利用级联的dna链替换反应的细胞内非编码rna检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞内非编码RNA分子检测技术领域，具体涉及利用级联的DNA 链替换反应有效的释放具有荧光基团修饰的信号链分子，从而实现非编码RNA，尤其是 microRNA(miRNA)的检测。 技术背景
[0002] 在人体组织以及细胞中存在一些不翻译成蛋白，但是具有重要作用的RNA分子， 我们称之为非编码RNA。例如人体细胞中不可或缺的转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)， 还有一些表达量相对较低的snoRNA,microRNA,siRNA,snRNA,exRNA,piRNA和longncRNA。 其中MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA 分子。由于miRNA能够很好的识别并配对后转录基因进而调控蛋白的表达，所以它与动物 体内的生物过程息息相关。目前已经有研宄表明：miRNA的异常行为会导致疾病的出现，包 括心血管疾病，神经发育失常，甚至癌症。[Nature，2012, 482, 347.]所以在癌症的诊断以及 治疗过程中miRNA的浓度都是一个重要的生物指标。
[0003] 目前为止，通用的miRNA检测方法包括：Northern Blotting, miRNA微阵列，和 qRT-PCR。[Chem. Rev.，2013, II3, 6207.]其中Northern Blotting是最经典的miRNA检测 手段，但是它本身检测灵敏度较低，并且需要大量的样品。而miRNA微阵列具有高通量检测 的优势，但是检测需要的时间很长，并且精度不高。qRT-PCR检测手段具有高精度，高灵敏 度的特点，但是需要长时间的扩增步骤并且对操作人员具有一定的技能要求，这在实时检 测中是一个很大的问题。但是上述方法最大的一个问题是所有的实验都是基于细胞裂解处 理，无法实时的反映出细胞内部真实的miRNA的作用机制。
[0004] 然而为了能更加深入了解miRNA在细胞内调控基因表达的真实信息以及探索 miRNA在细胞内的反应的动态过程，实现细胞内的miRNA的检测则尤为重要。现如今体内 miRNA检测手段主要分为原位杂交技术和动态成像技术。在动态成像技术中基于分子信标 成像是一个非常重要的手段。借助特殊的转染技术将荧光标记的分子信标导入细胞内，分 子信标与目标miRNA分子配对后发生结构的转变会导致荧光信号的出现，最终实现miRNA 的检测。[Biomaterials，2012, 33, 6430.]但是这些技术中存在一个明显的问题就是每次的 信号分子的输出都伴随着目标分子的消耗。而在细胞中的miRNA分子表达非常的有限，所 以上述的技术在实现细胞内miRNA分子的检测具有很大的限制。
[0005] 因此，为了克服现有技术中细胞内miRNA分子检测的困难，本发明人进行了深入 研宄，发现利用级联的DNA链替换反应实现细胞内microRNA检测具有简单操作，可以实现 低浓度检测等特点，在现有的技术文献的进一步检索中没有发现有关级联的DNA链替换反 应在细胞内miRNA检测的报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种新的细胞内miRNA检测方法。该检测手段无需严格 的操作条件，操作简单。在该新的组装方法中首次将级联的DNA链替换反应应用到细胞内microRNA检测。其原理见图1，首先在DNA分子探针的制备中需要先将基底链与信号链杂 交。在这种情况下信号链末端的荧光基团（例如FAM)会与基底链末端的淬灭基团（例如 BHQ-1)非常的靠近，荧光基团被淬灭，没有信号的输出。需要导入到细胞内的DNA分子探针 中除了上述的双链DNA，同时也包括一条"燃料链"。分子探针导入到细胞以后，目标miRNA 序列首先与双链DNA上的裸露的一端作用，进而发生链替换反应，释放出信号链分子。该反 应的中间产物与"燃料链"分子发生链替换反应，释放出miRNA。经过上述的级联的DNA链替 换反应，信号链被释放，而且miRNA链得到有效的回收，能够用于触发新的一轮的反应。该 发明充分利用了级联的DNA链替换反应在信号放大上的能力，最终实现了细胞内miRNA分 子的检测。
[0007] 具体地，本发明提供以下各项：
[0008] 本发明一方面提供一种DNA分子探针组合，所述DNA分子探针组合包括双链DNA 寡核苷酸和单链DNA寡核苷酸两部分，所述双链DNA寡核苷酸由一端带有焚光基团修饰的 信号链与一端修饰有淬灭基团的基底链按照1:1的比例杂交而成，并且基底链比信号链在 未修饰淬灭基团端多5个碱基，形成裸露端。
[0009] 在优选的实施方案中，所述荧光基团修饰在信号链的5'端，所述淬灭基团修饰在 基底链的3'端，相应的，基底链在5'端多出5个碱基，形成裸露端。
[0010] 在优选的实施方案中，所述荧光基团为FAM或Cy5,淬灭基团为BHQ-1或BHQ-2。
[0011] 另一方面，本发明提供一种检测生物体内非编码RNA分子的方法，所述方法包括 以下步骤：
[0012] 1)根据待测非编码RNA分子设计互补的信号链和基底链，以及与基底链部分互补 的单链DNA分子，S卩燃料链，其中，待测非编码RNA分子与基底链部分互补，且信号链在一端 修饰有荧光基团，基底链在一端修饰有淬灭基团，并且基底链比信号链在未修饰淬灭基团 端多5个碱基，形成裸露端；
