专利名称：耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡萄糖异构酶，具体地说是一种耐高温(热)葡萄糖异构酶及其编码基因和(在生产果葡糖浆方面的)应用。
背景技术：
葡萄糖异构酶，或称木糖异构酶(Xylose isomerase)是重要的工业酶。食品工业上利用葡萄糖异构酶制备果葡糖浆。利用酶法生产果葡糖浆时，反应温度越高，产品果葡糖浆中的果糖含量也越高(Hartley，BS et al.，Biochim Biophys Acta.2000，1543294-335.)。
目前，商业上使用葡萄糖异构酶主要取自链霉菌(Streptomyces)、或密苏里游动放线菌(Actinoplanes missouriensis)等，但这些葡萄糖异构酶不耐高温，在高温(如高于60℃)下容易失活。因此，目前工业界只得在60℃下制备果葡糖浆，所得的果葡糖浆中果糖的含量也就较低，一般为42％。若欲生产含高浓度果糖(如大于42％)的果葡糖浆通常依赖层析分离方法生产，令生产含高果糖果葡糖浆的成本大大提高了。因此，从耐热菌中筛选并通过蛋白质工程的方法生产耐热高催化活性的葡萄糖异构酶工业前景良好。尽管许多国家的科学家对提高葡萄糖异构酶的耐热性有浓厚兴趣并进行了大量研究，如参见文献Journal of GeneralMicrobiology，1993，1391227-1234；Methods Enzymology 2001；330215-24；Protein Engineering，2000，13259-65，但这些研究尚难在高于现有工业条件，即在60℃以上温度条件下，生产高浓度果糖(如大于42％)的果葡糖浆。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用。
一种耐高温葡萄糖异构酶，具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
所述耐高温葡萄糖异构酶也可以为与序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列具有同源性≥90％的氨基酸衍生物。
上述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，具有序列表SEQ ID NO1中的碱基序列。也可以为与序列表SEQ ID NO1中的碱基序列具有同源性≥75％的碱基序列。
所述耐高温葡萄糖异构酶可在制备果葡糖浆中的应用。其工程葡萄糖异构酶可以是纯酶或部分纯化的酶；在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的工程葡萄糖异构酶可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞外表达(例如在胞外表达体系中表达)。
其中耐高温葡萄糖异构酶在细胞内表达可按如下过程制备1)耐高温葡萄糖异构酶(TN)基因扩增和质粒构建利用引物对T15’AGA TTA CCT AGG TAC ATA TGG CTG AAT TCT ATCCAG AAA TCC CGA AA 3’和T25’ATT TCC GAT GGC GCG CCT CAC CTC AGTTCC AGA ATG GTC TTC 3’从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因序列表SEQ ID NO1的碱基序列；PCR扩增反应程序为95℃ 3分钟，40圈循环95℃ 50秒、50℃ 40秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟；扩增的基因按常规方法连接至载体pGEMT-Easy(Promega，USA)上，产生质粒pGMT-TN；在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的载体包括(但不限于)原核表达载体pRSET、pGEMT-Easy、和pET21；包括(但不限于)真核表达载体pYD1和pYES2/GS；包括(但不限于)克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。在生产本发明提供的耐高温葡萄糖异构酶时，可以将耐高温葡萄糖异构酶基因序列与表达调控序列相连，进而形成耐高温葡萄糖异构酶表达载体。表达载体含有复制起始点和表达调控序列、启动子、或/和增强子、或/和必要的加工信息位点、或/和信号肽编码序列。表达载体还必须含有可供选择的标记基因，如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因。这些表达载体可以用本领域公知的重组DNA技术制备，可参考Sambrook，et al.，Molecular cloningA laboratory manual.New YorkCold SpringHarbor Laboratory Press，1989)。
2)载体的转化在本发明制备工程葡萄糖异构酶的方法中，所述的微生物宿主细胞为原核细胞或真核细胞；所述原核微生物包括(但不限于)大肠杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草杆菌和链霉菌；所述真核微生物包括(但不限于)酿酒酵母和毕赤巴斯德酵母。
3)葡萄糖异构酶的制备与纯化接种单个含质粒pGMT-TN的菌种克隆于种子菌培养基中，得种子液；将上述种子液发酵培养，收集菌体，粉碎裂解细菌细胞，收集纯化获得葡萄糖异构酶。本发明具有如下优点1.葡萄糖异构酶耐热性好。本发明利用来源于Thermotoga neapolitana的耐热葡萄糖异构酶，在高温(如60℃以上)下反应，生产果糖含量高于43％的果葡糖浆。
2.可直接生产果糖含量高的果葡糖浆。使用本发明的耐热葡萄糖异构酶直接生产果糖含量高于42％的果葡糖浆；甚至可生产果糖含量低于55％(包括55％)的果葡糖浆。
