专利名称：一种异源蓝舌病毒双链rna内源性干扰素诱导剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法，该诱导剂可直接用于人体，诱导人体产生各种内源性干扰素(ENIs)， 赋予人体抗病毒、抗肿瘤以及广泛的防病、治病和增强体质的功能。
背景技术：
由于具有广泛的疾病防治功能的干扰素(Interferon，IFN)(董长垣主编，《现代分子病毒学》，武汉大学出版社，1996年10月)是人类至今所发现的最好的一类细胞因子； 也由于内源性干扰素(Endodnterferon，ENI)较外源性干扰素(Exo-Interferon，EXI)有无可比拟的优点，以及人类至今尚未获得理想的内源性干扰素诱导剂(Endo-hterferon Inducer, EnII)等原因，人类一直在追求安全而有效的医用ΕηΙΙ。一、干扰素及其分类IFNs是由干扰素诱导剂诱导多种细胞产生的一组多功能的可溶性糖蛋白，通过与细胞受体结合，至少可转录活化300多种IFN刺激基因(IFN-stimulated genes, ISGs), 发挥多种生物学活性。IFN不仅具有抗肿瘤和抗病毒作用，而且具有增强体质的调理作用；既能治疗疾病，又能预防疾病；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如 SARS-CoV、禽流感病毒)。国际IFN命名委员会规定，先根据IFN的动物来源进行初分类；再根据IFN的抗原特性和分子结构的差异分成不同的型；在特定的型内，按氨基酸序列或组成差异又可分为若干亚型。于是，根据氨基酸序列和受体的不同，IFN被分为I、II和III三种类型(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4-6) I型IFN包括a、3、r和ω亚型，主要参与抗病毒、抗肿瘤；II型IFN只有IFN-γ，主要参与诱导MHC类抗原的表达和免疫调节效应，其抗病毒作用比 I 型 IFN 弱；III 型 IFN 又称为 IFN-λ，包括 IFN-λ 1、IFN-λ 2 禾口 IFN-λ 3，或 IL-29、 IL-28a和IL-28b等，在抗病毒、抗增殖及体外抗肿瘤等方面发挥近似于而又不同于I型干扰素的作用。IFN-α、IFN-β、IFN-γ均有抗病毒作用。但是，IFN-γ抗病毒活性远较I 型IFN低；IFN-α和IFN-β能相互加强抗病毒作用。IFN抗病毒具有广谱性，但它对细胞的抗病毒作用是间接的，而且是非特异性(Richard Ε. Randall, Stephen G. Interferons and viruses :an interplay between induction,signalling,antiviral responses and virus countermeasures. J of General Virology, 2008,89 :4_6)。根据来源，IFNs可分为内源性干扰素(Endo-Interferon，ENI)和外源性干扰素 (EXI)。EXI就是在体外应用外源性干扰素诱导剂(Exo-Interferon Inducer, ExII)刺激离体培养细胞所生产的或基因工程合成的，而后用于机体的IFNs ；ENI则是用内源性干扰素诱导剂(EnII)于体内，直接诱导机体产生的IFNs。
近年来，有关诱导IFN产生机理的研究，IFN抗病毒、抗肿瘤和调理机体功能的药理和生理作用的研究取得了令人满意的结果，显示了其符合机体自然防御功能的特性，理所当然地为抗病毒和抗肿瘤治疗开辟了新途径。二、干扰素的产生与干扰素诱导剂细胞基因组密码着IFN基因。由于IFN基因抑制物(IFN suppressor)与IFN基因结合，所以，在一般情况下，IFN基因处于抑制状态。能诱导IFN产生的物质统称为干扰素诱导剂(Interferon inducer)。当干扰素诱导剂作用于细胞膜，便会解脱IFN基因抑制物与IFN基因的结合，IFN操纵子开始转录，合成mRNA，mRNA迅速转移至胞浆，在核糖体上转译出IFN前体，切除信号肽后，成熟的IFN分泌到细胞外。研究表明，病毒感染细胞后，经相同机制可同时诱生III型和I型干扰素，但两者表达量不同(Osterlund P, Veckman V, Siren J, et al. Gene expression and antiviral activity of alpha/bela intederons and interleukin-29 in virus-infected human myeloid dendritic cells. J Virol,2005,79 [15] :9608-9617, Contoli M, Message SD, Laza-Stanca V, et al. Role of deficient typeIII interferon-lambda production in asthma exacerbations. Nat Med,2006,12[9] :1023-1026, Khaitov MR, Laza-Stanca V, Edwards MR, et al. Respiratory virus induction of alpha-, beta一and lambda一interferons in bronchial epithelial cells and peripheral blood mononuclear cells. Allergy, 2009,64[3] :375-386)，表达的组织也不同，例如，IFN-λ 应答主要产生于上皮细胞，尤其是在肺、皮肤和肠道，而几乎所有类型的细胞均能产生I型干扰素(Sommereyns C, Paul S, Staeheli P, et al. IFN-Iambda(IFN-Iambda) is expressed in a tissue-dependent fashion and primarily acts on epithelial cells in vivo. PLoS Pathog，2008，4[3] :el000017)。