土样稀释至灭菌无离子水中，在摇瓶机上振荡1小时，然后接种于如下分离培养基上(克/100毫升)淀粉 2.0KNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001
琼脂 1.8pH 6.5用无离子水配制。
将于pH6.5分离培养基上生长的菌落，再接种于pH4.8分离培养基上，将长出的菌落再转接于pH4.0分离培养基上。
pH4.0分离培养基成分(克/100毫升)淀粉 2.0NaNO30.1K2HPO40.05NaCl 0.05MgSO4·7H2O 0.05FeSO4·7H2O 0.001琼脂 1.8用无离子水配制。
在一批分离获得的228个菌株中统计其生长率为1.3%。从多批分离菌株中筛选出S10-168，S10-170，S13-219等酶活较高的菌株。在分离培养基上，培养温度为30℃，培养时间为1周。将生长于平皿的菌落分别挑选移植到斜面培养基上，30℃培养4-6天，挖块接种到摇瓶种子培养基中，再转接到发酵培养基中进行发酵。以上三株菌均达到5，000国际单位/升水平。
例2将S10-168菌种经过多次纯化后培养在下述斜面孢子培养基上(克/100毫升)
麦芽浸渍物 0.3酵母膏 0.4NaCl 0.5MgSO4·7H2o 0.05CoCl2·6H2o 0.001琼脂 2.0pH 5.830℃培养4天后，将斜面孢子挖块接种到摇瓶种子培养基中，培养24-36小时，其成分为(克/100毫升)黄豆饼粉 1.5(NH4)2SO40.5葡萄糖 2.0KH2PO40.04NaCl 0.5pH 6.4将生长稠厚的摇瓶种子以5%接种量(体积/体积)接种到发酵培养基中，发酵培养基成分(克/100毫升)玉米浆 2.0柠檬酸 0.2K2HPO40.5(NH4)2SO40.5NaCl 0.5MgSO4·7H2O 0.05
D-木糖 0.40pH 6.8接种后，于30℃，在摇瓶机(G-25型，N.B.S.公司产品)上，300转/分，振荡培养48-56小时，酶活达15，000国际单位/升。
例3嗜酸链霉菌的原始菌株S10-168在初筛阶段表现出稳定的酶活，所以以此为出发菌株进行系统诱变育种。
其方法是将原始菌株的斜面孢子，首先挖取一小块(约为斜面孢子的1/5)接种到摇瓶种子及发酵培养基上进行培养及发酵，当酶活超过对照组时，即以此斜面孢子为诱变育种的出发材料。
将经过检测酶活的斜面孢子用接种针轻轻刮下，将孢子悬浮于无菌蒸馏水中，用30W紫外灯，照射距离为35厘米，照射时间1-3分钟，然后涂布于分离平皿上，再挑选不同类型菌落接种于斜面孢子培养基上。
存活率在10%-15%，涂布密度以在每个培养皿上50-100个菌落为宜。将挑选的单个菌落分别接种于斜面培养基上，一一进行测试，从中筛选出酶活较高的嗜酸链霉菌菌株。
将嗜酸链霉菌的菌种，经配方为3%葡萄糖，2%黄豆饼粉，0.6%(NH4)2SO4，0.05%KH2PO4，0.5%NaCl的种子培养基(30毫升装入150毫升三角瓶中)，于300转/分摇瓶机上，30℃培养36-48小时，再经配方为0.2%柠檬酸钠，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁(将土豆4克在100毫升水中煮沸30分钟，滤去渣子备用)，2%麸皮浸渍液，1.0%玉米浆，于pH6.8，在300转/分摇瓶机上，30℃培养48-56小时，收获菌丝体，测定酶活可达20，000国际单位/升。
例4嗜酸链霉菌种(S.10-168 CGMCC No.0142)经配方同例3的种子培养基，在300转/分摇瓶机上，30℃培养36小时，再经配方为0.2%柠檬酸钠，0.5%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.5%K2HPO4，0.05%MgSO4·7H2O，0.01%CoCl2·6H2O，0.001%FeSO4·7H2O，4%土豆浸汁，2%麸皮浸渍液，1.0%玉米浆，0.06%稀土化合物，pH6.8，(30毫升培养基装入150毫升三角瓶中)，在300转/分摇瓶机上，30℃发酵56小时，测定酶活达22，500国际单位/升。
＊葡萄糖异构酶国际单位(G.I.U.)在pH6.6，65℃反应条件下，1分钟能转化生成1微克分子果糖的酶量，定义为1葡萄糖异构酶国际单位。
＊实施例中培养基灭菌条件蒸汽压为0.8-1.0公斤/平方厘米，30分钟。
权利要求
1.一种用嗜酸链霉菌生产葡萄糖异构酶的方法，它包括(1)依据pH值分段模式从土壤中分离嗜酸链霉菌，对分离出的菌株进行分析鉴别，在含有适当碳、氮源分离培养基上筛选出产葡萄糖异构酶的原始菌株。这些菌株在pH低于5.2条件下培养并产生葡萄糖异构酶。(2)经纯化的产酶菌株，在适宜培养条件下，依次经斜面孢子，摇瓶种子逐级扩大培养于含有适当碳源、氮源的培养基上，使种子生长旺盛。(3)生长良好的种子培养液转入含有适当碳、氮源的发酵培养基中，在控制条件下进行发酵并从中收获葡萄糖异构酶，该酶经固定化后用于制备高果糖浆。
