一种腈水解酶、编码基因、载体及应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种生物催化制备普瑞巴林关键手性中间体
[5] -3-氰基-5-甲基己酸的腈水解酶及在制备（S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 腈水解酶（Nitrilase，EC3. 5. 5. 1)是一种重要的腈化合物转化酶，催化腈化合 物水解为相应的羧酸。氰基的传统化学水解通常需要强酸、强碱及高温回流等条件，还伴有 大量无机盐的形成，不仅给分离纯化带来困难，还造成环境污染。腈水解酶生物催化不仅高 效、反应条件温和、环境友好，还具有严格的立体和区域选择性等独特优势，在高附加值医 药化学品的合成中具有巨大应用潜力。
[0003]普瑞巴林（Pregabalin)，化学名（S)-(+)_3-氨甲基-5-甲基己酸⑴，是一种 钙离子通道调节剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放（Curr.Opin. Pharmacol. 2006, 6:108-113)。普瑞巴林对癫痫、神经病理性疼痛疗效良好，且具有使用剂 量低、副作用小、持续时间长、耐受性强等特点。已成为全球畅销药市场的"重镑炸弹"，市场 前景广阔。
[0004] 普瑞巴林巨大的市场潜力促使其合成新工艺的开发成为研宄热点。普瑞巴林为 手性药物，其S-型异构体（I)的药理活性为R-型异构体（II) 10倍。因此，关键手性中 间体的合成是普瑞巴林合成新工艺开发的关键。美国辉瑞公司Xie等报道了一株来源于 Arabidopsisthaliana腈水解酶AtNitl(J.Mol.Catal.B:Enzym. 2006, 41:75-80)。该腈水 解酶催化外消旋异丁基丁二腈水解合成（S)-3-氰基-5-甲基己酸（III)，具有较高的区域 和立体选择性。该路线中未被水解的R-异丁基丁二腈可外消旋回用，是一条原子经济性较 高的普瑞巴林关键手性中间体合成工艺。
(三）
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种能够严格区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈 (IBSN)制备（S)-3_氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物 耐受能力，更适用于工业化制备该手性中间体。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种来源于十字花科芸薹属植物芜菁（Brassicarapa)的腈水解酶 (BrNit)，所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQIDN0:1所示。
[0009] 1MSGSEEMSKALNATTPGFPDIPSTIVRATIVQASTVYNDTPKTIEKAEKFIAEAASDGAQ
[0010] 61LVVFPEAFIA GYPRGYRFGI GVGVHNEAGR DCFRRYHASA IVVPGPEVDK LAEIARKYKV
[0011] 121YLVMGAMEKD GYTLYCTALF FSSEGRFLGK HRKVMPTSLE RCIWGFGDGS TIPVYDTPLG
[0012] 181KLGAAICWENRMPLYRTSLYGKGIELYCAPTADGSKEWQSSMMHIAIEGGCFVLSACQFC
[0013] 241LRKDFPDHAD YLFTDWYPDQ HQEAIVSQGG SVIISPLGKI LAGPNFESEG LITADLDLGD
[0014] 301VARAKLYFDV VGHYSRPEIF NLTVNETPKK PVTFVSKSVK AEDDSEPQDK
[0015] 任何对SEQIDNO:1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得 的多肽片段或其变体，只要其与SEQIDNO:l所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属 于本发明的保护范围。
[0016] 进一步，为实现腈水解酶在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因 工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQIDNO:1氨基酸序列的该腈水解酶 的核苷酸序列，如SEQIDNO:2所示。
[0017] 1ATGTCTGGCTCTGAAGAAATGTCCAAAGCTCTGAATGCTACCACTCCAGGTTTCCCGGAC
[0018] 61ATCCCTAGCACCATCGTTCGCGCCACGATCGTTCAGGCTTCCACTGTATACAA CGACACT
[0019] 121CCTAAAACCATCGAAAAAGCTGAAAAATTCATCGCGGAAGCTGCTAGCGAC GGTGCGCAG
[0020] 181CTGGTGGTCTTTCCGGAAGCTTTCATCGCTGGTTACCCGCGTGGCTATCGTTTCGGCATC
[0021] 241GGTGTAGGTGTGCACAACGAGGCGGGCCGTGATTGTTTCCGCCGCTATCATGCTAGCGCG
[0022] 301ATCGTTGTCCCGGGTCCGGAGGTTGATAAACTGGCAGAAATTGCTCGTAAATACAAAGTC
[0023] 361TACCTGGTAATGGGTGCCATGGAGAAAGATGGTTATACCCTGTACTGTACTGCGCTGTTT
[0024] 421TTCAGCTCTGAAGGTCGTTTCCTGGGCAAGCACCGCAAAGTCATGCCGACGTCTCTGGAA
[0025] 481CGTTGCATCTGGGGCTTCGGTGATGGTTCTACTATCCCGGTCTACGACACCCC GCTGGGC
[0026] 541AAGCTGGGCGCCGCAATCTGTTGGGAAAACCGCATGCCGCTGTACCGTACTA GCCTGTAC
[0027] 601GGCAAAGGTATCGAGCTGTATTGCGCTCCGACTGCCGATGGCTCTAAAGAATGGCAGTCC
[0028] 661TCCATGATGCACATCGCTATCGAAGGCGGTTGTTTCGTTCTGTCTGCTTGCCA ATTCTGC
[0029] 721CTGCGCAAAGACTTCCCGGACCACGCTGACTATCTGTTTACCGATTGGTACCCGGATCAG
[0030] 781CACCAGGAAGCGATTGTAAGCCAGGGTGGTTCTGTTATCATTAGCCCACTGG GTAAAATC