在某些条件下，IFN-λ和I型干扰素并不同时表达(Doyle SE, Schreckhise H, Khuu-Duong K, et al. Interleukin-29 uses a type I interferon-like program to promote antiviral responses in human hepatocytes. Hepatology,2006,44[4] :896-906)。几乎所有的脊椎动物(包括人)细胞都可产生IFN， 但无论在体内还是体外，必须由IFN诱导剂诱导产生。按照干扰素诱导剂的本质，可将其分为病毒IFN诱导剂、双链RNA IFN诱导剂、 代谢物IFN诱导剂和一些病原菌IFN诱导剂等。RNA病毒具有良好的IFN诱导作用，如新城疫病毒(NDV)、猪冠状病毒(TGEV)、猪水泡病病毒(SVDV)、猪口蹄疫病毒(FMDV)、鸡传染性气管炎病毒(BV)等。一些DNA病毒也有诱导IFN产生的能力，例如鸡马立克氏疱疹病毒 (MDHV)，但其诱导IFN产生的能力较RNA病毒低。除病毒外，衣原体、立克次体、细胞内毒素、 真菌提取物等也能诱导IFN产生。尽管如此，病原体是不能用作干扰素诱导剂的。目前主要是灭活的新城疫病毒(NDV)用作外源性干扰素诱导剂(EXI)。三、内源性干扰素的优点和内源性干扰素诱导剂EXI存在诸多缺点，如所用INF的种类单一，所以，相对于ENI，其药物和生理功能较差；INF属蛋白质多肽类，所以，EXI用于人体为异源抗原蛋白，发挥具有免疫原性，会引起机体异源反应和依赖性，同样具有较大的毒副作用；而且其制备复杂、价格昂贵，保存和运输麻烦，所以，限制了 EXI的大量生产和普及应用。ENI则是用内源性干扰素诱导剂(EnII)于体内，直接诱导机体产生的IFNs。在这种情况下，机体变成了生产干扰素的复合工厂，以生产各型干扰素，发挥抗肿瘤、抗感染和调理作用。ENI是由机体自身产生的天然的复合型干扰素，即白细胞干扰素、纤维母细胞型干扰素和免疫型干扰素等，由多种不同类型的细胞诱导生成(Sang-Myeong L，Susan KS, Steven B. Kleiboeker Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes Veterinary Veterinary. Immunology and Immunopathology，2004，102，217-231)。所以，用 EnII 在人体内直接诱导产生的·Ι能克服EXI的诸多不足，如诱生的IFN种类齐全、体内浓度高、没有异源蛋白质的免疫原性(即过敏反应和排斥反应)、没有依赖性、无需提纯、造价低廉、……等。也由于 IFNs具有相对种属特异性，所以，内源性干扰素的抗病毒、抗肿瘤以及调理功能活性最强。 同时，EOT既可作为治疗用药，也可以作为预防用药。可见，具有广泛的疾病防治功能的IFNs是人类至今所发现的最好的一类细胞因子；内源性干扰素(ENI)较外源性干扰素(EXI)有无可比拟的优点。然而，欲想得到ENI， 关键是要获得能安全应用于人体的、能有效诱导人体产生ENI的、造价低廉的、便于工业化生产的、不污染环境的、资源丰富的内源性干扰素诱导剂(EnII)。目前用于人体的商业化EnII主要是多聚肌苷酸(Polyinosinic Polycytidylic Acid，Poly [I: C]，PIC)，为人工合成的小分子双链 RNA (Chadha KC, Dembinski WE, Dunn CB, et al. Effect of increasing thiolation of the polycytidylic acid strand of poly I :poly C on the alpha, beta and gamma interferon-inducing properties,antiviral and antipmliferative activities. Antiviral Res,2004，64[3] :171-7),国内于 1983 年广泛用于临床，作为广谱抗病毒药物使用。Poly[I:C]的药理是通过刺激在体细胞产生内源性IFNs(ENI)来发挥其临床效应，它能增强巨噬细胞的吞噬功能、杀伤病毒感染的细胞、阻止病毒蛋白的合成、抑制病毒在宿主细胞内的复制繁殖、抑制病毒从细胞内释放、阻止病毒进入细胞、防止病毒扩散、保护正常细胞不受病毒侵犯、增强未感染细胞的抗病毒能
力......等；同时，它具有免疫调节功能，刺激和促进细胞活性从而增强清除病毒感染细
胞的能力，临床已用于肿瘤和白血病的治疗，病毒性肝炎、痘类病毒性感染等的治疗。然而，近年发现Poly[I:C]在人体和其他灵长类体内易被血清核酸酶破坏、诱生 IFN产生的效能低。更有文献报道Poly[I:C]会引起自身免疫性疾病，会导致机体发热、造血机能下降、促红细胞生成素减少、白细胞减少、肝脾细胞破坏、血压及凝血功能失常、转氨酶升高、肾功能损伤等一系列毒副作用，从而大大限制了 Poly[I:C]的市场和临床应用(聂实践、胡冬琴，错位双链核糖核酸的热原反应，中国生物工程，2003，23[2] :97-98)。所以，寻找和开发新的第二代医用EnII是全世界生物医学家们角逐的领域，人类一直在追求安全而有效的医用EnII。四、BTV NdsRNA具备发展成理想的医用EnII的潜能人类已认识到“病毒具有诱导IFN的作用”、“人工合成的dsRNA具有诱导IFN的作用”，那么，在理论上讲，来自dsRNA病毒基因组的dsRNA分子应该具有发展成EnII的潜能。