下列附图表用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1为葡萄糖异构酶TN在80℃反应条件下生产的果葡糖浆中果糖含量随反应时间延长的变化。
具体实施例方式
下列实施实例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。实施实例中未注明具体条件的实验方法，按常规条件或制造商建议的条件进行。
葡萄糖异构酶TN的核苷酸序列如下1 atggctgaat tctttccaga aatcccgaaa gtgcagttcg aaggcaaaga aagcacaaat61 ccacttgcgt tcaagttcta cgatccagaa gagatcatcg acggcaaacc cctcaaggac121 catctgaagt tctccgttgc cttctggcac accttcgtga acgagggaag ggaacccttc181 ggagacccaa cggccgatcg tccctggaac aggtacaccg atcccatgga caaggctttt241 gcaagggtgg acgccctttt tgaattctgc gaaaaactca acatcgagta cttctgcttc301 cacgacagag acatcgctcc cgagggaaaa acgctgaggg agacaaacaa aattttggac361 aaagtagtgg agagaatcaa agagagaatg aaagacagca acgtgaagct cctctggggt421 actgcaaacc tcttttccca cccaaggtac atgcatggtg cagcgacaac ctgcagtgct481 gatgtttttg cgtacgcggc cgcccaggtg aaaaaagccc ttgagatcac caaagaactt541 ggaggagaag ggtacacatt ctggggtgga agagaaggat acgaaacact cctcaacacg601 gaccttggat tcgaacttga aaacctcgcc cgcttcctca gaatggctgt ggattatgca661 aaaaggatcg gtttcaccgg acagttcctc atcgaaccaa aaccgaaaga acccaccaaa721 caccagtacg acttcgacgt tgcaaccgcc tatgccttcc tgaagagcca cggtctcgat781 gaatacttca aattcaacat cgaggcaaac cacgccacac tcgccggtca caccttccag841 cacgaactga gaatggcaag gatccttgga aaactcggaa gcatcgatgc aaaccaagga901 gaccttcttc ttggatggga caccgatcag ttcccaacaa acgtctacga tacaaccctt961 gcaatgtacg aagtgataaa agcgggaggc ttcacaaaag gtgggctcaa cttcgatgcg102l aaggtgagga gggcttctta caaagtggag gacctcttca tagggcacat agcgggaatg108l gacacctttg cactcggttt caaggtggca tacaaactcg tgaaggatgg tgttctggac1141 aaattcatcg aagaaaagta cagaagtttc agggagggca ttggaaggga catcgtcgaa1201 ggtaaagtgg attttgaaaa acttgaagag tatataatag acaaagaaac gatagaactt1261 ccatctggaa agcaagaata cctggaaagc ctcatcaaca gttacatagt gaagaccatt1321 ctggaactga ggtga(1)SEQ ID NO 1的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度1335碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型DNA(c)假设否(d)反义否
(e)最初来源Thermotoga neapolitana。
上述有核苷酸序列基因编码的(葡萄糖异构酶TN的)氨基酸序列为MAEFFPEIPKVQFEGKESTNPLAFKFYDPEEIIDGKPLKDHLKFSVAFWHTFVNEGREPFGDPTADRPWNRYTDPMDKAFARVDALFEFCEKLNIEYFCFHDRDIAPEGKTLRETNKILDKVVERIKERMKDSNVKLLWGTANLFSHPRYMHGAATTCSADVFAYAAAQVKKALEITKELGGEGYTFWGGREGYETLLNTDLGFELENLARFLRMAVDYAKRIGFTGQFLIEPKPKEPTKHQYDFDVATAYAFLKSHGLDEYFKFNIEANHATLAGHTFQHELRMARILGKLGSIDANQGDLLLGWDTDQFPTNVYDTTLAMYEVIKAGGFTKGGLNFDAKVRRASYKVEDLFIGHIAGMDTFALGFKVAYKLVKDGVLDKFIEEKYRSFREGIGRDIVEGKVDFEKLEEYIIDKETIELPSGKQEYLESLINSYIVKTILELR*(1)SEQ ID N0 2的信息(参见序列表)(a)序列特征*长度444氨基酸残基*类型蛋白(b)分子类型蛋白质(c)假设否(e)最初来源Thermotoga neapolitana。
