专利名称：用于产生rna 病毒的方法和辅助病毒的制作方法
用于产生RNA病毒的方法和辅助病毒本发明提供了利用线性表达构建体，在有辅助病毒的情况下产生负链节段性RNA病毒的方法，其中所述辅助病毒在NA蛋白的N端胞质区内包含至少一个氨基酸修饰。
背景技术：
负链RNA病毒是包含多种重要人类病原体的一组动物病毒，包括流感、麻疹、腮腺炎、狂犬病、呼吸道合胞、埃博拉和汉坦病毒。这些RNA病毒的基因组可以是单分子或者节段性的，是单链极性的(_)。这些病毒共有的两个关键要求是它们的基因组RNAs必须能有效地拷贝为病毒RNA，后一种形式可以被用来整合到子代病毒粒子中；和有效地转录为mRNA,然后被翻译为病毒蛋白。真核宿主细胞一般不含有复制RNA模板或者由负链RNA模板翻译多肽的机制。因此，负链RNA病毒编码和携带RNA依赖性RNA聚合酶以便催化子代病毒组装所需的新基因组RNA，以及翻译为病毒蛋白的mRNAs的合成。基因组病毒RNA必须包装到病毒粒子中病毒才能被传播。RNA病毒内在组装过程发生的子代病毒粒子 的组装以及蛋白/蛋白相互作用都是相似的。病毒粒子的形成保证RNA基因组在单一宿主内或者不同宿主生物体之间从一个宿主细胞到另一个细胞的有效传播。含有带包膜单链RNA(负义基因组)的病毒家族分为具有非节段性基因组(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、纤维病毒科(Filoviridae)和博尔纳病病毒(Borna Disease Virus)、披膜病毒科(Togaviridae))和具有节段性基因组(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和沙状病毒科(Arenaviridae))的组。正粘病毒科家族包括甲、乙和丙型流感病毒以及索哥托(Thogoto)和多理(Dhori)病毒，和传染性娃鱼贫血病毒(salmon anemia virus)。流感病毒粒子由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状核衣壳)和里面覆盖基质蛋白(Ml)的脂蛋白包膜构成。甲型流感病毒的节段性基因组由8个线性负极性的单链RNAs构成，这些RNAs编码11个多肽(某些A型流感病毒株中是10个)，包括:形成核衣壳的RNA依赖性RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和核蛋白(NP);基质膜蛋白(Ml, M2);从含有液体的包膜突起的两个表面糖蛋白:血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA);非结构蛋白(NSl)和核输出蛋白(NEP)。多数甲型流感病毒株还编码第11个蛋白(PB1-F2)，据信具有促凋亡特性。病毒基因组的转录和复制发生在细胞核内并通过在细胞质膜上出芽进行组装。在混合感染时病毒可能发生基因重配。流感病毒借助HA吸附到细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖上。病毒粒子被内吞后，HA分子在细胞内体中发生构象改变，促进膜的融合，从而引发病毒脱壳。核衣壳迁移到细胞核内，病毒mRNA在此被转录。病毒mRNA的转录机制很独特，其中病毒的核酸内切酶将细胞的异源mRNAs带帽5’端切下作为引物由病毒转录酶转录病毒的RNA模板。转录物在距离模板末端15-22个碱基的位点终止，oligo (U)序列在此作为信号添加poly (A)序列。在这样产生的八个病毒RNA分子中，六个是单顺反子信使RNA，直接被翻译成代表HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PBl和PA的蛋白。另外两个转录物被剪切，每个生成两个mRNAs，分别按照不同的阅读框翻译得到M1、M2、NS1和NEP。换句话说，八个病毒RNA节段编码十一个蛋白:9个结构蛋白和2个非结构蛋白(NSl和近年鉴定到的 PB1-F2)。甲型流感病毒的神经氨酸酶(NA)分子是II型膜糖蛋白，带有未被切割的氨基端信号/锚定结构域和暴露在细胞质中的六个氨基酸的尾巴。该六氨基酸细胞质尾巴在所有甲型流感病毒NA亚型中高度保守。针对流感病毒，特别是高致病性禽流感病毒的现代疫苗的生产依赖于反向遗传学，该技术使得能 够由DNA产生流感病毒。第一个构建负链RNA流感病毒的反向遗传学系统包括与体内重构核糖核蛋白(RNP)复合体混合的单个病毒基因的转染，和随后用流感辅助病毒进行的感染。RNP复合体是通过将合成的RNA转录物与来自流感病毒的纯化NP和聚合酶蛋白(PB1、PB2和PA) —起温育制备的，辅助病毒被作为病毒蛋白和其他vRNAs的胞内来源(Luytjes et al.，1989，Cell, 59，1107-1113)。Neumann等(1994，Virology, 202，477-479)在感染流感病毒的细胞中通过从鼠RNA聚合酶I启动子应答型质粒表达RNA，形成了病毒模型RNAs的RNP。Pleschka等(1996，J.Virol.，4188-4192)描述了由基于质粒的表达载体重构RNP复合体的方法。由含有截短的人聚合酶I (poll)启动子和核酶序列的质粒表达得到了病毒RNA样转录物，其中所述核酶能够通过自催化切割产生3'末端。