[0031] 841CTGGCGGGTCCGAACTTCGAGTCTGAGGGCCTGATCACTGCAGATCTGGATC TGGGCGAT
[0032] 901GTAGCGCGTGCAAAACTGTATTTCGATGTTGTTGGTCACTACTCCCGCCCTGAGATTTTT
[0033] 961AATCTGACGGTTAACGAGACTCCGAAGAAACCGGTTACTTTCGTTTCCAAGT CCGTAAAA
[0034] 1021GCTGAGGACGACTCTGAGCCGCAGGACAAA
[0035] 任何对SEQIDNO:2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入 处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护 范围。
[0036] 本发明提供一种由所述重组腈水解酶编码基因构建的重组载体。
[0037] 本发明还提供一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
[0038] 具体地，本发明将腈水解酶编码基因BrNit同表达载体pET-28b(+)连接， 构建了含有腈水解酶基因BrNit的表达重组质粒pET-28b(+) -BrNit。将表达重 组质粒pET-28b(+) -BrNit转化至大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，获得含有重组质粒 pET-28b(+) -BrNit的重组大肠杆菌BL21 (DE3) /pET-28b(+) -BrNit。以重组菌为酶源，进行 生物催化。
[0039] 本发明还涉及所述的腈水解酶在生物催化制备普瑞巴林手性中间体（S)-3_氰 基-5-甲基己酸中的应用，具体地，所述的应用为：以含腈水解酶编码基因的重组基因工程 菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以外消旋异丁基丁二腈（IBSN)为底物，以pH值 为6. 0~10. 0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25~45°C、200rpm条件下进行区域 和立体选择性水解，反应完全后，将反应液分离纯化得到（S)-3-氰基-5-甲基己酸。
[0040] 反应式如下：
[0042] 进一步，所述缓冲液优选为Gly-NaoH缓冲液（pH10. 0)、Tris-HCl缓冲液 (pH8. 0-8. 5)或磷酸钾缓冲液（pH6. 0)，更优选pH8. 0的Tris-HCl缓冲溶液。
[0043] 进一步，所述底物初始浓度为0. 15~2.Omol/L缓冲液，优选0. 5mol/L;所述反应 体系中生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为10~50g/L缓冲液，优选20g/L，所述湿 菌体含水质量为70~90%。
[0044] 本发明所述湿菌体的制备方法为：将含腈水解酶编码基因的重组基因工程菌接种 至含有50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37°C培养12h，再以体积浓度2%接种量接 种至新鲜的含有50yg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37°C培养至菌体浓度0D_值为 〇. 4~0. 8,再向LB液体培养基中加入终浓度为0. 2mM的IPTG，28°C诱导培养10h后，将培 养液在4°C、12000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的湿菌体。
[0045] 本发明所述转化反应液采用一系列的有机溶剂（二氯甲烷、乙酸乙酯等）进行萃 取、旋蒸得到纯度较高的（S)-3_氰基-5-甲基己酸，优选乙酸乙酯，具体优选为：将转化液 离心去除大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1 /3体积，80 °C保温40min，使蛋白质变性，离心去除 变性蛋白；为了更好地去除变性蛋白，可使用循环水式真空泵进行再次抽滤，收集澄清的滤 液；然后加入2倍体积（减压蒸馏后样品）的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相，用2MHC1 调节下层水相收集液pH至4. 0,再次加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，弃下层水相，收集上层 有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的（S)-3-氰基-5-甲基己酸。
[0046] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高区域、高立体选择性水解制 备（S)-3-氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，该腈水解酶水解底物浓度可达1M以上，且ee 值保持在99%以上。通过该腈水解酶可制备普瑞巴林的重要手性中间体一一（S)-3-氰 基-5-甲基己酸；本发明中所述（S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、 条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。 (四）
【附图说明】
[0047] 图1为pET28b-BrNit重组质粒物理图谱。
[0048] 图2为腈水解酶SDS-PAGE图；其中M :蛋白质分子量标记，1 :诱导表达目的蛋白。 (五）
【具体实施方式】
[0049] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0050] 以下实施例所用主要实验材料来源为：
[0051] 大肠杆菌宿主菌株E.coliBL21 (DE3)购自Invitrogen公司，表达载体 pET_28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶XhoI和XbaI购自Fermentas公司，T4DNA 连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司；异丙基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG) 为Promega公司产品。DNAMarker和染色剂GoldView购自TaKaRa公司；AxygenDNA凝 胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen生物技术有限公司。
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