实施例1)基因扩增和质粒构建根据基因库(L38994)基因序列设计引物T15’AGA TTA CCT AGG TACATA TGG CTG AAT TCT ATC CAG AAA TCC CGA AA 3’和T25’ATT TCC GATGGC GCG CCT CAC CTC AGT TCC AGA ATG GTC TTC 3’；利用引物对T1和T2从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因(TN)。
扩增反应条件为5微升10×缓冲液(Promega，USA)，4微升2.5毫摩尔dNTP(Promega，USA)，2微升10微摩尔引物T1，2微升10微摩尔引物T2，0.5微升5U/微升Tag DNA聚合酶(Promega，USA)，用接种环挑取少许Thermotoga neapolitana菌体，再用无菌水调反应体积至50微升。
PCR扩增反应程序为95℃ 3分钟，40圈循环95℃ 50秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟，最后72℃ 10分钟。扩增的基因连接至载体pGEMT-Easy上，连接条件如载体制造商所建议方案，产生质粒pGMT-TN。
2)质粒转化按常规方法制备DH5α的感受态细胞(参考Sambrook，e艺al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.New YorkCold Spring HarborLaboratory press，1989)。将40纳克质粒pGMT-TN加入100微升DH5α感受态细胞中，于42℃热击2分钟，迅速于冰上冷却，加入400微升LB培养基(参考Sambrook，et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual.New YorkCold Spring Harbor Laboratory press，1989)，于37℃振动培养2小时，涂10微升培养物于1％的MacConkey(DIFCO，USA)平板(含1％D-木糖和50mg/L氨苄青霉素)上，置板于37℃培养，从中筛选出具葡萄糖异构酶活性的克隆。
3)葡萄糖异构酶的制备与纯化接种单个含质粒pGMT-TN的菌种(大肠杆菌DH5α)克隆于50毫升种子菌培养基(玉米浆0.2克；酵母膏0.25克，调整pH至7.0；加卡那霉素至50毫克/升)中，于37℃培养过夜。将4毫升转入5000毫升种子菌培养基(玉米浆20克；酵母膏25克，调整pH至7.0；加卡那霉素至50毫克/升)中，于30℃培养过夜(约12小时)，此时细菌OD600应达到3-4。将上述5升种子菌培养液转入预先消毒好的含100升起始培养基(玉米浆4000克；酵母膏400克；葡萄糖250克；硫酸铵152克；磷；氢二钠304克；磷酸二氢钾80克；氯化钠152克；含7个结晶水的硫酸镁252克；氢氧化钠100克；卡那霉素5克，调pH至7.0)的发酵罐(自动控温、调节酸碱度、补氧、补料)中，于35℃培养。随着葡萄糖的逐渐消耗，pH会下降，此时用固体氢氧化钾调pH至7.0-7.4。当葡萄糖消耗完毕，pH会逐渐上升(大约5-7小时后)，此时缓慢加入60升补料培养基(玉米浆10500克；酵母膏500克；甘油1升；葡萄糖300克；硫酸铵38克；磷酸氢二钠76克；磷酸二氢钾20克；氯化钠38克；含7个结晶水的硫酸镁63克；氢氧化钠100克；卡那霉素3克，调整pH至7.0)，令pH维持在7.0-7.4，约12-19小时后补料结束，之后再培养2小时左右，终止发酵。于4000转/分钟离心20分钟收集菌体，并离心约20分钟收集菌体，离心转速为4000转/分钟，并将菌体悬浮于20毫摩尔磷酸钠缓冲液(pH8.0)中，使体积达约20升-30升，加氯化钴(CoCl2)和氯化镁(MgCl2)至终浓度分别为200微摩尔和5毫摩尔。
然后用细菌粉碎机粉碎裂解细菌细胞，离心(10℃，4000转/分钟，20分钟)并收集上清液。上清液经80℃处理10-20分钟后，离心(10℃，4000转/分钟，20分钟)并收集上清液，上清液即为纯化的葡萄糖异构酶，可用于酶活性的测定和制备果葡糖浆。
4)葡萄糖异构酶活性测定取10微升实例3制备的葡萄糖异构酶，加入90微升1.0摩尔的葡萄糖和20毫摩尔磷酸钠缓冲溶液中(pH 6.8)，并加入CoCl2和MgCl2至终浓度分别为200微摩尔和10毫摩尔，反应于80℃进行10分钟；将反应物置冰上以终止反应；反应产物D-果糖通过半胱氨酸-咔唑法测定。测定方法参见J.Biol.Chem 1951，192583-587。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶蛋白浓度；一单位酶比活性定义为每毫克酶蛋白质每分钟转化底物产生的产物微摩尔数。
5)果葡糖浆的生产于控温反应罐中，注入约1-1.2吨蒸馏水，加热至80℃以上，加入1吨纯度在95％以上的口服用结晶葡萄糖，再注入热蒸馏水，使糖浓度达50％(W/V)；如果条件允许，进行低压排氧；调酸碱度至pH7.5。加入1.6-2升纯化的葡萄糖异构酶，缓慢搅拌反应约12小时后，监测酸碱度和果糖转化率；再加入1.6-2升纯化的葡萄糖异构酶，反应约12小时后，再监测酸碱度和果糖转化率，直至果糖转化率达到55％；反应结束后应迅速降温至室温，过一夹板筛，滤去沉淀物质，室温放置或过活性炭柱。
6)葡萄糖转化为果糖的转化率之测定用国标法测定实例5产生的果糖含量(参考中华人民共和国国家标准GB 8274-87)。图1显示葡萄糖异构酶TN在80℃反应条件下生产的果葡糖浆中果糖含量随反应时间延长的变化。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的围内做各种改变。这些改变均在本发明的范围之内。
