一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗植物病毒基因Rhp-PSP及其制备方法 和应用。
【背景技术】
[0002] 烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus,TMV)是重要的农作物病害的病原物，具有 高度的传染性和广泛的寄主范围，可侵染烟草、番茄、十字花科等38科350多种植物，危害 经济农作物并造成巨大的经济损失，20世纪末统计世界每年仅由TMV造成的损失就超过1 亿美元。近年来，由于化学防治经济作物病害会造成对人体的危害和重大的环境污染，人们 倡导使用无公害产品防治农作物病害。蛋白农药是一种新型的生物农药，对人畜无害，环境 友好，既能提高农产品附加值，又能增加经济收益，具有广阔的市场前景和良好的市场竞争 力。
[0003] 我们发现可以抑制TMV活性的蛋白成分一高氯酸溶性蛋白（perchloric acid-solubleprotein，PSP)，并命名为Rhp-PSP。高氯酸溶性酶PSP是一种核糖核酸内切 酶，在无细胞翻译体系中能抑制蛋白合成，根据报道，PSP大多数都是在动物中被发现，而在 微生物中鲜有被报道。
【发明内容】
[0004] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种植株无毒，稳定性高， 抗病性强的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，还提供了该抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法和 植物病毒防治中的应用。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
[0006] -种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的氨基酸序列为以 下a和b中的一种：
[0007] (a)具有SEQIDNO. 1所述的氨基酸序列；
[0008] (b)将所述（a)的核苷酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或者添加 形成的且具有抗植物病毒活性的氨基酸序列。
[0009] 上述的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，优选的，所述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的编码基 因为以下⑴和⑵中的一种：
[0010] (1)具有SEQIDNO. 2所述的核苷酸序列；
[0011] (2)与所述（1)的核苷酸序列具有90%以上同源性且编码所述抗植物病毒蛋白 Rhp-PSP的核苷酸序列。
[0012] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了上述抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方 法，以光合细菌PSB06的总DNA为模板，进行PCR扩增，然后连接载体，获得重组子。
[0013] 上述的制备方法，优选的，具体包括以下步骤：
[0014] S1、从PSB06 菌液中提取PSB06 总DNA;
[0015] S2、以所述PSB06总DNA为模板进行PCR反应得到PCR产物；
[0016] S3、将所述PCR产物与载体连接得到连接产物；
[0017] S4、将所述连接产物置于感受态细胞中转化，获得重组子。
[0018] 上述的制备方法，优选的，还包括扩大培养步骤，具体为：
[0019]S5、取包含所述重组子的菌液，进行质粒提取步骤得到质粒DNA;
[0020] S6、将所述质粒DNA置于感受态细胞中转化、诱导表达，得到抗植物病毒蛋白 Rhp-PSP。
[0021] 上述的制备方法，优选的，所述PCR扩增过程，以SEQIDNO. 3所述的DNA序列、SEQ IDNO. 4所述的DNA序列为引物。
[0022] 上述的制备方法，优选的，所述步骤S3具体为将PCR产物与载体按照体积比为 3~5 : 1混合，于25°C下连接反应5~lOmin。
[0023] 作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP或 上述制备方法制备得到的抗植物病毒蛋白Rhp-PSP在抗植物病毒中的应用。
[0024] 上述的应用，优选的，所述植物病毒为烟草花叶病毒。
[0025] 与现有技术相比，本发明的优点在于：
