一株枯草芽孢杆菌及其在小麦纹枯病防治中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物领域，具体设及一种枯草芽抱杆菌及其在小麦纹枯病防治中的 应用。
【背景技术】
[0002] 小麦纹枯病主要是由禾谷丝核菌(化izoctonia cerealis)侵染引起的一种±传 真菌病害，其分布范围广，几乎遍及世界各地溫带小麦种植区。小麦纹枯病发生蔓延迅速， 对小麦产量影响极大，一般田块可减产10 %~30 %，重病田块减产50 % W上，个别田块甚至 绝收。目前，生产中主要采用立克秀、适乐时、Ξ挫类等化学杀菌剂进行防治。近几年来随着 杀菌剂的大量使用，加之使用中存在用药的单一性及用药的不合理性等问题，使得小麦纹 枯病菌对一些常用杀菌剂的敏感性降低，化学防治效果逐渐降低。杀菌剂污染环境和农副 产品，也大幅度降低有益微生物的数量，因此必须开辟新的防治途径W提高综防效益。利用 与植物亲和能力强的细菌来抑制该病原生长、繁殖、进入植物体W及提高植物的抗病性，为 有效控制该病害的发生提供了可能。国内外开展了应用细菌防治该病的探寻研究，并表现 出明显的效果。±壤中细菌资源丰富，其种的数量庞大，利用其筛选抗菌的菌株，从微生物 中寻找发现新型先导化合物，对促进新型生物农药的开发和创制具有十分重要的意义。最 新研究表明细菌在病害生物防治、固氮增收方面有潜在的应用和开发价值。
[0003] 因此，寻找一种能防治小麦纹枯病的细菌就成为亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004] 本发明目的是提供一株从±壤中分离得到的对小麦纹枯病菌具有括抗作用的芽 抱杆菌（Bacillus subtil is )BB-B。
[0005] 本发明的技术方案为:一株枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)BB-B，保藏编号为 CGMCC NO . 9373，2014年6月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、 (CGMCC)进行保藏。
[0006] 一种微生物制剂，活性成分为枯草芽抱杆菌BB-B或/和其代谢产物。
[0007] 枯草芽抱杆菌BB-B或上述微生物制剂在小麦纹枯病防治中的应用。
[000引本发明的枯草芽抱杆菌BB-B能产生蛋白酶、几下质酶、纤维素酶和生物表面活性 素，可W为生防菌剂的开发奠定基础。
[0009]本发明菌株BB-B能括抗小麦纹枯病菌-禾谷丝核菌，通过检测分析发现其能产生 蛋白酶、几下质酶，纤维素酶和生物表面活性素。不同浓度的发酵液对小麦纹枯病均表现出 一定的防治作用，并且随发酵液浓度的增加，其防治效果逐渐增加。其中，75%浓度发酵液 的防效最好，达到67.3%，显示出有较高的利用价值。因此，本发明的菌株可W有效地应用 于小麦纹枯病的防治，对于解决小麦白粉病害具有重要意义。
[0010]保藏信息
[0011] 本发明的枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)BB-B，已于2014年6月23日在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、(CGMCC)进行保藏，保藏编号为CGMCC NO.9373， 地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所。
【附图说明】
[001 ^ 图巧括抗细菌的筛选对照;其中，A为对照，B为括抗细菌BB-B;
[001引图2为括抗细菌邸-B的系统进化树；
[0014] 图3芽胞杆菌BB-B蛋白酶检测结果；
[0015] 图4几下质酶检测实验结果；
[0016] 图5标准葡萄糖标准曲线。
【具体实施方式】
[0017]实施例1括抗细菌的筛选
[0018] 采用五点取样法在郑州西郊小麦种植区中取适量±样，装入无菌聚乙締塑料袋， 封口。采用稀释平板分离法分离纯化菌株，从±壤中分离的66株细菌中得到一株对禾谷丝 核菌有较好抑制作用的细菌（图1 )，命名为BB-B，对禾谷丝核菌的抑制率达75.33%。
[0019] 实施例2括抗细菌BB-B的形态分析和生理生化鉴定
[0020] 显微镜观察发现，细菌BB-B呈浅黄褐色，菌落分布均匀，质地光滑，菌落边缘乳白 色，不透明。
[0021 ]对菌株进行生理生化鉴定，结果见表1。
[0022] 表1括抗细菌BB-B的生理生化鉴定结果
[0023]
[0024] 注：V'表示阳性；表示阴性。
[0025] 根据细菌的生理生化鉴定结果，结合《伯杰细菌鉴定手册》，其中关于芽抱杆菌特 征的描述与细菌BB-B比较符合，初步鉴定BB-B为芽抱杆菌。
[0026] 实施例3括抗细菌BB-B的16rDNA序列鉴定
[0027] 提取基因组DNA，采用16S rDNA序列通用引物进PCR扩增，用1.0%浓度的琼脂糖凝 胶电泳检测发现一个长度约1500bp长度的扩增片段即为括抗细菌BB-B的16S rDNA序列。将 目的DNA片段进行回收、纯化、克隆、测序后得到1500bp大小的序列，运用生物信息数据库 NCBI中的BLAST工具对所得序列进行捜索比对，结果见下图。从BLAST比对结果中选取高度 相似、种属地位地位确定的菌株，获得其16S rDNA序列，采用DNAMAN软件构建系统进化树 (图 2)。
[0028] 根据运11个菌株建立系统进化树，如图2所示，菌株间种属地位接近，在运11个菌 株中括抗细菌BB-B的相似度至少高于96%，基于BB-B与芽抱杆菌属的高度相似，确定BB-B 为枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)。
[0029] 实施例4枯草芽胞杆菌BB-B发酵液的制备
[0030] 将括抗细菌BB-B分别挑取一环接入装有20ml LB液体培养基的lOOmlS角瓶中，在 36°C，160r/min条件下摇床培养10-1化。次日，按4%的接种量，吸取菌液接种到装有lOOmL 发酵培养液的250mLS角瓶(4瓶，空白试验4 %接种量用LB液体培养基代替)后，36°C，160r/ min,摇床培养4她。经100(K)r/min，4°C离屯、15min后（无菌水系滤膜0.22化川欠集上清液(括 抗细菌的发酵液），4°C保存备用。
[0031] 实施例5枯草芽胞杆菌BB-B的活性物质检测分析
[0032] 1.蛋白酶定性检测
[0033] 蛋白酶通过脱脂牛奶琼脂平板检测。向灭菌的干酵母粉琼