动物蓝舌病毒(Bluetongue Virus,BTV)(董长垣主编，《现代分子病毒学》，武汉大学出版社，1996 年 10 月，Hu J，Dong CY，Jos印h L，Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta 0ncologica，2008，47 :124-134)是家畜绵羊的一种dsRNA病毒，与人类及其他动物等存在种族屏障。数百年的观察已经结论BTV宿主范围非常狭窄，对同科的牛不致病，对山羊兄弟也很少轻微致疾病；系异源动物病毒，不引起人类任何疾病；含分段dsRNA，带依赖 RNA的RNA聚合酶，故提取和纯化的dsRNAs没有感染性；为dsRNA病毒，没有肿瘤源性；系天然病毒，其核酸是天然核酸，毫无影响生态平衡的后顾之忧；BTV本身就是最好的天然干扰素诱导剂。BTV基因组为双链RNA分子，耐RNA酶(RNAase)；便于离体增殖和纯化制备， 有利于产业化。这些特点赋予了它极其显著的医用和生物工程价值。人类早已结论，BTV不引起人类任何疾病；近年又有力地证明了 “dsRNA分子的安全性”。过去的近十年，申请人和国际同行又已反复证明了 dsRNA病毒科成员，如人呼肠孤病毒(Reovirus，RV)、BTV 既具有靶向抗人癌作用(Hu J，Dong CY, Joseph L，Chen J, Chen DE, Liang K, Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica，2008，47 :124-134 ；陈杰、胡俊、董长垣、梁科、戴莹、高婧，蓝舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549细胞死亡机理的研究， 中华肿瘤学杂志，2007，四[7] :505-509，阳海燕、董长垣、刘军、李小成、邓庚粮、毕国明，五株蓝舌病毒对宫颈癌HeLa细胞作用特性的比较研究，中华微生物学和免疫学杂志，2010， 30 [7] :621-625，杜贤进、周峰、董长垣、郭应禄、张杰，蓝舌病毒HbC3对人肾癌细胞的感染杀伤作用，中华实验外科杂志，2010，27 [4] =504-506)，又对人体十分安全，并有显著诱导实验动物产生IFN的作用。最近，我们亦证实了 BTV对人正常细胞如人胚肺细胞、人气管平滑肌细胞等无感染性；用实验动物小鼠(非敏感动物)作半数致死量测定尚未寻找到LD5tl，显示了 BTV dsRNA对实验小鼠的安全性。须知，人对BTV也是非敏感性的。近年，申请人又在离体培养的人源细胞(正常/肿瘤细胞)上比较研究了 BTV、BTV 裸露的dsRNA分子(NdsRNA)和商业化的Poly [I C]的安全性和诱导IFN的能力，结果表明 ① BTV 对人源正常细胞安全(Hu J，Dong CY, Joseph L，Chen J, Chen DE, Liang K，Zhang WY. In vitro Selective cytotoxic effect of human cancer cells by Bluetongue virus-10. Acta Oncologica, 2008，47 :124-134，陈杰、胡俊、董长垣、梁科、戴莹、高婧，蓝舌病毒湖北株致人肝癌H印-3B和人肺腺癌A549细胞死亡机理的研究，中华肿瘤学杂志， 2007, 29 [7] :505-509，阳海燕、董长垣、刘军、李小成、邓庚粮、毕国明，五株蓝舌病毒对宫颈癌HeLa细胞作用特性的比较研究，中华微生物学和免疫学杂志，2010，30 [7] =621-625, 杜贤进、周峰、董长垣、郭应禄、张杰，蓝舌病毒HbC3对人肾癌细胞的感染杀伤作用，中华实验外科杂志，2010,27 ] =504-506)；②BTVNdsRNA对离体培养的人正常细胞安全；③BTV NdsRNA能有效地诱导离体培养的人源细胞(包括正常细胞和肿瘤细胞)产生IFN-β ；
④BTVNdsRNA体外诱导IFN-β的产量显著高于目前临床上应用的Poly [I C] (P <0.01)；
⑤BTVNdsRNA能通过诱导产生IFN而杀死离体培养的人癌细胞等等(戴莹、陈冬峨、高婧、胡俊、董长垣，异源蓝舌病毒dsRNA与Poly[I:C]诱导人源体细胞产生IFN-β的比较研究，中华微生物学和免疫学杂志，2008二8[3] :218-221，王海琪、董长垣、陈东娥、陈晓、 郭淑芳、刘文培，BTV及其dsRNA分子诱导IFN产生和细胞凋亡，中国病毒学，2005，20 [3] 268-271)。近来，申请人进而又在实验动物体内比较研究了 BTV裸露的dsRNA分子(BTV NdsRNA)和商业化的Poly[I:C]的安全性和诱导IFN的能力。结果显示了 ①BTV NdsRNA 对实验动物的安全性；②BTV NdsRNA能有效地诱导实验动物产生内源性干扰素(ENIs)，如IFN-a、IFN- β、IFN- γ等；③BTV NdsRNA诱导实验动物产生ENI- β的水平高于 ENI-α ；④BTV NdsRNA诱导实验动物产生ENI-β的水平具有一定的量效关系；⑤同剂量的BTV NdsRNA诱导实验动物产生ENI-β的能力显著高于Poly [I :C] (P < 0. 01)；⑥BTV NdsRNA在实验动物体内诱导IFN-a、IFN-i3产生的速度快，在完成动物接种后约池即达高峰;……。最近，我们建立起了流感病毒Hmi感染小鼠模型和疾病模型，并借助该动物模型，以动物模型组为空白对照、以病毒感染动物模型组为条件对照、以目前最好的商业化干扰素诱导剂Poly[I:C]为阳性药物对照，系统地开展了 BTVNdsRNA体内预防流感病毒感染的作用研究、BTV NdsRNA体内治疗流感肺炎的作用研究；并进一步验证了 BTV NdsRNA对疾病动物的安全性、诱导疾病动物产生EOT的有效性、以及体内诱导内源性干扰素EOT的种类，从而进一步确认了 BTV NdsRNA分子的医用内源性干扰素诱导剂EnII的极大潜能。研究结果显示(I)BTVNdsRNA处理的小鼠，无明显不良反应出现，再一次提示了 BTVNdsRNA在机体内的安全性。