所述poll驱动的质粒与polII应答型质粒一起转染人293细胞，表达了病毒PB1、PB2、PA和NP蛋白。但是转染效率非常低，每次转染产生大约10个转染子病毒粒子。此外，这种基于质粒的策略需要依赖辅助病毒。在W001/04333中，利用一组12个表达质粒构建了节段性负链RNA病毒用于表达基因组vRNA节段和RNP蛋白。W001/04333中描述的载体基于众所周知的pUC19或pUC18质粒。根据描述，该系统需要表达流感病毒的8个节段的一组8个质粒，以及另外的表达核蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶的亚基(PB1、PB2、PA和NP)的4个质粒。W000/60050报道了至少两个的一组载体，其中载体包含的启动子与流感病毒节段cDNA(PA, PBl, PB2, HA, NP, NA, M)和转录终止序列可操纵连接；和至少两个包含与流感病毒节段DNA(PA，PBl，PB2，NP)可操纵地连接的启动子的载体。该系统试图通过使用含有八个RNA聚合酶I转录盒的质粒，将病毒RNA的合成合并在一个质粒上，从而克服使用大量不同载体带来的困难。W001/83794公开的环形表达质粒包含插入在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号。本申请中的术语载体被描述为质粒，即通常是双链DNA构成的独立分子，能够接受另外的外来DNA并且可以容易地导入合适的宿主细胞。W02009/00891描述了线性表达构建体及其表达流感病毒基因节段的用途。Ozawa M.等(J.Virol, 2007，vol.81，pp.9556-9559)描述了利用腺病毒载体产生
甲型流感病毒的反向遗传学系统。Hoffmann E.等(Virology, 2000，267，pp.310-317)公开了利用双向转录构建体，从一个模板产生病毒RNA和mRNA的流感病毒制备系统。Hoffmann et al.(Proc.Natl.Acad.Sc1.，2002, 99，pp.11411-11416)中也公开了从八个质粒对乙型流感病毒的拯救。病毒性疾病导致的地区性和全球性流行病仍然在夺走人类的生命和影响着全球经济。流感在全球造成了数以百万的工作日的损失和就诊，成千上万的入院(Couchl993, Ann.NY.Acad.Sci685;803,)> 过多死亡(Collins & Lehmann1953PublieHealth Monographs213:1;Glezenl982Am.J.Public Health77:712)以及几十亿欧兀的医疗费用(Williams et al.1988, Ann.1ntern.Med.108:616) 健康成年人接种疫苗时，现有的疫苗可以防止70 - 90%的临床病例。这一水平在65岁以上人群中降低到30 - 70%，对于养老院中65岁以上人群又进一步下降(Strategic Perspective2001:The AntiviralMarket.Datamonitor.p.59)。病毒的经常性抗原改变也是造成大量死亡的原因，因为即使每年接种疫苗也不能保证起到保护作用。因此，美国的死亡人数从1976/77年的16,363人增加到 1998/99 年的该数字的四倍(Wall Street Journal, Flu-related deaths in USdespite vaccine researches.January7, 2003)。特别是在全球性病毒性疾病大爆发的情况中，在疾病爆发后立即提供疫苗接种或治疗至关重要。考虑到对提供针对病毒性疾病的有效保护和治疗的迫切需求，仍然需要开发经济有效快速的用于病毒生产的表达系统，以便克服现有表达技术的缺点和困难，提供替代的病毒表达方法。该目的通过提供本申请的实施方案得以实现。
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发明概述本发明提供了一种替代技术，其中在有辅助病毒的情况下，利用线性表达构建体表达了 RNA病毒。我们惊奇地发现在有辅助病毒的情况下，使用至少一个线性表达构建体提供了快速拯救病毒粒子的有效工具，其中所述线性表达构建体不含任何复制和/或选择序列，但在RNA聚合酶II (polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间插入RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，在poll启动子和poll终止信号之间插入HA或NA基因节段。与已知技术所用的方法相反，不需要在细菌细胞内进行克隆步骤，并且不需要用病毒基因组的所有节段来转染宿主细胞。具体来说，只需要用一或两个节段，即编码HA和/或NA蛋白的基因进行转染就能有效表达整个病毒。因此，可以极大地减少转染和表达足够量病毒粒子所需的时间。例如，PCT/EP2008/058182(通过引用并入本文)中描述的线性表达构建体可以用来在有辅助病毒的情况下，开发包含RNA病毒，具体来说是无论野生型、突变还是重配毒株的流感病毒的疫苗。这提供了在发生地区性或全球性流感大流行时，快速制备所需任何病
