2] 图3为利用实施例1检测样本GART基因隐性有害突变位点的基因型。（A)为PCR 产物的电泳胶图，（B)为PCR产物经酶切后的电泳胶图。图中泳道M为分子量标准，泳道1 为携带者，2-6为野生型。
【具体实施方式】
[0033] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0034] 实施例1
[0035] 本实施例对6头荷斯坦牛的冷冻精液样本进行检测。
[0036] ⑴DNA提取
[0037] 采用高盐法从各样本的牛冻精中提取基因组DNA，如下为具体步骤：
[0038] 1)配制冻精裂解液（80mL):先加入60mL双蒸水后，加入0. 5mol/L的EDTA(PH= 8. 0)2mL,lmol/L的Tris.CL(PH= 8. 0)lmL，10% 的SDS10mL，DIT0? 77g，NaCl0? 29g，定 容到80mL;
[0039] 2)将细管冻精转移到2mL离心管中，加入500yL生理盐水，涡旋离心，弃废液保留 沉淀，重复以上操作一次；
[0040] 3)向沉淀中加入400yL冻精裂解液、lOOyL20%的SDS，涡旋，最后加入10yL 蛋白酶K(20mg/mL)，充分混匀，56°C消化20~22h;
[0041] 4)消化结束，加入300yL饱和食盐水，颠倒2~3min，4°C下12000rpm离心lOmin， 去除蛋白质杂质，将上清液转管保留；
[0042] 5)加入1000yL冰镇的无水乙醇，颠倒1~2min，12000rpm离心2min，弃去上清 液，保留DNA沉淀；
[0043] 6)用500yL75%乙醇洗涤2次，晾置几分钟使酒精挥发，最后加入300yL56°C 的TB缓冲液溶解，调整DNA浓度到50-100ng/yL。
[0044] (2)PCR扩增
[0045] PCR引物组合：
[0046]上游引物（GART-F)5, -GAAGGTGTCCTCTATGCTGG-3'；
[0047]下游引物（GART-R) 5 ' -TITTAAGAAGTGGGAGGATC-3 '。
[0048]PCR反应体系：总体积25yL，其中10XBuffer2. 5yL，dNTP混合物（各 2. 5mM)2yL，Taq酶（5U/yL)0. 5yL，上下游引物（20yM)各0? 5yL，基因组DNA模板 1yL， ddH2018yL〇
[0049]PCR反应条件：95°C预变性8min;然后35个循环，95°C变性30sec，60°C复性 30sec，72°C延伸lmin;最后 72°C延伸 10min〇
[0050]仪器为AppliedBiosystems9700 型PCR仪。
[0051] (3)PCR产物的凝胶电泳检测
[0052]制作浓度为2%的琼脂糖凝胶，取每个样品的PCR产物3yL点样，在TAE缓冲液中 120V电压下电泳20min。在凝胶成像系统中观察电泳结果，为单一的276bp条带。
[0053] (4)限制性酶切
[0054]PCR产物酶切条件为：酶切反应总体积20yL，其中PCR产物10yL，MseI内切酶 (10000U/mL) 1yL，lOXBuffer2yL，ddH20 7yL。在水浴锅中 37°C消化 2 小时。
[0055] (5)酶切产物的凝胶电泳检测
[0056]制作浓度为4%的琼脂糖凝胶，取每个样品的酶切产物4yL点样，在TAE缓冲液中 110V电压下电泳25min。
[0057] 在凝胶成像系统中观察电泳结果，见图3。根据酶切条带模式判定每个样品的基因 型：泳道1内观察到3个条带，大小符合（154bp，117bp，58/59bp)，因此为携带者；泳道2-6 内只有2个条带，大小符合（154bp，58/59bp)，因此为野生型纯合子。
[0058] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种用于检测牛GART突变基因型的引物对，其特征在于，所述引物对具体为： 上游引物GART-F:5' -GAAGGTGTCCTCTATGCTGG-3' ； 下游引物GART-R:5' -TITTAAGAAGTGGGAGGATC-3'。2. -种检测牛GART突变基因型的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： DPCR扩增：以待测样本基因组DNA为模板，利用权利要求1所述引物对进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物； 2) 扩增产物酶切：用限制性内切酶MseI对PCR扩增产物进行酶切消化，得到酶切产 物； 3) 电泳检测：将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过观察酶切产物的电泳条带，判断 待测样本的基因型。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过观察酶切产物的电泳条带是否存在 长度为117bp的条带，判断待测样本是否为突变基因型。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR反应体系以25yL计为：5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95 °C预变性8min;95°C 变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸lmin，35个循环；最后72°C延伸lOmin。6. 根据权利要求2-5任一项所述的方法，其特征在于，酶切反应体系以20yL计为：7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，酶切反应条件为：在水浴锅中37°C消化2 小时。8. 根据权利要求2-7任意一项所述的方法，其特征在于，所述扩增产物在进行酶切之 前，利用凝胶电泳检测长度为276bp的条带存在。9. 根据权利要求2-8任意一项所述的方法，其特征在于，所述基因组DNA采用高盐法从 牛冻精中提取。10. -种含有权利要求1所述引物对的试剂盒。
【专利摘要】本发明涉及分子生物学，具体提供了一种用于检测牛GART突变基因型的引物对，所述引物对如SEQ ID No.1-2所示。本发明进一步提供了一种检测牛GART突变基因型的方法，包括PCR扩增、扩增产物酶切和电泳检测酶切产物，判断待测样本基因型。本发明所设计的引物除了能够扩增牛GART基因的目的突变位点外，所扩增片段内还包含另外2个相同的酶切位点，能够避免因酶切不完全或酶切反应失败而导致的假阳性，从而确保检测的准确性。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN104962556
【申请号】CN201510338374
【发明人】张毅, 劳兰兰, 刘林, 石万海, 孙东晓, 俞英, 王雅春, 张胜利
【申请人】中国农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月17日