耐高温葡萄糖异构酶SEQUENCE LISTING<110>张力彬<120>耐高温葡萄糖异构酶及其编码基因和应用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1335<212>DNA<213>Thermotoga neapolitana<220>
<221>CDS<222>(1)..(1335)<223>
<400>1atg gct gaa ttc ttt cca gaa atc ccg aaa gtg cag ttc gaa ggc aaa 48Met Ala Glu Phe Phe Pro Glu Ile Pro Lys Val Gln Phe Glu Gly Lys1 5 10 15gaa agc aca aat cca ctt gcg ttc aag ttc tac gat cca gaa gag atc 96Glu Ser Thr Asn Pro Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Asp Pro Glu Glu Ile20 25 30atc gac ggc aaa ccc ctc aag gac cat ctg aag ttc tcc gtt gcc ttc 144Ile Asp Gly Lys Pro Leu Lys Asp His Leu Lys Phe Ser Val Ala Phe35 40 45tgg cac acc ttc gtg aac gag gga agg gaa ccc ttc gga gac cca acg 192Trp His Thr Phe Val Asn Glu Gly Arg Glu Pro Phe Gly Asp Pro Thr50 55 60gcc gat cgt ccc tgg aac agg tac acc gat ccc atg gac aag gct ttt 240Ala Asp Arg Pro Trp Asn Arg Tyr Thr Asp Pro Met Asp Lys Ala Phe65 70 75 80gca agg gtg gac gcc ctt ttt gaa ttc tgc gaa aaa ctc aac atc gag 288Ala Arg Val Asp Ala Leu Phe Glu Phe Cys Glu Lys Leu Asn Ile Glu85 90 95tac ttc tgc ttc cac gac aga gac atc gct ccc gag gga aaa acg ctg 336Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Lys Thr Leu100 105 110agg gag aca aac aaa att ttg gac aaa gta gtg gag aga atc aaa gag 384Arg Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asp Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Glu
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耐高温葡萄糖异构酶Thr Ile Glu Leu Pro Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ile420 425 430aac agt tac ata gtg aag acc att ctg gaa ctg agg tga l335Asn Ser Tyr Ile Val Lys Thr Ile Leu Glu Leu Arg435 440<210>2<211>444<212>PRT<213>Thermotoga neapolitana<400>2Met Ala Glu Phe Phe Pro Glu Ile Pro Lys Val Gln Phe Glu Gly Lys1 5 10 15Glu Ser Thr Asn Pro Leu Ala Phe Lys Phe Tyr Asp Pro Glu Glu Ile20 25 30Ile Asp Gly Lys Pro Leu Lys Asp His Leu Lys Phe Ser Val Aia Phe35 40 45Trp His Thr Phe Val Asn Glu Gly Arg Glu Pro Phe Gly Asp Pro Thr50 55 60Ala Asp Arg Pro Trp Asn Arg Tyr Thr Asp Pro Met Asp Lys Ala Phe65 70 75 80Ala Arg Val Asp Ala Leu Phe Glu Phe Cys Glu Lys Leu Asn Ile Glu85 90 95Tyr Phe Cys Phe His Asp Arg Asp Ile Ala Pro Glu Gly Lys Thr Leu100 105 110Arg Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asp Lys Val Val Glu Arg Ile Lys Glu115 120 125Arg Met Lys Asp Ser Asn Val Lys Leu Leu Trp Gly Thr Ala Asn Leu130 135 140Phe Ser His Pro Arg Tyr Met His Gly Ala Ala Thr Thr Cys Ser Ala145 150 155 160Asp Val Phe Ala Tyr Ala Ala Ala Gln Val Lys Lys Ala Leu Glu Ile165 170 175Thr Lys Glu Leu Gly Gly Glu Gly Tyr Thr Phe Trp Gly Gly Arg Glu180 185 190Gly Tyr Glu Thr Leu Leu Asn Thr Asp Leu Gly Phe Glu Leu Glu Asn195 200 205Leu Ala Arg Phe Leu Arg Met Ala Val Asp Tyr Ala Lys Arg Ile Gly210 215 220