(2)real time RT-PCR试验结果显示BTV NdsRNA处理对于流感病毒Hmi感染小鼠，不管是预防还是治疗，均能有效抑制鼠肺内的流感病毒的复制，且效果均优于 Poly[I:C]。(3)在有限观察时间内(仅7天)，HE染色病理切片显示BTV NdsRNA能有效预防流感病毒Hmi感染，高度显著地减轻小鼠肺炎；并且，BTV NdsRNA预防流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果显著地优于Poly [I C]。(4)在有限观察时间内(仅7天)，HE染色病理切片显示=BTVNdsRNA能高度有效地治疗流感病毒Hmi感染导致的小鼠肺炎；并且，其治疗流感病毒Hmi感染小鼠肺炎效果显著地优于Poly[I:C]，流感病毒感染小鼠肺组织病变改善更为明显。根据趋势，随着观察的时间延长，BTV NdsRNA治疗组动物肺组织病变会恢复得更好。(5) ELISA检测结果显示BTV NdsRNA和Poly [I C]都能有效诱导Hmi感染小鼠血清IFN-α、IFN-β、IFN-γ产生，并且，BTV NdsRNA诱导内源性干扰素产生的能力显著地优于 Poly [I: C]。我们的以上研究明显地提示申请人BTV NdsRNA具备发展成理想的医用内源性干扰素诱导剂(ENI Inducer, EnII)的潜能，具有显著的发展成新型抗病毒药物的潜能。申请人:研究BTV NdsRNA ΕηΙΙ，无论体内还是体外，均以Poly [I C]为对照。无论在理论上，还是在体内、体外研究结果上，BTV NdsRNA EnII均优于Poly [I: C]。申请人考虑， 其原因可能是(A)Poly[I:C]为人工合成的dsRNA，而BTV NdsRNA则是天然的dsRNA ； (B) Poly [I C]为较小分子dsRNA，而BTVNdsRNA则是大分子dsRNA。五、dsRNA分子诱导细胞产生IFNs的细胞分子机理已很成熟Poly [I C]、霉菌和细菌的dsRNA、核酸类，以及我们的BTVNdsRNA等都是dsRNA分子，均能诱导IFN产生。近年已证实，TLR3 (Toll like receptor 3)和RIG-I/MDA5细胞信号转导通路是识别dsRNA、诱导I型IFN表达的重要分子。TLR3主要表达于免疫细胞，定位于细胞内涵体(endosome)膜上的模式识另授体(pattern recognition receptor, PRR), 可识别经内吞作用进入细胞囊泡的dsRNA分子，诱导I型IFN表达。RIG-I/MDA5定位于细胞质内的PRR，识别胞质内dsRNA，通过不依赖TLR3的方式诱导IFN合成。这些研究成就为外源dsRNA通过受体结合，激活细胞信号通路，诱导IFN产生显示了亮点(Alexopoulou L， Holt AC,Medzhitov R,et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature, 2001,413 [6857] :732-738)。有关干扰素诱导剂、IFNs的产生和IFNs发挥各种重要生理功能的细胞分子机理已经研究得很清楚。关于TLR3细胞信号转导通路与dsRNA分子。TLRs是单次跨膜受体，分为胞外区、 跨膜区和胞内区。胞外区有LRRs(leucine-rich repeats)结构域，由18 31个富含亮氨酸的重复序列和半胱氨酸结构所组成，识别特定的病原相关分子模式(PAMP)配体，如病原体组分、病原体产物、dsRNA。胞内区是TLR向下游传递信号的核心元件，由大约200个氨基酸残基组成，因其与IL-I受体的胞内区相似，故称之为Toll/IL-Ι受体同源区(Toll/IL-1 receptor homologous region, TIR)(Martin MU, Wesche H. Summary and comparison of the signaling mechanisms of the To 11/interleukin-1 receptor fam ily.Biochim Biophys Acta, 2002,1592 [3] :265-280)。TLRs家族成员的胞外区结构的差异性较大，是结合不同配体的结构学基础。在已知的11个TLRs中，只有TLR3识别外源dsRNA、诱导I型 IFN合成(Alexopoulou L,Holt AC,Medzhitov R, et al. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by toll-like receptor 3. Nature,2001,413[6857] 732-738)。TLR3主要在DC细胞和成纤维细胞中表达，主要定位于DC细胞内涵体(Matsumoto M, Funami K, Tanabe M, et al. Subcellular localization of Toll-like receptor 3 in human dendritic cells. J Immunol, 2003,171 [6] :3154 3162.)和成纤维细胞表面 (Matsumoto Μ, Kikkawa S, Kohase Μ, et al. Establishment of a monoclonal antibody against human Toll-like receptor 3 that blocks double-stranded RNA-mediated signaling. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 293 [5] :1364 1369)。TLR3 信号通过丝氨酸/苏氨酸(kr/Thr)磷酸化、二聚化及其核置换激活IFN调节因子-3(IRF-3)。