毒疫苗的工具。此外，本发明提供了改进的去除辅助病毒的方法。因为使用了在高度保守的细胞质结构域内含有氨基酸修饰的改造过的NA蛋白，对包含来源于辅助病毒的NA蛋白的病毒粒子进行去除的效率很高。根据发明，术语“细胞质(cytoplasmic) ”和“胞质溶胶(cytosolic) ”可以互换使用。根据发明的再一个实施方案，提供了为了改进选择和纯化的目的而带有改造过的切割位点的HA节段。
图1:图1a和图1b是显示线性双向表达构建体制备过程的示意图。图1a显示通过PCR扩增分别产生的F1、F2和F3片段。图1b显示利用寡核苷酸P4和P6，通过重叠PCR(overlapping PCR)产生的片段 F4。图2: Vero细胞先转染编码A/Brisbane/10/2007 (H3N2)样病毒的HA和NA节段的cDNAs，再感染IVR-116-delNSl-EL-NAdel辅助病毒，从Vero细胞收获病毒，1/1000稀释，在有或无A/New Caledonia/20/99 (HlNl) HA和NA特异性IgG的情况下温育过夜。之后，将Vero细胞感染并在含有5 yg/ml胰蛋白酶的无血清培养基中于37° C温育。如上所述，将特异于A/New Caledonia/20/99HA和NA的纯化IgG加入培养基。形成CPE后，收获病毒，经RT-PCR分析是否存在来源于A/New Caledonia/20/99 (HlNl)和A/Brisbane/10/2007 (H3N2)的 HA 和 NA 节段。发明详述本发明涉及制备负链节段性RNA病毒的方法，所述方法的步骤包括 a)提供不含任何扩增和/或选择序列的线性表达构建体，该构建体包含均插入在RNA聚合酶II(polII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，该构建体还包含插入在poll启动子和poll终止信号之间的HA和/或NA基因节段，b)用所述线性表达构建体转染宿主细胞，c)用含有辅助病毒HA和/或NA蛋白的辅助病毒感染所述宿主细胞，其中所述NA蛋白包含位于N端细胞质结构域的至少一个氨基酸修饰，d)培养所述宿主细胞来增殖病毒粒子，e)选择病毒粒子，所述病毒粒子含有⑴来源于线性表达构建体的HA和/或NA蛋白，但是不含有(ii)辅助病毒HA和NA蛋白，或其节段，其中所述选择基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特征，并且任选地其中通过分析核酸或氨基酸序列确定不含辅助病毒HA和NA蛋白。更具体地说，制备负链节段性RNA病毒粒子的方法可以包括提供不含扩增序列、选择序列或两种序列都不含的线性表达构建体，其中所述构建体包含插入在RNA聚合酶II (polll)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，其中线性表达构建体还包含插入在poll启动子和poll终止信号之间的HA基因节段、NA基因节段或者这两种节段；用线性表达构建体转染宿主细胞；用辅助病毒感染宿主细胞，其中所述辅助病毒包含编码HA蛋白、NA蛋白或者这两种蛋白的基因组RNA ;其中所述辅助病毒NA蛋白包含位于N端细胞质结构域的至少一个氨基酸修饰；培养宿主细胞，以产生子代病毒粒子，其中至少某些子代病毒粒子包含来源于线性表达构建体的HA蛋白或NA蛋白；和从子代病毒粒子中选择候选病毒粒子，其中所述候选病毒粒子包含:i)来源于线性表达构建体而非辅助病毒的HA蛋白(所述线性表达构建体包含HA基因节段时)；和ii)来源于线性表达构建体而非辅助病毒的NA蛋白(所述线性表达构建体包含NA基因节段时)。根据本发 明，用至少一个包含HA或NA基因节段的线性表达构建体转染宿主细胞。优选地，用至少两个线性表达构建体转染宿主细胞，其中一个线性构建体包含HA基因节段，第二个线性构建体包含NA基因节段。根据进一步的实施方案，宿主细胞用编码选自下组的蛋白的线性构建体转化:PB1,PB2, PA, NS, M,和 NP。挑选候选病毒粒子的步骤还可以包含分析候选病毒粒子的氨基酸序列以便确定候选病毒粒子不包含辅助病毒的HA氨基酸序列或NA氨基酸序列，或者分析候选病毒粒子的核酸分子以便确定候选病毒粒子不包含辅助病毒的HA核苷酸序列或NA核苷酸序列。具体地，包含源自辅助病毒的HA蛋白的子代病毒粒子通过将子代病毒粒子用蛋白酶处理而从候选病毒中区分出，所述蛋白酶不裂解源自辅助病毒的HA蛋白，但裂解候选病毒粒子的HA蛋白。与经过修饰的NA蛋白关联的术语“修饰”定义为至少一个氨基酸、优选至少两个氨基酸、优选至少3个氨基酸、更优选至少4个氨基酸，甚至更优选至少5个氨基酸的缺失、取代或引入。优选所述修饰是氨基酸缺失。“线性表达构建 体”根据发明定义为不含任何扩增和/选择序列，包含插入在RNA聚合酶II(PolII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，并且包含插入在poll启动子和poll终止信号之间的基因节段。优选地，所述线性表达构建体不含任何为了质粒在细菌细胞内的扩增而需要的选择或扩增序列。不必含有ori (复制原点)序列或抗生素抗性基因或任何其他选择标记。如果需要，可以利用短的连接序列将线性表达构建体环化。根据发明的特定实施方案，线性表达构建体可以包含除DNA分子以外的分子，t匕如在构建体N和/或C末端的额外的保护序列。例如，这些保护序列可以是如W000/56914中描述的肽核酸序列(PNAs)。