一种枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的定向固定化方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法。
【背景技术】
[0003] 枯草芽孢杆菌来源的中性蛋白酶可以水解蛋白质中由苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸 的羧基所构成的肽键，具有反应条件温和、催化效率高、专一性强、污染低等优点，在食品、 生物制品行业中应用很广泛。但采用传统的游离酶对蛋白进行水解时存在成本高、水解效 率低、难以回收等缺陷。固定化酶是将酶束缚或限制于固体材料的一定区域内。固定化酶 技术有如下优点：（1)可在常温下连续操作，无相变；（2 )能使产物与工具酶迅速分开，简化 了分离工艺；（3)可严格控制酶反应过程，并提高酶的稳定性和使用效率，从而降低成本。
[0004] 目前常用的生物酶的固定化方法-随机固定化法常导致酶活力下降和酶活不均 一的现象，这主要由三方面的原因造成：（1)较激烈的交联反应和共价结合反应，常使蛋白 质构象发生不利于反应的变化；（2)酶蛋白常常通过赖氨酸残基上的e -氨基与载体活性 基团偶合，酶表面分布有多个赖氨酸残基，与载体作用时可以采取多种空间构象，因而酶蛋 白的多点附着使得其结构发生了变异，也增加了底物接近酶活性中心时的空间位阻，不利 于保留酶游离态的均相催化活性；（3)固定化载体一般是疏水性物质，当酶直接被固定在 载体上时会改变酶的微环境，使酶蛋白构象发生折叠、失活。
[0005] 综上所述，传统固定化方法中存在酶活性位点不能充分暴露、酶的固定化量较低 等技术问题。近年来出现的定向固定化技术弥补了这些不足，定向固定化酶技术是将目标 蛋白定向固定到载体表面，使酶的活性区域充分暴露，从而最大限度的保证该固定化酶的 活性中心高效的与底物充分结合，以发挥最大的催化功能。定向固定化酶技术解决了传统 酶固定化方法中酶在任意位点与载体进行连接，使酶活性位点不能充分暴露，且酶的固定 化量较低等问题。由于具有容量大、活性高的优点，定向固定化技术日益受到重视。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是为了解决传统固定化方法中酶活性位点不能充分暴露、酶的固定 化量较低等技术问题，而提供一种枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法，该固定 化方法具有载酶量高、酶活性位点充分暴露及稳定性好等特点。
[0007] 本发明的技术原理 以药物虚拟筛选理论为基础，采用计算机辅助设计技术筛选优先结合于枯草芽孢杆菌 中性蛋白酶结合位点的亲和配基。将该亲和配基固定于载体上，并与枯草芽孢杆菌中性蛋 白酶的结合位点充分作用。再采用共价偶联的方法使枯草芽孢杆菌中性蛋白酶与亲和配基 紧密连接，从而得到酶的活性区域充分暴露、稳定性好、活力高、可重复使用的定向固定化 酶。
[0008] 本发明的技术方案 一种固定化枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的定向固定化方法，具体包括如下步骤： (1) 、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点及结合位点的确定 ① 、从SWISS-PR0T数据库中获取ID为C1KF31的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结 构，通过数据库给出的数据确定His-364、Glu-365、His-368、Tyr-379、Glu-388、Arg-417、 Tyr-445和His-449组成的催化椭圆区作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点； ② 、将枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的三维结构上传至蛋白表面三维结构计算平台，选择 远离枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点，且与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的活性位点的 氨基酸带电性质、疏水性有明显区别的SER-358,LEU-359,ASP-360,ASP-399,GLU-401， GLU-407,ASP-408 7个氨基酸残基组成的区域作为枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点； (2) 、亲和配基葡萄糖酸冼必泰在载体弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定 ① 、载体弱酸性阳离子交换树脂的预处理 将弱酸性阳离子交换树脂置于酶反应器内，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：自来水 重量=1 :1.5的比例，将弱酸性阳离子交换树脂加入到自来水中搅拌清洗2遍，去除自来 水； 然后，按照弱酸性阳离子交换树脂重量：双蒸水重量=1 :1. 5的比例，将弱酸性阳离子 交换树脂加入到双蒸水中搅拌清洗3遍，然后去除双蒸水； 然后再按照酸-碱-酸的顺序，依次分别将弱酸性阳离子交换树脂加入到加入到 0? 55mol/LHCL、0. 55mol/LNaOH和0? 55mol/LHCL中对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤， 每次洗涤完毕后用双蒸水清洗弱酸性阳离子交换树脂，直至流出液中pH至7为止，即得经 预处理过的弱酸性阳离子交换树脂； 所述的弱酸性阳离子交换树脂为丙烯酸型DIAIONWK40树脂； ② 、载体弱酸性阳离子交换树脂的活化 称取6g步骤①所得的经预处理过的弱酸性阳离子交换树脂，加入到含有1-(3-二甲氨 基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，在25°C恒温条件下搅 拌活化lh，倒去含有1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺 的交联溶液，然后用双蒸水对弱酸性阳离子交换树脂进行洗涤，直至流出液在紫外区无吸 收，即得活化后的弱酸性阳离子交换树脂； 上述的含有1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交 联溶液，即将10. 0068gl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和4. 002gN-羟基 琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6. 0,浓度为0.lmol/L的2-(N-吗啡啉）乙磺酸的水溶液中； ③ 、亲和配基葡萄糖酸冼必泰在弱酸性阳离子交换树脂表面上的固定 取6g步骤②所得的活化后的弱酸性阳离子交换树脂，加入39mL浓度为200mg/mL葡萄 糖酸冼必泰水溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的葡萄糖酸冼 必泰，即得固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂； (3) 、定向固定化枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的制备 ①、亲和配基葡萄糖洗必泰与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点的对接 将6g步骤（2)中的③所得的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱酸性阳离子交换树脂置于 30mL浓度为lmg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液中，于25 °C下反应2h，以使 亲和配基葡萄糖酸冼必泰的氨基与枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点进行充分对接，反 应完成后倒掉上清液，即得对接有枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱 酸性阳尚子交换树脂； 上述的浓度为lmg/mL的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶磷酸盐缓冲溶液，配制所需的溶剂 为pH7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸氢二钠水溶液或pH7.5、浓度为0.02mol/L的磷酸二氢 钠水溶液； ②、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶在载体弱酸性阳离子交换树脂上的固定 称取6g①中所得的对接有枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的固定有葡萄糖酸冼必泰的弱 酸性阳离子交换树脂，加入到30ml含有1-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺的交联溶液，室温下搅拌反应12h，反应完毕后，用双蒸水洗去未固定的 枯草芽孢杆菌中性蛋白酶，即得定向固定化的枯草芽孢杆菌中性蛋白酶； 上述的含有1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的交 联溶液，即将10. 0068gl-(3-二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亚胺盐酸盐和4. 002gN-羟基 琥珀酰亚胺溶解于30mL，pH6. 0,浓度为0.lmol/L的2-(N-吗啡啉）乙磺酸的水溶液中所 得。
[0009] 本发明的有益效果 本发明的一种固定化的枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶的制备方法，由于采用了计算机辅 助设计技术对亲和配基进行虚拟筛选，使得枯草芽孢杆菌中性蛋白酶的结合位点定向