耐高温葡萄糖异构酶Phe Thr Gly Gln Phe Leu Ile Glu Pro Lys Pro Lys Glu Pro Thr Lys225 230 235 240His Gln Tyr Asp Phe Asp Val Ala Thr Ala Tyr Ala Phe Leu Lys Ser245 250 255His Gly Leu Asp Glu Tyr Phe Lys Phe Asn Ile Glu Ala Asn His Ala260 265 270Thr Leu Ala Gly His Thr Phe Gln His Glu Leu Arg Met Ala Arg Ile275 280 285Leu Gly Lys Leu Gly Ser Ile Asp Ala Asn Gln Gly Asp Leu Leu Leu290 295 300Gly Trp Asp Thr Asp Gln Phe Pro Thr Asn Val Tyr Asp Thr Thr Leu305 310 315 320Ala Met Tyr Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Phe Thr Lys Gly Gly Leu325 330 335Asn Phe Asp Ala Lys Val Arg Arg Ala Ser Tyr Lys Val Glu Asp Leu340 345 350Phe Ile Gly His Ile Ala Gly Met Asp Thr Phe Ala Leu Gly Phe Lys355 360 365Val Ala Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Val Leu Asp Lys Phe Ile Glu370 375 380Glu Lys Tyr Arg Ser Phe Arg Glu Gly Ile Gly Arg Asp Ile Val Glu385 390 395 400Gly Lys Val Asp Phe Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Ile Ile Asp Lys Glu405 410 415Thr Ile Glu Leu Pro Ser Gly Lys Gln Glu Tyr Leu Glu Ser Leu Ile420 425 430Asn Ser Tyr Ile Val Lys Thr Ile Leu Glu Leu Arg435 440
权利要求
1.一种耐高温葡萄糖异构酶，其特征在于具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列。
2.按照权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶，其特征在于所述耐高温葡萄糖异构酶为与序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列具有同源性≥90％的氨基酸衍生物。
3.一种权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，其特征在于具有序列表SEQ ID NO1中的核苷酸序列。
4.按照权利要求3所述耐高温葡萄糖异构酶的编码基因，其特征在于所述编码基因为与序列表SEQ ID NO1中的碱基序列具有同源性≥75％的碱基序列。
5.一种权利要求1所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用。
6.按照权利要求5所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用，其特征在于所述葡萄糖异构酶是纯酶或部分纯化的酶。
7.按照权利要求5所述耐高温葡萄糖异构酶在制备果葡糖浆中的应用，其特征在于其中耐高温葡萄糖异构酶按如下过程制备，1)基因扩增和载体构建利用引物对T15’AGA TTA CCT AGG TAC ATA TGG CTG AAT TCT ATCCAG AAA TCC CGA AA 3’和T25’ATT TCC GAT GGC GCG CCT CAC CTC AGTTCC AGA ATG GTC TTC 3’从Thermotoga neapolitana中扩增葡萄糖异构酶编码基因序列表SEQ ID NO1的碱基序列；PCR扩增反应程序为95℃3分钟，40圈循环95℃50秒、50℃30秒和72℃1分钟，最后72℃10分钟；扩增的基因连接至载体上，产生质粒；2)载体的转化；3)葡萄糖异构酶的制备与纯化接种单个含质粒pGMT-TN的菌种克隆于种子菌培养基中，得种子液；将上述种子液发酵培养，收集菌体，粉碎裂解细菌细胞，收集纯化获得葡萄糖异构酶。
全文摘要
本发明涉及葡萄糖异构酶，具体地说是一种耐高温(热)葡萄糖异构酶及其编码基因和(在生产果葡糖浆方面的)应用；其具有序列表SEQ ID NO2中的氨基酸序列和具有序列表SEQ ID NO1中碱基序列。本发明公开的耐高温葡萄糖异构酶基因来源于Thermotoga neapolitana，可直接生产果糖含量高的果葡糖浆。
文档编号C12N9/92GK1712528SQ200410020830
公开日2005年12月28日 申请日期2004年6月25日 优先权日2004年6月25日
发明者张力彬 申请人:张力彬