这些PNAs是核酸类似物，其中整个脱氧核糖磷酸骨架已被化学上完全不同，但结构同系的含有2-氨乙基甘氨酸单元的聚酰胺(肽)骨架代替。PNA “钳”也被证实可以提高稳定性，这种分子中两个相同的PNA序列通过含有三个8-氨基-3，6- 二氧杂辛酸单元的柔性发夹连接分子连接在一起。当PNA与互补的同型嘌呤或同型嘧啶DNA靶序列混合时，可以形成极其稳定的PNA-DNA-PNA三体复合体(Bentin et al., 1996, Biochemistry, 35, 8863-8869, Egholm et al., 1995, Nucleic AcidsRes., 23, 217-222, Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500, Demidov et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.，1995，92，2637-2641)。它们显示能够抗核酸酶和蛋白酶的消化(Demidovet al.，Biochem.Pharm.，1994，48，1010-1013)。病毒基因节段可以是所述节段的cDNA拷贝或者RT-PCR扩增产物。具体来说，本发明提供了表达和生产RNA病毒的方法，所述方法的步骤包括a)用包含HA基因节段的线性表达构建体和/或包含NA基因节段的线性表达构建体转染宿主细胞，任选地所述线性表达构建体还包含选自PB1、PB2、PA、NS、M、NP的基因节段或至少其一部分，b)用辅助病毒感染所述宿主细胞，所述辅助病毒包含的NA蛋白在N端细胞质结构域内带有至少一个氨基酸修饰，c)培养被感染的宿主细胞以增殖病毒，d)选择至少含有来源于所述线性表达构建体的HA和/或NA蛋白的病毒粒子。
所述选择可以基于非辅助病毒来源的HA或NA蛋白的基因型、表型或者抗原性特征进行。可以使用任何已知能够区分包含不同序列、不同表型特征或者不同抗原性特征的蛋白的选择方法。具体来说，可以使用本发明中描述的选择标准。辅助病毒和非辅助病毒来源的HA和NA蛋白在核苷酸和氨基酸序列上不同，因此可以利用本领域已知的序列比较方法来鉴定包含来源于线性表达构建体的HA或NA序列的病毒。“来源于”表达构建体或病毒的核酸分子是那些包含表达构建体或病毒的核苷酸序列或互补序列的核酸分子，通常是由于细胞培养物或其他用于生产所述分子的培养基中存在表达构建体或病毒而产生的。“来源于”表达构建体或病毒的蛋白是那些由表达构建体或病毒的核苷酸序列或互补序列翻译得到的蛋白，通常是由于细胞培养物或其他用于生产所述蛋白的培养基中存在所述表达构建体或病毒而产生的。除了使用至少一个线性表达构建体，本领域已知的用于进行反向遗传学技术的多种质粒或载体可以用于病毒蛋白和/或病毒基因组的其他节段的表达。这些质粒在例如Hoffmann et al.(Vaccine2002, 20 (25-26)，3165-3170)中有描述。具体来说，这些表达质粒包含编码PB1、PB2、PA、NS、NA、HA、M或NP或其部分的节段。术语“HA蛋 白和NA蛋白”根据本发明定义为HA或NA蛋白各自的完整氨基酸序列或者所述序列的一部分，其中所述部分足以诱发与野生型HA或NA蛋白导致的反应相似或等同的抗所述HA或NA蛋白的免疫反应。优选地，HA或NA蛋白包含完整HA或NA蛋白的至少70%的氨基酸序列，优选至少90%、更优选至少95%，就免疫原性而言的功能等同物可以如Lu et al.(J.Virol.，1999，5903-5911)或者Boyd M.R.and Beeson M.F.(J.Antimicrobial Chemotherapy, 1975, 43-47)中的描述在动物模型中测试。辅助病毒是在给不能自我复制的辅助病毒依赖型病毒载体产生拷贝时使用的病毒。辅助病毒被用于与所述病毒载体一起共感染细胞并提供病毒载体基因组复制所需的酶。术语“辅助病毒”定义为任何这样的病毒，所述病毒包含至少一个与待产生的病毒相同的基因节段，并且能够通过提供产生完整病毒粒子所需的至少一个病毒节段和/或至少一个病毒蛋白来支持病毒的生成。在本发明的方法中，通常是在转染线性表达构建体后给宿主细胞添加辅助病毒，但根据替代的方法，可以在用包含HA和/或NA基因节段的表达构建体转染宿主细胞之前，给宿主细胞添加辅助病毒。根据发明的实施方案，辅助病毒包含带有弹性蛋白酶切割位点的HA蛋白和N端细胞质结构域带有至少一个氨基酸修饰的NA蛋白。更具体地说,所述NA蛋白的N端氨基酸2-6被缺失。根据发明的再一实施方案，辅助病毒包含A/New Caledonia/20/99 (HlNl)来源的HA和NA蛋白，其中HA蛋白包含弹性蛋白酶切割位点，NA蛋白包含按SEQ ID.N0.10编号的N端氨基酸2-6的缺失。