2.根据权利要求1嗜酸链霉菌包括从土壤中分离获得的原始菌株及经过理化因子处理的人工诱变菌株。其特征在于所说的嗜酸链霉菌是寄存在中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心，寄存号为CGMCC No.0142的嗜酸链霉菌(Streptomyces acidophilus 10-168)。所说明菌其微生物学特征为(1)、形态学特征察氏培养基菌丝体生长迅速，并产生分枝，气生菌丝为白色，基丝由白色渐变为黄灰色。两周后气丝由顶端开始断裂，形成灰色孢子，形状椭园形，孢子丝弯曲，呈波浪状，菌落表面皱褶，边缘整齐。高氏培养基生长较弱，气生菌丝为白色，基内菌丝灰色，无可溶性色素产生，菌落表面绒状，边缘整齐，呈同心园状，两周后，菌落中心凹下，菌表面皱褶，中央灰色，孢子呈灰色，椭园形至园形。(2)、培养特征①淀粉琼脂生长较弱，气丝白色，基丝由白色至浅灰色，未观察到可溶性色素。②马铃薯浸汁生长良好，气丝由白色渐变为灰色，基丝褐色，观察到褐色可溶性色素。③马铃薯块生长良好，气丝由白色至灰色，基丝褐色，产生褐色可溶性色素。④Emerson培养基生长良好，气丝由白色至灰色，基丝为褐色，产生大量深褐色可溶性色素。(3)、生理特征①生长温度范围(采用酵母-麦芽浸汁琼脂培养基)可生长温度为18-38℃最适宜温度为28-32℃②淀粉水解作用产生淀粉酶，可以水解利用淀粉。③明胶的液化作用阳性。④脱脂奶的凝结和胨化作用有胨化现象。⑤纤维素利用可分解利用纤维素，并有少量褐色素产生。⑥Tresner培养基在生长过程中有H2S产生。⑦碳源利用可利用淀粉 葡萄糖、木糖、蔗糖、柠檬酸、麦芽糖。
3.根据权利要求1所说pH分段模式，是将从土壤中分离获得的链霉菌，依据pH6.5，pH4.8，pH4.0依次递降的模式，将于pH6.5分离培养基上生长的菌落接种于pH4.8分离培养基上，依次再接种于pH4.0分离培养基上，从中选出嗜酸链霉菌。
4.根据权利要求1所用的碳源为淀粉、葡萄糖、木糖、蔗糖、柠檬酸盐、麦芽糖、麸皮浸渍液、马铃薯浸汁、落叶松木屑水解液。
5.根据权利要求1所用的氮源为有机氮源黄豆粉、黄豆饼粉、黄豆饼粉水解液、蛋白胨、玉米浆、酵母膏、牛肉膏、麦芽浸汁、蚕蛹粉。无机氮源硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、氢氧化铵、磷酸铵、醋酸铵。
6.根据权利要求1其中玉米浆需经过氢氧化钠调节pH7.0-7.2，过滤除去沉淀。
7.根据权利要求1所说分离培养基成分为1.5-2.0%淀粉，0.1%NaNO3，0.05%K2HPO4，0.05%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.001%FeSO4·7H2O，1.8-2.0%琼脂，无离子水配制。pH3.5-4.0。
8.根据权利要求1所说斜面孢子培养基成分为0.25-0.40%麦芽浸渍物，0.3-0.5%酵母膏，0.5%NaCl 0.05%MgSO4·7H2O，0.001%CoCl2·6H2O，1.8-2.0%琼脂，无离子水配制。pH5.2-6.0。
9.根据权利要求1所说摇瓶种子培养基成分为1.5-2.0%黄豆饼粉，0.4-0.6%(NH4)2SO4，1.5-3.0%葡萄糖0.04-0.06%KH2PO4，0.5%NaCl。pH5.5-6.5。
10.根据权利要求1所说发酵培养基成分为1.0-3.0%玉米浆，0.2-0.3%柠檬酸盐，0.5-0.6%K2HPO4，0.4-0.6%(NH4)2SO4，0.5%NaCl，0.05%MgSO4·7H2O，0.2-0.5%D木糖，3-6%马铃薯浸汁，1.5-2.5%麸皮浸渍液，pH5.8-6.8。
11.根据权利要求1所说发酵培养基中加入稀土化合物。
12.根据权利要求11稀土化合物为以轻稀土为主的硝酸盐及氯化物。
13.根据权利要求11发酵培养基中稀土化合物的浓度为0.01-0.1%。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域。嗜酸链霉菌(Streptomyces acidophilus)具有生产葡萄糖异构酶的潜力。本发明是依据pH值分段模式从土壤中分离筛选能产生葡萄糖异构酶的嗜酸链霉菌。通过对原始菌株一系列人工诱变并结合种子制备工艺及发酵过程的控制以提高酶活水平的方法。嗜酸链霉菌最适pH值为4-6，在发酵过程中不易为细菌污染。嗜酸链霉菌发酵终结，选择合适载体和固定化技术制备固定化葡萄糖异构酶，用于生产高果糖浆。
文档编号C12N9/92GK1050407SQ8910766
公开日1991年4月3日 申请日期1989年10月10日 优先权日1989年10月10日
发明者陆维新, 张绍镇, 靳庆生, 王忠秋, 王晓东, 田竹 申请人:河北省科学院生物研究所