Ser/ Thr激酶TBK-I是TLR3介导活化及磷酸化IRF-3的关键。关于RIG-I/MDA5细胞信号转导通路与dsRNA分子。动物细胞还存在不依赖TLR3 识别dsRNA的受体。视黄酸诱导基因蛋白I(RIG-I)是细胞内识别病毒双链RNA的一种受体，属含 DexD/H box的dsRNA解旋酶家族成员。RIG-I的C端是解旋域，可以借助解旋酶结构域结合 dsRNA(人工合成的和病毒的)，并以ATP酶依赖的方式解开双链RNA ；N端是2个串联的半胱天冬酶募集结构域(CARD)。诱导IFN-β表达需要RIG-I，但是，RIG-I并不参与IFN-β 下游的信号通路(Kato H, Sato S, Yoneyama M, et al. Cell type-specific involvement of RIG-I in antiviral response. Immunity, 2005，23 [1] : 19 28)。MDA5 也是一个能结合 dsRNA、激活 IRF-3 (IFN regulatory factor 3)、诱导 IFN 表达的信号分子(Kata H, Takeuchi 0, Sato S,et al. Differential roles of MDA5 and RIG—I helicases in the recognition of RNA viruses. Nature, 2006,441 [7089] :101 105)。MDA5N 端也有 CARD 结构域，C端也有结合dsRNA的DExD/H box RNA解旋酶结构域。全长MDA5并非诱导IRF3 激活和IFN表达的必要条件。只要C端DExD/H box RNA解旋酶结构域结合dsRNA，MDA5才被激活(Yoneyama M, Kikuchi M, Matsumoto K, et al. Shared and unique functions of the DExD/H-box helicases RIG-I, MDA5, and LGP2 in antiviral innate immunity. JImmunol, 2005,175 [5] J851 沘58)。MAVS和CARDIF在RIG-I信号通路中具有重要作用。 MAVS定位于细胞线粒体外膜，是RIG-II下游信号通路中的重要功能分子，为RIG-I和MDA5 下游的信号分子，将信号传递给激酶IKK ε和ΤΒΚ1，进而激活IRF3(kth R B, Sun L, Ea C K, et al. Identification and characterization of MAVS, a mitochondrial antiviral signaling protein that activates NF-kappaB and IRF 3. Cell,2005,122[5] 669 ~ 682)。TLRs诱导I型IFN表达。I型干扰素包括IFN- α、IFN- β、IFN- ε和IFN- λ，是连接天然免疫和获得性免疫的关键枢纽分子。TLRs能诱导树突状细胞(DC)产生I型干扰素(Hoebe K, Janssen E M, Kim S 0, et al. Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways. Nat Immunol, 2003, 4[12] :1223 1229)。不同的 TLRs 诱导产生I型干扰素能力并不相同，111 3、11^4、11^7、11^9能诱导产生IFN-α / β，而其他 TLRs似乎不能。同样地，不同的DC细胞亚群产生I型干扰素的能力也不一样。pDC是I型干扰素分泌细胞，高表达TLR7和TLR9，受到相应配体刺激时诱导大量的IFN- α ；mDC虽然也表达TLR7和TLR9，但是受体被激活后产生的细胞因子是IL-12。人类基因组中编码有各种干扰素基因，人类细胞有复杂的干扰素调控系统。目前已发现有二条途径介导TLRs信号转导，一为髓样分化因子88 (myeloid differentiation factor 88MyD88) it Wi^k^ (Akashi S, Shimazu R, Ogata H, et al. Cutting edge cell surface expression and lipopolysaccharide signaling via the toll-like receptor 4—MD—2 complex on mouse peritoneal macrophages. J Immunol.2000, 164[7] :3471-3475)；另一条为 MyD88 非依赖性途径(Kawai Τ, Adachi 0，Ogawa Τ, et al. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin. Immunity,1999,11[1] 115-12 。MyD88分子是大多数TLRs信号转导中的接头分子，但是，MyD88功能缺失并不能完全终止所有的TLRs信号。所以，TLRs信号转导必然还存在MyD88非依赖信号途径。 dsRNA被TLR3胞外LRR结构域识别，引起胞内IlR结构域变化，与TRIF的TIR结构域相互作用，通过接头分子Trif介导下游的信号转导，其中Trif-RIPl或者Trif_TRAF6通路激活 NF-k B诱导炎症因子的分泌，而Trif-TBKl/IKK ε通路激活IRFs，诱导I型IFN分泌(Kawai T，Akira S. TLR signaling. Cell Death Differ, 2006,13 [5] :816 825)。