野生型NA蛋白的氨基酸是:MNPNQKIITIGSISIAIGIISLMLQIGNIISIWASHSIQTGSQNHTGVCNQRIITYENSTWVNHTYVNINNTNVVAGKDKTSVTLAGNSSLCSISGffAIYTKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPYRALMSCPLGEAPSPYNSKFESVAWSASACHDGMGWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITETIKSffKKRILRTQESECVCVNGSCFTIMTDGPSNGAASYKIFKIEKGKVTKSIELNAPNFHYEECSCYPDTGTVMCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLDYQIGYICSGVF⑶NPRPKDGEGSCNPVTVDGADGVKGFSYKYGNGVWIGRTKSNRLRKGFEMIWDPNGWTDTDSDFSVKQDVVAITDffSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFffVELVRGLPRENTTIffTSGSSISFCGVNSDTANWSWPDGAELPFTIDK(SEQ ID N0.10)能通过所述方法表达的RNA病毒可以是任何包含HA和/或NA基因节段或与这些结构功能等同的结构的RNA病毒。术语“功能等同的结构”意味着具有受体结合和融合活性的病毒蛋白。RNA病毒可以选自流感病毒(具体来说甲型、乙型或丙型流感病毒)、冠状病毒、呼吸道合胞病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)。可以用在发明所述方法中培养病毒的细胞可以是能够被培养并且被包膜病毒(特别是被流感病毒)感染的任何所需类型的细胞。具体来说，所述细胞可以是BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、小鼠细胞、人细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、CEK (鸡胚肾细胞)、CEF (鸡胚成纤维细胞)、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、W1-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NSO、PerC6 (人视网膜细胞)。根据发明的方法，可通过任何已知方法(例如电穿孔)来感染宿主细胞。可以在本领域已知的标准条件下培养宿主细胞培养物以复制病毒，尤其是直至可以检测到最大的致细胞病变效应或最大量的病毒抗原。替代地，可以在培养过程中的任何时间点进行回收。宿主细胞培养的pH可以在例如6.5和7.5之间。培养的pH值取决于用于培养的宿主细胞的pH稳定性。这可以通过测试不同pH条件下的宿主细胞“活力”来确定。本领域已知用于制备每年抗地区性流感的疫苗毒株的野生型病毒是每年由世界卫生组织(WHO)推荐的。然后这些毒株可以用于生产重配疫苗株，其总体上混合了野生型病毒的NA和/或HA基因和来源于具有某些所需特性的供体病毒(经常被称为主供体流感病毒或MDV)的其余基因节段。例如，MDV株可以是冷适应型、和/或温度敏感型、和/或减毒型、和/或高生长速率型。根据本发明，病毒粒子优选包含病毒株的HA和/或NA蛋白，其中所述病毒株是为季节性免疫接种而推荐的病毒株或者是被证实特别在大流行病毒的情况中具有高度免疫原性的病毒株。挑选包含所述表面蛋白的病毒可以基于那些能够将所述蛋白与辅助病毒来源的HA和NA蛋白区分开的表型、基因型或抗原性特性。辅助病毒来源的HA和NA蛋白的能够将所述蛋白与非辅助病毒(如选中的病毒)来源的HA和NA蛋白区分开的表型特性包括，例如活化HA的切割位点的不同或者对低pH的稳定性的差别。辅助病毒HA可以含有依赖于蛋白酶的水解活化的切割位点，这里所述的蛋白酶与活化疫苗病毒HA的蛋白酶不同。辅助病毒还可以显示比疫苗病毒对低pH条件更不稳定。挑选含有 疫苗病毒的HA和NA的病毒还可以基于抗原性特性。通过使用与疫苗病毒(例如H1N1)不同亚型的辅助病毒(例如H3N2)，可以用对辅助病毒亚型(例如H3N2)特异的抗血清来抑制辅助病毒的生长。可以被利用来进行选择的基因型特征包括辅助病毒来源的HA和/或NA节段与非辅助病毒来源的HA和NA蛋白之间的核酸或氨基酸序列差别。序列分析的方法是本领域已知的。根据核苷酸序列差异，例如可以给辅助病毒的HA和/或NA特别设计siRNAs或反义寡核苷酸。通过转染这些siRNAs或反义寡核苷酸，可以抑制辅助病毒的生长。根据发明的实施方案，辅助病毒包含在N端细胞质结构域内有至少一个氨基酸修饰的NA蛋白。具体来说，辅助病毒NA蛋白包含N端氨基酸1-6中的至少一个、优选至少两个、更优选至少4个、更优选至少5个的缺失。具体来说，位于N端氨基酸位点I的甲硫氨酸未被修饰。更具体地说，辅助病毒NA蛋白包含N端氨基酸2-6 (即氨基酸NPNQK)的缺失。Mitnaul L.et al.(J.Virology, 1996，873-879)描述了甲型流感病毒在NA胞内细胞质尾巴区域内5个N端氨基酸的这种缺失。起始的甲硫氨酸被保留。