[0013] 2)将互补的信号链和基底链按照1:1的比例杂交形成双链；
[0014] 3)将步骤2)中形成的双链与所述燃料链一起转入细胞；
[0015] 4)成像并观察。
[0016] 在优选的实施方案中，所述荧光基团修饰在信号链的5'端，所述淬灭基团修饰在 基底链的3'端，相应的，基底链在5'端多出5个碱基，形成裸露端。
[0017] 在优选的实施方案中，所述信号链的长度比被检测非编码RNA，尤其是miRNA短 1-2个碱基。
[0018] 在优选的实施方案中，所述燃料链的长度比被检测非编码RNA，尤其是miRNA长 1-2个碱基。
[0019] 在优选的实施方案中，所述部分互补是指除去末端多出的碱基，其余部分完全互 补。
[0020] 在优选的实施方案中，所述非编码RNA分子为miRNA，优选为miRNA-21、 miRNA-122〇
[0021] 在优选的实施方案中，对于miRNA-21，所述DNA分子探针组合中，所述 基底链序列为BHQ-1-CCAATCAACATCAGTCTGATAAGCTA(SEQIDN0:1)，所述信号 链的序列为TATCAGACTGATGTTGATTGG-FAM(SEQIDNO:2)，所述燃料链的序列为CTTATCAGACTGATGTTGATTGG(SEQIDNO：3)〇
[0022] 在优选的实施方案中，对于miRNA-122,所述DNA分子探针组合中，所述 基底链的序列为BHQ-2-CTACCAAACACCAITGTCACACTCCA(SEQIDNO:4)，所述信号 链的序列为TGTGACAATGGTGTTTGGTAG-Cy5(SEQIDNO:5)，所述燃料链的序列为 AGTGTGACAATGGTGTTTGGTAG(SEQIDNO：6)〇
[0023] 本发明的另一个方面提供所述DNA分子探针组合用于靶分子及靶分子所在细胞 在生物体内成像的用途。
[0024] 在优选的实施方案中，所述细胞为肿瘤细胞，优选为Huh7细胞。
[0025] 在优选的实施方案中，所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA分子，更优选 为miRNA-21、miRNA-122。
[0026] 本发明的另一个方面提供一种非编码RNA分子的检测试剂盒，所述试剂盒包含所 述DNA分子探针组合。
[0027] 本发明的另一个方面提供试剂盒，所述试剂盒包含所述DNA分子探针组合。
[0028] 在优选的实施方案中，所述靶分子为非编码RNA分子，优选为miRNA分子，更优选 为miRNA-21、miRNA-122。
[0029] 本发明提供如下方案和技术效果：
[0030] 〈1〉.合理设计DNA分子探针，使细胞内的目标链能够触发级联的DNA链替换反应 的发生，，进而有效的释放具有荧光基团修饰的信号链，通过荧光显微镜观察肿瘤细胞的成 像，最终实现基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测。
[0031] 〈2〉.根据〈1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测的方法， 其特征在于设计了一种特殊的DNA分子探针。该分子探针包含两部分：首先是一种特殊的 双链DNA，该双链由带有荧光基团（例如：FAM)修饰的信号链与末端修饰有淬灭基团（例如 BHQ-1)的基底链杂交而成；另一部分则是称为"燃料链"的单链DNA。
[0032] 〈3〉.根据〈1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测的方法， 其特征在于设计的DNA分子探针能在细胞内miRNA分子存在的条件下发生级联的DNA链替 换反应。
[0033] 〈4〉.根据〈1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测的方法， 其特征在于利用级联的链替换反应释放有荧光标记的DNA信号链，实现肿瘤Huh7细胞的成 像。
[0034] 〈5〉.根据〈1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测的方法， 其特征在于通过肿瘤细胞的成像可以达到miRNA-21的检测的目的。
[0035] 〈6〉.根据〈1>所述的基于级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测的方法， 其特征在于该检测方法适用于其他细胞或者组织内各种类型的miRNA序列的检测，同时也 适用于生物体内各种非编码RNA分子的检测。另外一方面，包含有这些RNA分子的目标链 的细胞或者组织的成像能在该技术下得以实行。
[0036]本发明是首次利用级联的DNA链替换反应实现细胞内miRNA检测。本发明是一种 全新的miRNA分子检测手段，该检测手段无需严格的操作条件，操作简单。特别是在miRNA 分子低表达的细胞或者组织中具有非常好的优势。解决了在之前的检测技术中存在检测体 系中信号分子输出中伴随着目标链损失的巨大困难。检测的范围也适用于其他类型的非编 码RNA分子。同样该技术也是细胞以及其他组织成像中的一种重要手段。
【附图说明】
[0037] 图1为基于级联的DNA链替换反应实现