TLRs 的胞外 LRR结构域识别不同的PAMP，引起胞内IlR结构域的构象变化，再招募下游含IlR结构域的细胞信号转导分子MyD88、TRIF (TICAM-I)、TRAM、TIRAP (Mal)等向细胞核内传递信号，激活 NF-k B、IRF-3, AP-I (activation protein 1)等家族的转录因子，后者在IFN基因的增强子上形成转录复合物，调控I型IFN基因表达。六、干扰素受体及其信号通道产物IFN释出胞外，与靶细胞特异性受体结合后，激活与受体胞浆端相连的“两面神”激酶(Janus kinases, JAKs)，JAKs再磷酸化激活信号转导子和转录激动子(signal transducers and activators oftranscription, STATs)中的酷氛酸残基，使信号放大。 粦酸化激活的STATs酪氨酸残基与磷酸化酪氨酸的Src同源区2 (Sffi)形成同二聚体和异二聚体。异二聚体和同二聚体都可与IRF结合，组成不同的三聚体。不同的三聚体与IFN激活的调节序列(IFN stimulated regulatory elements, ISREs)结合以分别驱动 IFN-α /β调控的基因表达或IFN-Y调控的基因表达。以前认为 dsRNA 依赖蛋白激 Bl (double-stranded RNA-dependent Protein Kinase, PKR)是细胞内信号传导通路的重要因子，dsRNA诱导的PKR途径是IFN产生的主要信号传导通路。近年的研究工作已经搞清，蛋白激酶HiR以及2' -5'寡聚腺苷酸合成酶 (OAS)处于干扰素介导的抗病毒反应的下游，并不参与干扰素本身的基因表达的调控过程， 而是蛋白激酶PKR和2' -5'寡聚腺苷酸合成酶(OAS)参与IFN介导的抗病毒反应(Smith E J, Marie I，Prakash A, et al. IRF3 and IRF7 phosphorylation in virus-infected cells does not require double-stranded RNA-dependent protein kinase R or Ikappa B kinase but is blocked by Vaccinia virus E3L protein. J Biol Chem,2001,276[12] 8951 8957)。dsRNA分子及其诱导I型干扰素产生的细胞信号转导通路的研究成绩为潜在地使用BTV NdsRNA作医用内源性IFN诱导剂以诱导人体内源性IFN提供了理论依据。这一系列的基础理论研究成绩结合申请人的前期应用基础理论研究成绩已经为申请人提出的本发明专利奠定了坚实的理论基础和技术条件。利用体外培养细胞增殖BTV，提取dsRNA，制备内源性干扰素诱导剂，直接用于人体，遵循机体自身防御反应方式诱导各种内源性干扰素，赋予人体以抗病毒病临床治疗和预防、抗肿瘤的治疗和联合治疗、以及广泛的防病、治病和增强体质的功能，具有高度的安全性和高效性。七.小结本发明是在我们前期以BTV NdsRNAs作为外源性干扰素诱导剂(ExII)诱导体外培养细胞产生外源性干扰素(EXI)的基础上发展起来的。如前所述，IFNs可分为内源性干扰素(ENI)和EXI。EXI就是在体外用ExII刺激离体培养细胞所生产的或基因工程合成的而后用于机体的IFN。EXI存在诸多缺点，如所用INF的种类单一，所以，相对于ENI，其药物和生理功能较差；INF属蛋白质多肽类，所以， EXI用于人体为异源抗原，发挥免疫原性，会引起机体异源反应和依赖性，同样具有较大的毒副作用；而且其制备复杂、价格昂贵，保存和运输麻烦，所以，限制了 EXI的大量生产和普及应用。亦如前所述，ENI则是用内源性干扰素诱导剂(EnII)于体内，直接诱导机体产生的内源性IFNs。用EnII在人体内直接诱导产生的ENI能克服EXI的诸多不足，如诱生的 IFN种类齐全、体内浓度高、没有异源蛋白质的免疫原性(即过敏反应和排斥反应)、没有依赖性、无需提纯、造价低廉、……等。也由于IFNs具有相对种属特异性，所以，ENI的抗病毒、抗肿瘤以及调理功能活性最强。同时，EOT既可作为治疗用药，也可以作为预防用药。然而，欲想得到ENI，关键是要获得能安全应用于人体的、能有效诱导人体产生EOT的、造价低廉的、便于工业化生产的、不污染环境的、资源丰富的ΕηΙΙ。目前，人类所用的最好的商业化的EnII是Poly [I: C]。如前所述，Poly [I C]具有一系列的缺陷，市场和临床应用都受到极大限制。所以，寻找和开发新的第二代医用EnII 是全世界生物医学家们角逐的领域，人类一直在追求安全而有效的医用ΕηΙΙ。本发明正是提供了这样一种全新的优于Poly[I:C]的内源性干扰素诱导剂 (EnII)。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供了一种应用于人体产生内源性干扰素的全新的异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂(BTV NdsRNA EnII)。为了实现临床应用，本发明采用以下技术措施一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法，其步骤是1.细胞培养以世界卫生组织推荐为生产人用疫苗的理想细胞，一非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)或幼仓鼠肾传代细胞(BHK-21)为病毒扩增培养细胞。细胞在37°C、5% C02、10%小牛血清、DMEM培养基常规培养。2. dsRNA BTV增殖待细胞长至80% _90%汇合时，弃培养液，用pH 7. 4的IXPBS 洗涤贴壁细胞1-2次，接种BTV病毒株悬液1. Oml于培养瓶，37°C吸附1_2小时后，弃病毒液，以含2%小牛血清的添加DMEM培养基在37°C，5% CO2条件下维持培养。随后每12小时光镜下观察一次，至细胞出现明显细胞病变效应(CPE)，即当CPE达90%时收获病毒。