根据发明的其他实施方案，辅助病毒可以包含与野生型病毒的NA蛋白相比活性下降的NA蛋白。辅助病毒在该实施方案中可以缺少功能性NA蛋白(即，使病毒能从宿主细胞释放的NA蛋白)或者完全缺乏NA蛋白。本申请中令人惊讶地显示，虽然包含所述修饰过的NA蛋白的病毒只有略微下降的生长速率，但仍可以从包含未修饰的NA蛋白的病毒粒子中容易地除去包含所述修饰的病毒粒子。这对除去辅助病毒来源的NA蛋白非常有利，因为使用抗体进行去除需要生成NA中和抗体。由于生长速率降低、以及病毒粒子优先整合有未修饰之细胞质结构域的NA蛋白这一事实，甚至可以通过简单的稀释法来除去含有经过修饰的NA蛋白的病毒粒子。根据其他实施方案，用不能切割辅助病毒来源的HA蛋白但能切割从而活化重配病毒的HA蛋白的蛋白酶处理，可以将包含辅助病毒来源的HA蛋白的病毒粒子与候选病毒粒子分开。例如，所述蛋白酶可以选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶或嗜热菌蛋白酶。例如，可以修饰辅助病毒的HA蛋白，使之能被并非胰蛋白酶的蛋白酶活化(例如切割)，而最终疫苗病毒的HA蛋白被胰蛋白酶切割。这样即提供了简单可用的选择系统。这可以通过修饰切割位点来进行。可以作为辅助病毒的病毒株的HA节段可以通过诱变(比如PCR诱变)改造，从而含有能被弹性蛋白酶而不是胰蛋白酶水解活化的切割位点。例如，围绕切割位点的氨基酸序列可以是PSIQPI/GLFGA (切割位点以/指示)。为了尽量减少不希望的回复事件，密码子的选择使得优选需要每个密码子有至少两个核苷酸改变才能导致回复为原来的氨基酸。替代地，通过提供低pH条件，可以将包含辅助病毒HA和NA蛋白的病毒粒子与包含由线性构建体表达的NA或HA蛋白的候选病毒粒子分开。在细胞培养物(具体来说在Vero细胞培养物)中进行数次传代的病毒粒子，由于与来自包含野生型HA和/或NA蛋白的临床分离物的毒株相比有HA蛋白内的修饰，显示出对低pH的稳定性降低。因此，对辅助病毒在低PH(即在pH5.2-6，2)条件下进行处理导致辅助病毒的繁殖速率下降，因此选出包含未经修饰的HA和/或NA蛋白的候选病毒粒子。作为发明的再一个替代实施方案，通过用抗血清处理，可以将包含辅助病毒来源的HA和/或NA蛋白的病毒粒子与候选病毒粒子分开，所述抗血清含有能够中和或结合所述辅助病毒来源的HA和/或NA蛋白的抗体。根据发明，还可以将不同方法组合使用来除去不需要的HA和NA蛋白。根据再一个替代实施方案，辅助病毒包含丙型流感病毒的HEF蛋白。丙型流感病毒只有一个功能上与HA蛋白等同的主要表面糖蛋白HEF (血凝素酯酶融合蛋白)。如Gaoet al.(J.Virol.,2008，6419-6426)(通过引用并入本文)中的描述，可以例如用胰蛋白酶或TPCK胰蛋白酶来活化HEF蛋白。替代地，本发明具体要求保护包含可以通过引入外来蛋白酶切割位点(例如弹性蛋白酶切割位点)进行修饰的病毒糖蛋白ffiF的改良流感病毒。作为发明的再一个替代实施方案，通过用能够中和或结合辅助病毒来源的HEF蛋白的抗体处理，可以除去包含所述HEF蛋白的病毒粒子。作为再一个替代，辅助病毒可以包含冠状病毒的HA蛋白。对于生产甲型流感病毒的情况，替代地可以使用来自乙型流感病毒来源的HA和/或NA蛋白。用于疫苗生产的病毒和辅助病毒具体可以是流感病毒来源的，更具体地可以是减毒的流感病毒。根据一个具体实施方案，流感病毒是减毒的流感病毒。具体来说，所述流感病毒在能抑制宿主细胞先天性免疫反应的致病因子内包含缺失或修饰。减毒可以例如是来源于冷适应病毒株，或者归因于W099/64571和W099/64068 (均通过引用全部并入本文)所述的NSl基因内的缺失或修饰(A NSl病毒)。“修饰”是指与野生型NSl序列相比，一或多个核酸的取代或缺失。发生在NS基因内的修饰可以产生在干扰素感受态细胞内有生长缺陷的病毒粒子。生长缺陷意味着这些病毒在动物的呼吸道内进行顿挫复制(abortivereplication)时，有复制缺陷。替代地，所述病毒可以包含PB1-F2基因的缺失或修饰。本发明的方法可以具体用来产生包含功能性NSl蛋白的缺失的流感病毒。根据发明，辅助病毒可以含有与待产生的病毒相同的至少4个，优选至少5个，优选6个节段。具体来说，这些节段是PB1、PB2、PA、NP、M、NS。辅助病毒可以通过已知的反向遗传学技术或者替代技术比如病毒重配来生产。提到病毒时的术语“重配子(reassortant) ”表明该病毒包含来源于一个以上亲代病毒株或病毒来源的遗传成分和/或多肽成分。例如，7:1重配子包含来源于第一个亲代病毒的7个病毒基因组节段(或基因节段)，和来自第二个亲代病毒的单个互补病毒基因组节段(例如编码血凝素或神经氨酸酶的节段)。6:2重配子包含来自第一个亲代病毒的6个基因组节段(最常见是6个内部基因)，和来自另一亲代病毒的两个互补节段，例如血凝素和神经氨酸酶。重配可以通过经典的重配或者通过反向遗传学方法来进行。例如Egorov 等(1998丄 Virol.1998Aug; 72 (8): 6437-41; Egorov et al., Vopr.Virusol., 39:201-205)描述过制备包含NSl缺失的辅助病毒的方法。通过该方法，用Hl甲型流感病毒作为包含NS基因内的温度敏感突变的基础病毒，然后经过进一步修饰造成完全缺失NS基因，只能在干扰素缺陷型细胞内生长。本发明还涵盖了包含PSIQPIGLFGA(SEQ ID.N0.7)序列的HA多肽。本发明还涵盖了包含以下 序列或其一部分的HA核苷酸序列:AGCAAAAGCAGGGGAAAATAAAAACAACCAAAATGAAAGCAAAACTACTGGTCCTGTTATGTACATTTACAGCTACATATGCAGACACAATATGTATAGGCTACCATGCCAACAACTCAACCGACACTGTTGACACAGTACTTGAG