[0026] (1)本发明提供了一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，该植物病毒蛋白从光合细菌 PSB06中提取得到，其氨基酸序列与动物中提取的PSP氨基酸序列不同，表现的功能也不 同。本申请从光合细菌PSB06中提取得到的Rhp-PSP蛋白具有易分离，对植株无毒，稳定性 高，抗病性强等特点，具有开发成蛋白农药的潜质。
[0027] (2)本发明提供一种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的制备方法，利用原核表达技术进 行了抗植物病毒基因Rhp-PSP的克隆及诱导表达蛋白；利用镍柱分离纯化获得了Rhp-PSP 蛋白，可实现抗植物病毒蛋白Rhp-PSP的大批量生产，具有生产效率高、生产成本低等优 势。
[0028](3)本发明利用活性测定验证了Rhp-PSP基因表达蛋白的生物学功能，发现 Rhp-PSP蛋白在烟草上的抗TMV活性效果非常高，可应用与植物病毒，尤其是烟草花叶病毒 中的防治。
【附图说明】
[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例 中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
[0030] 图1为采用半叶摩擦法将实施例1的Rhp-PSP接种于心叶烟的效果图。
[0031] 图2为实施例2的步骤2. 3中扩增产物凝胶电泳检测结果图。
[0032] 图3为实施例2中步骤3. 3中PCR产物凝胶电泳检测结果图。
[0033] 图4为实施例2中步骤3. 9中PCR产物凝胶电泳检测结果图。
[0034] 图5为实施例3中步骤（2)中PCR产物凝胶电泳检测结果图。
[0035] 图6为实施例3中步骤（8)中PCR产物凝胶电泳检测结果图。
[0036] 图7为实施例3中对Rhp-PSP蛋白进行SDS-PAGE验证的凝胶电泳图，
[0037] 图8为实施例3中诱导得到的Rhp-PSP蛋白质谱分析结果图。
[0038] 图9为实施例1和实施例3的Rhp-PSP蛋白接种于心叶烟的对比图。
【具体实施方式】
[0039] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而 限制本发明的保护范围。
[0040] 实施例
[0041] 以下实施例中所采用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使 用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042] 实施例1 :
[0043] -种抗植物病毒蛋白Rhp-PSP，其获得方法主要包括以下步骤：
[0044] (1)沉淀蛋白：取光合细菌PSB06富集液，在lOOOOrpm下离心15min。取离心后的 上清液8L，置于冰上，往上清液中缓慢加入硫酸铵达到80 %饱和度，沉淀过夜，在4°C下以 13000rpm离心30min(可重复多次），取离心后的沉淀即为总蛋白。
[0045] (2)浓缩蛋白：将步骤（1)中得到的总蛋白加入超滤浓缩离心管中，在lOOOOrpm 下离心15min，将总蛋白浓缩至5mg/mL得到浓缩蛋白（尽可能地浓缩到最小量）。
[0046] (3)蛋白脱盐：将步骤（2)中制备得到的浓缩蛋白于S印hadex.G-25凝胶色谱中 层析脱盐，然后用PH= 7. 0的0. 01MPBS缓冲液进行洗脱，然后浓缩至5mg/mL得到脱盐蛋 白。
[0047] (4)分离纯化蛋白：将步骤（3)中制备得到的脱盐蛋白经过SephacrylS-100high Reslotution分子筛柱层析纯化，获得不同的纯化蛋白。
[0048] (5)生物测定：将步骤（4)中获得的不同纯化蛋白分别浓缩或稀释至1000yg/mL， 然后与l〇yg/mLTMV提纯液以1 : 1的比例混合，在4°C下处理8h。将经过处理后的纯化 蛋白通过半叶摩擦法接种于心叶烟，3d后观察枯斑数量。
[0049] 参见图1 :以中线叶脉为界，左半边叶接种的是10yg/mLTMV提纯液（作为对 照），右半边叶接种的是步骤（5)中的蛋白与TMV的混合液，结果显示右半边叶几乎没有枯 斑产生，左半边叶则出现由TMV引起的大量枯斑，说明步骤（5)中的蛋白与TMV的混合导致 TMV失去了致病性。
[0050] (6)测序：将具有抗烟草花叶病毒的蛋白组分进行测序，获得蛋白的氨基酸序列， 具体为：
[0051] MVEQKLAAQGVHLHEPASPVANYVSFVRTGNLLFVSGQVCFDAEGKLIAKGKLGTDVTVDQGNAAAR GCAINLLAQVKAALGDLDKVVRVVRLGGFINSAPDFIDGPKVLNGASDLMVAAF⑶KGRHARTTVGVASLPADAA VEVEGUEVA。
[0052] 本实施例中蛋白组分测序由武汉金凯瑞公司完成。
[0053] (7)根据测序出来的氨基酸序列，在PSB06的基因组全长序列中找到对应的核苷 酸序列，具体为：
[0054]atggt