3. dsRNABTV的提取和纯化收获培养的dsRNABTV按本研究室获得的高活性、高纯度、高通量制备病毒的“反向免疫共沉淀技术”(PARA ；)工艺(中国专利ZL2004100U605. 9) 提取和纯化dsRNA BTV。4. BTV dsRNA 的提取(a) PEG6000浓缩上述提取和纯化的BTV ；(b)裂解液裂解BTV ；(c)磁珠法提取 BTV dsRNA ；(d)蔗糖浓缩纯化的dsRNA ；(e)-20°C保存，备用。5.病毒基因组dsRNA的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，分析电泳图谱鉴定。6.提取dsRNA纯度鉴定采用紫外分光光度法(根据0拟60/0拟80比值)结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术判断所提取dsRNA的纯度。7.双链RNA浓度的测定采用紫外分光光度法测定双链RNA含量，根据dsRNA浓度=OD260 X 稀释倍数 Χ40(μ g/ml)。8.制备成注射剂型，经肌内注射使用。实验研究统计分析结果及说明本发明所作的BTV dsRNAs体内诱导内源性干扰素产生的研究是在我们前期在体外培养细胞上所作的BTV dsRNAs诱导外源性干扰素的基础上开展的。与现有技术相比，本发明具有如下优点和有益效果1.能非常安全地运用于人体。BTV不引起人类任何疾病；含分段dsRNA，带依赖 RNA的RNA聚合酶，故提取和纯化的BTV dsRNAs没有感染性；BTV为dsRNA病毒，没有肿瘤源性；为天然病毒，不会影响生态平衡。所以，本发明制备的新的内源性干扰素诱导剂BTV NdsRNAEnII系天然病毒双链RNA，能非常安全地运用于人体。2.为新的理想的天然核酸药物。本发明制备的EnII能直接诱导机体产生种类齐全的内源性干扰素(ENIs)。干扰素(Interferons，IFNs)是人类至今所发现的最好的一类细胞因子，不仅具有抗肿瘤和抗病毒作用，而且具有增强体质的调理作用；既能治疗疾病， 又能预防疾病；既能抗已知病毒，也能抗未知病毒(包括烈性病毒，如SARS-CoV、禽流感病毒)。本发明制备是医用内源性干扰素诱导剂(Endo-hterferon Inducer, ΕηΙΙ)，直接用于人体内诱导机体产生ENIs。在这种情况下，机体变成了生产干扰素的复合工厂，以生产各型干扰素，发挥抗肿瘤、抗感染和调理作用。EOT是天然干扰素，所以，用EnII在人体内直接诱导产生的MI能克服EXI的诸多不足，如诱生的IFN种类齐全、体内浓度高、没有异源蛋白质的免疫原性(即过敏反应和排斥反应)、没有依赖性、无需提纯、造价低廉、既可用作治疗用药，也可以作为预防用药等。也由于IFNs具有相对种属特异性，所以，内源性干扰素抗病毒、抗肿瘤以及调理功能活性最强。并且，本发明制备的EnII用于人体完全遵循机体产生干扰素的防御反应机制，能更有效诱导内源性干扰素产生。3.本发明的临床效果显著地优于目前所用的最好的商业化的Poly[I:C]。 Poly[I:C]为人工合成的小片段dsRNA分子，诱生IFN的能力低，伴有许多副作用，且价格昂贵，市场受到极大的限制。本发明在研究BTV NdsRNA EnII过程中，无论体内还是体外，均以Poly[I:C]为对照；无论在理论上，还是在体内、外实验结果上，BTV NdsRNA EnII均优于 Poly[I:C]。4.具有显著的资源优势。(A)BTV NdsRNA是一种全新的对人安全的天然的可无限再生的绿色生物材料，取之不尽，用之不竭。BTV NdsRNA EnII正是以之为资源而提取制备的天然EnII ； (B)申请人拥有22个(几乎全部)血清型BTV资源、人癌细胞和动物癌细胞资源；形成了全套管理、保管、使用、监测.......等技术系统。5.具有潜在的其他生理学功能。申请人的前期工作也提示了，BTVNdsRNA不仅具有诱导ENIs产生的生理功能，而且具有诱导白细胞间介素-2 (IL-2)产生的生理功能。BTV NdsRNA EnII理所当然地也能用作BTV NdsRNA ExII06.全新的系统和理论。其作用机理是利用“裸露的动物病毒基因组 dsRNA(NdsRNA)直接调控人源细胞干扰素基因的表达”。这是一个全新的系统，揭示了裸露的病毒基因组dsRNA无须用转基因技术而直接通过注射的方式应用于人体，并安全而有效地诱导机体产生各种ENIs，发挥其药理和生理作用。7.本发明所用资源便于离体增殖和纯化制备，有利于产业化，生产成本低，容易获取。8.由于EnII体内诱导ENIs产生的速度快、安全、高效、造价低廉，所以，既能用于临床疾病的常规预防和治疗，也可应对突发性公共卫生事件。9.本发明制备的EnII市场很大。申请人的前期工作已经展示了理想的EnII的医学价值和市场前景。BTV NdsRNA具有诱导IFN产生的生理功能，具有选择性抗癌的作用，而病毒病和肿瘤这两类疾病都是目前对人类健康和生命威胁最大的疾病之一。从近年新的病毒病等(如AIDS、SARS、禽流感、结核等)的出现和流行来看，新的传染病的预防显得特别重要，在这一点上，更是EnII的用武之地。所以，EnII既在新、老传染病预防和治疗上有广阔的市场，又具有应对突发性公共卫生事件的重大价值，比如说，它是抗乙型肝炎的首先药物，可见一斑。由于ENI较EXI有无可比拟的优点，所以，理想的EnII将会占据IFN相关生产的95%以上的市场，并会极大地扩大现有IFN市场。
图1. BTV dsRNA基因组聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱和琼脂糖凝胶电泳图谱图2.实验动物体内比较研究BTV dsRNA与Poly [I C]诱导IFN- α产生的消长曲线图(有限观察时间6小时)图3.实验动物体内比较研究BTV dsRNA与Poly [I: C]诱导IFN-β产生的消长曲线图(有限观察时间6小时)图4.小鼠体内BTV dsRNAs预防和治疗流感病毒Hmi感染性肺炎的组织学切片 (HE染色)图4-A.正常组鼠肺组织(HE染色，x400)，可见肺泡组织结构正常，间隙清楚，无渗