AAGAATGTGACAGTGACACACTCTGTCAACCTACTTGAGGACAGTCACAATGGAAAACTATGTCTACTAAAAGGAAT
AGCCCCACTACAATTGGGTAATTGCAGCGTTGCCGGATGGATCTTAGGAAACCCAGAATGCGAATTACTGATTTCCA
AGGAATCATGGTCCTACATTGTAGAAACACCAAATCCTGAGAATGGAACATGTTACCCAGGGTATTTCGCCGACTAT
GAGGAACTGAGGGAGCAATTGAGTTCAGTATCTTCATTTGAGAGATTCGAAATATTCCCCAAAGAAAGCTCATGGCC
CAACCACACCGTAACCGGAGTATCAGCATCATGCTCCCATAATGGGAAAAGCAGTTTTTACAGAAATTTGCTATGGC
TGACGGGGAAGAATGGTTTGTACCCAAACCTGAGCAAGTCCTATGTAAACAACAAAGAGAAAGAAGTCCTTGTACTA
TGGGGTGTTCATCACCCGCCTAACATAGGGAACCAAAGGGCCCTCTATCATACAGAAAATGCTTATGTCTCTGTAGT
GTCTTCACATTATAGCAGAAGATTCACCCCAGAAATAGCCAAAAGACCCAAAGTAAGAGATCAGGAAGGAAGAATCA
ACTACTACTGGACTCTGCTGGAACCTGGGGATACAATAATATTTGAGGCAAATGGAAATCTAATAGCGCCATGGTAT
GCTTTTGCACTGAGTAGAGGCTTTGGATCAGGAATCATCACCTCAAATGCACCAATGGATGAATGTGATGCGAAGTG
TCAAACACCTCAGGGAGCTATAAACAGCAGTCTTCCTTTCCAGAATGTACACCCAGTCACAATAGGAGAGTGTCCAA
AGTATGTCAGGAGTGCAAAATTAAGGATGGTTACAGGACTAAGGAACATCCCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTT
GGAGCCATTGCCGGTTTCATTGAAGGGGGGTGGACTGGAATGGTAGATGGGTGGTATGGTTATCATCATCAGAATGA
GCAAGGATCTGGCTATGCTGCAGATCAAAAAAGTACACAAAATGCCATTAACGGGATTACAAACAAGGTGAATTCTG
TAATTGAGAAAATGAACACTCAATTCACAGCTGTGGGCAAAGAATTCAACAAATTGGAAAGAAGGATGGAAAACTTA
AATAAAAAAGTTGATGATGGGTTTCTAGACATTTGGACATATAATGCAGAATTGTTGGTTCTACTGGAAAATGAAAG
GACTTTGGATTTCCATGACTTCAATGTGAAGAATCTGTATGAGAAAGTAAAAAGCCAATTAAAGAATAATGCCAAAG
AAATAGGAAACGGGTGTTTTGAATTCTATCACAAGTGTAACAATGAATGCATGGAGAGTGTGAAAAATGGAACTTAT
GACTATCCAAAATATTCCGAAGAATCAAAGTTAAACAGGGAGAAAATTGATGGAGTGAAATTGGAATCAATGGGAGT
CTATCAGATTCTGGCGATCTACTCAACTGTCGCCAGTTCCCTGGTTCTTTTGGTCTCCCTGGGGGCAATCAGCTTCT
GGATGTGTTCCAATGGGTCTTTGCAGTGTAGAATATGCATCTGAGACCAGAATTTCAGAAATATAAGAAAAAACACC
CTTGTTTCTACT (SEQ ID N0.8)特别是，本发明包括了含有以下序列的HA核苷酸:5’-CCATCCATTCAACCCATTGGTTTGTTTGGAGCC-3’ (SEQ ID.9).实施例:实施例1:线性H3N2HA表达构建体的生成来源于Vero细胞培养物的甲型流感H3N2病毒的HA节段利用寡核苷酸Pl和P2经PCR扩增(图1a中的Fl)。之后，借助重叠PCR，将来源于pHW2000(Hoffmann etal.2000, Proc Natl Acad Sci U S A.97:6108-13)的两个 DNA 片段(图1 中的 F2 和 F3)与HA PCR产物融合(参见图1b)。第一个DNA片段(F2)包含CMV启动子和Poll终止子，第二个(F3)包含人Poll启动子和BGH polyA信号。为了促进重叠PCR产物的产生，将用于HA扩增的寡核苷酸在它们的5’端延伸，使得Pl含有与Poll终止子互补的序列而P2含有与Poll启动子互补的序列(参见图la)。类似地，将用于产生片段Fl和F2的引物P3和P5在它们的5’端延伸，使得它们含有与HA的5’和3’端互补的序列(参见图1a)。片段F2和F3含有来源于pHW2000骨架中描述的序列的保护序列。这些序列不直接参与mRNA和vRNA的转录，但能减少核酸外切酶对双向表达盒的降解。