出ο图4-B.病毒模型组鼠肺组织(HE染色，x400)，可见肺泡间隔不清，肺泡有大量渗出，大量炎性细胞聚集。图4-C. Poly[I:C]预防组鼠肺组织(HE染色，x400)，与图4-B比，病变较轻，可见肺泡组织结构，肺泡间隔少量渗出，有炎性细胞聚集。图4-D. BTVNdsRNA预防组鼠肺组织(HE染色，x400)，与图4_B比较，仅少量渗出， 些许炎性细胞聚集；与图4-C比较，组织病变明显较轻，肺泡组织结构清楚，肺间隔渗出少， 伴少许炎性细胞。图4-E. Poly [I C]治疗组鼠肺组织(HE染色，x400)，与图4_B比较，病变组织有所好转，肺组织轮廓可见，但肺间隔仍有大量炎性渗出，伴炎性细胞浸润。图4-F. BTVNdsRNA治疗组鼠肺组织(HE染色，x400)，与图4_B比较，肺泡间隙清楚，病变明显改善；与图4-E比较，肺组织病变显著轻微，肺组织轮廓清晰，肺间隔少许渗出ο图5.流感病毒核酸RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱A为Marker ；B为PCR产物条带；C为未加模板的阴性对照。图6. Real-time PCR检测各实验组小鼠肺组织流感病毒HmiRNA载量曲线6-A.正常对照组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线；图6-B.模型对照组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线；图6_C.Poly[I:C]预防组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线；图6-D. BTV dsRNA预防组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线；图6_E.Poly[I:C]治疗组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线；图6-F. BTV dsRNA治疗组鼠肺组织流感病毒Hmi RNA Real-time PCR扩增曲线。图7.各实验组鼠肺组织内流感病毒Hmi RNA载量比较图(PIC即Poly [I :C])图8.各实验组小鼠血清IFN- α、IFN- β、IFN- γ等内源性干扰素浓度比较(观察 7 天；PIC 即 Poly[I:C])
具体实施例方式下面结合具体的实施例进一步详细阐述本发明。应当说明的是，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求的保护范围。我们前期在体外培养细胞上所作的BTV dsRNAs诱导外源性干扰素的研究中，均以目前最好的已商品化的Poly[I:C]为对照，开展BTV dsRNAs体外诱导干扰素的有效性研究；以人源正常细胞和恶性肿瘤细胞对照研究了 BTV dsRNAs体外诱导干扰素的有效性和安全性。部分结果见表1-4。表1.不同浓度BTV分别诱导Hela细胞和HEL细胞产生β-IFN含量的直线回归
权利要求
1. 一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法，其步骤如下(1)细胞培养以非洲绿猴肾细胞或幼仓鼠肾传代细胞为病毒扩增培养细胞，在37°C、 5% CO2、10%小牛血清、DMEM培养基常规培养；(2)dsRNABTV增殖待细胞长至80% -90 %汇合时，弃培养液，用pH 7. 4的IXPBS洗涤贴壁细胞1-2次，接种BTV病毒株悬液1. Oml于培养瓶，37°C吸附1_2小时后，弃病毒液， 以含2%小牛血清的添加DMEM培养基在37°C，5% CO2条件下维持培养，随后每12小时光镜下观察一次，至细胞出现明显细胞病变效应，即当CPE达90%时收获病毒；(3)dsRNA BTV的提取和纯化收获培养的dsRNA BTV按中国专利ZL200410012605. 9的 “反向免疫共沉淀技术”工艺提取和纯化dsRNA BTV ；(4)BTV dsRNA 的提取(a)PEG6000浓缩上述提取和纯化的BTV；(b)裂解液裂解BTV;(c)磁珠法提取BTVdsRNA ；(d)蔗糖浓缩纯化的dsRNA；(e)-20°C保存，备用；(5)病毒基因组dsRNA的鉴定采用琼脂糖凝胶电泳技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术， 分析电泳图谱鉴定；(6)提取dsRNA纯度鉴定采用紫外分光光度法结合聚丙烯酰胺凝胶电泳技术判断所提取dsRNA的纯度；(7)双链RNA浓度的测定采用紫外分光光度法测定双链RNA含量；(8)制备成注射剂型，经肌内注射使用。
全文摘要
本发明公开了一种异源蓝舌病毒双链RNA内源性干扰素诱导剂的制备方法。该诱导剂是从动物蓝舌病毒中提取裸露的dsRNA分子制备而成的，直接用于人体，诱导人体产生内源性干扰素，赋予人体抗病毒、抗肿瘤以及广泛的防病、治病和增强体质的功能。主要优点A)直接诱导人体产生种类齐全的ENI、体内浓度高、抗病毒和抗肿瘤活性最强、没有异源蛋白的免疫原性、没有依赖性、无须提纯、造价低廉。B)没有感染性；系dsRNA病毒，没有肿瘤源性；为天然病毒，不会影响生态平衡。C)是一种全新的对人安全的天然的绿色生物材料，用之不竭、可无限再生，便于离体增殖和纯化制备。D)高度符合种属特异性，在人体内的药理作用最强。
文档编号C12N15/113GK102350001SQ201110325180
公开日2012年2月15日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者刘军, 方兰, 杨继红, 董长垣, 邓庚粮, 陈冬娥 申请人:武汉大学