病毒RNA使用Qiagen ViralAmp试剂盒从来源于Vero细胞培养物的甲型流感H3N2病毒中提取，并用Unil2寡核苷酸按照以前的描述(Hoffmann et al.2001, ArchVirol.146:2275-89)进行逆转录。HA节段用表I中显示的寡核苷酸，利用Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合液进行扩增:表1:
权利要求
1.制备负链节段性RNA病毒的方法，所述方法包括步骤 a)提供不含任何扩增和/或选择序列的线性表达构建体，该构建体包含均插入在RNA聚合酶II(PolII)启动子和聚腺苷酸化信号之间的RNA聚合酶I (poll)启动子和poll终止信号，该构建体还包含插入在poll启动子和poll终止信号之间的HA和/或NA基因节段， b)用所述线性表达构建体转染宿主细胞， c)用含有辅助病毒HA和/或NA蛋白的辅助病毒感染所述宿主细胞，其中所述NA蛋白包含位于N端细胞质结构域的至少一个氨基酸修饰， d)培养所述宿主细胞来增殖病毒粒子， e)选择病毒粒子，所述病毒粒子含有 (i)来源于线性表达构建体的HA和/或NA蛋白，但是不含有 (ii)辅助病毒HA和NA蛋白，或其节段， 其中所述选择基于HA和/或NA蛋白的表型、基因型或抗原性特征，并且任选地 f)其中通过分析核酸或氨基酸序列确定不含辅助病毒HA和NA蛋白。
2.如权利要求I所述的方法，其中转染宿主细胞的线性构建体编码选自PB1、PB2、PA、NS、M和NP的蛋白。
3.如权利要求I或2中任一项所述的方法，其中通过用蛋白酶处理子代病毒粒子将包含来源于辅助病毒的HA蛋白的子代病毒粒子与候选病毒粒子分开，其中所述蛋白酶不会切割来源于辅助病毒的HA蛋白但是切割候选病毒粒子的HA蛋白。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中蛋白酶选自胰蛋白酶、弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶。
5.如权利要求I或2所述的方法，其中辅助病毒的HA蛋白经过修饰能被并非胰蛋白酶的蛋白酶切割。
6.如权利要求I或3所述的方法，其中通过提供低pH条件将包含辅助病毒来源的HA和NA蛋白的子代病毒粒子与候选病毒粒子分开。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中通过用结合辅助病毒来源的HA和/或NA蛋白的抗体与子代病毒接触,将包含所述HA和/或NA蛋白的子代病毒粒子与候选病毒粒子分开。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中辅助病毒NA蛋白与按照SEQID No. 10编号的序列相比，包含N端氨基酸1-6中至少一个的缺失。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中辅助病毒NA蛋白与按照SEQID No. 10编号的序列相比，包含N端氨基酸2-6的缺失。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中辅助病毒包含活性下降的NA蛋白或者缺少功能性NA蛋白。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中辅助病毒包含丙型流感病毒的HEF蛋白。
12.如权利要求10所述的方法，其中辅助病毒的HEF蛋白经过修饰能被并非胰蛋白酶的蛋白酶切割。
13.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中辅助病毒包含冠状病毒的HA蛋白。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述病毒粒子是流感病毒粒子。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述病毒粒子是减毒的流感病毒粒子。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述病毒包含位于NSl基因内的缺失或修饰。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中辅助病毒包含修饰或缺失的NS基因，且在干扰素感受态细胞内有生长缺陷。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中辅助病毒含有至少4个、优选至少5个、优选6个节段与待生产的病毒相同。
19.辅助病毒，所述病毒包含带有弹性蛋白酶切割位点的HA蛋白和N端细胞质结构域内有至少一个氨基酸修饰的NA蛋白。
20.如权利要求19所述的辅助病毒，其中所述NA蛋白的N端氨基酸2-6被缺失。
21.辅助病毒，其中HA和NA蛋白来源于A/NewCaledonia/20/99，HA蛋白包含弹性蛋白酶切割位点，并且NA蛋白包含末端氨基酸2-6的缺失。
全文摘要
本发明提供了在有辅助病毒的情况下，利用线性表达构建体产生负链节段性RNA病毒的方法，所述辅助病毒包含位于NA蛋白N端细胞质区域内的至少一个氨基酸修饰。
文档编号C12N15/09GK103237890SQ201180041228
公开日2013年8月7日 申请日期2011年6月6日 优先权日2010年6月2日
发明者T.马斯特, A.埃戈罗夫, M.沃谢克 申请人:巴克斯特保健股份有限公司