纤维连接蛋白抑制剂-四肽rgds在制备抗ev71病毒药物的用图
【专利摘要】本发明公开了一种纤维连接蛋白（FN）抑制剂?四肽RGDS的抗EV71病毒作用。本发明证实使用FN抑制剂RGDS处理人横纹肌肉瘤细胞可以抑制EV71病毒的感染，进一步的研究表明FN抑制剂?四肽RGDS是通过阻断病毒入侵到细胞的步骤达到抗EV71病毒的作用。此外，FN抑制剂?四肽RGDS可以阻断EV71感染小鼠并改善其健康状况，提高其存活率。本发明首次发现四肽RGDS具有抵抗EV71病毒感染的活性。为预防或治疗EV71感染提供潜在的策略。
【专利说明】
纤维连接蛋白抑制剂-四肽RGDS在制备抗EV71病毒药物的 用途
技术领域
[0001 ]本发明属于医药技术领域，涉及四肽RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)的药物新用途，具体 是其在制备抗EV71病毒药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 感染人类的肠道病毒71型(EV71)可以在全世界，尤其是亚洲太平洋地区，造成婴 幼儿的手足口疾病的感染，有时候会引发神经性的或者系统性的并发症。EV71是基因组很 小的单股正链RNA病毒，大约7500个碱基。RNA基因组有一个开放阅读框编码一个多聚蛋白， 该蛋白可以切割为11个蛋白，其中包括:4个衣壳蛋白（VP1-4)和7个非结构蛋白（2A-C、3A-D)。在这些病毒蛋白中，衣壳蛋白VPl在病毒的感染过程中影响病毒的毒力和嗜神经性以及 病毒对细胞的入侵。
[0003] 纤维连接蛋白（fibronectin，FN)是一个定位于细胞外基质的广泛分布的多结构 域的大分子量糖蛋白。它的分子量大约230KD-250KD，除了在胞外基质中，在血清中的含量 也很丰富。FN的结构较为特殊，由三种模块排列组合而成，分别是I型模块，II型模块和III 型模块。在I型模块和II型模块之间有两个分子内的二硫键可以稳定折叠的分子结构。III 型模块没有二硫键连接，是由7个串联的β折叠的结构形成。FN的亚单位或者说结构域介导 了FN的自组装以及和胶原蛋白、整联蛋白、肝素、FN以及其他的胞外基质分子的配体结合过 程。两个FN分子通过C末端的一对反向二硫键可以形成一个500KD的二聚体。通过可变剪切 可以产生多种亚型的FN分子。在啮齿类动物和牛体内，一个FN基因的转录本可编码12个亚 型;在人体内，FN基因转录本编码20种亚型。通过在EIIIA/EDA和EIIIB/EDB之间的外显子跳 读以及V区/IIICS的外显子细分，可以产生多种可变剪切。分泌的FN分子是二硫键连接的， 可溶的，不活跃的二聚体形式，一旦和a5bl或者其他整联蛋白相互作用，FN分子就会被激 活。四肽RGDS(Arg-Gly-Asp-Ser)是FN细胞结合结构域的最关键的组分，游离的四肽RGDS可 以作为FN的抑制剂阻断FN结合到细胞表面的能力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供精-甘-天冬-丝氨酸四肽RGDS在制备抗肠道病毒71型药物中 的应用。
[0005] 本发明通过体外以及小鼠体内实验证明FN抑制剂-四肽RGDS具有抗EV71病毒作 用；以及FN抑制剂-四肽RGDS是通过阻断病毒蛋白结合到细胞表面并与细胞受体结合而具 有抗EV71病毒的功效。
[0006] 具体采用以下技术方案：
[0007] FN抑制剂-四肽RGDS在细胞和分子水平上对EV71病毒感染有抑制作用，预示FN抑 制剂-四肽RGDS可以做为临床抗病毒药物而进一步研究开发。首先使用FN特异性的抑制剂-四肽RGDS预处理人横纹肌肉瘤细胞，再感染EV71病毒，发现病毒的感染被极大程度的阻断， 而且四肽RGDS是通过阻断病毒蛋白结合到细胞表面并与细胞受体结合而具有抗EV71病毒 的功效;在小鼠体内同时腹腔注射FN抑制剂-四肽RGDS和EV71病毒，然后检测小鼠体内病毒 感染的载量和小鼠的健康状况以及存活率，发现FN抑制剂-RGDS对小鼠本身无明显毒性，但 是可以抑制EV71对小鼠的感染并提高小鼠的健康状况以及存活率。
[0008] 本发明揭示了四肽RGDS的一种新的生物学功能，能有效的抑制EV71病毒结合到细 胞表面及入侵并达到抗EV71病毒效果的机制；本发明还发现FN抑制剂-RGDS对小鼠本身无 明显毒性。为研制抗EV71病毒药物提供了理论和事实基础。
【附图说明】
[0009] 图I FN抑制剂-四肽RGDS可以抑制EV71感染人横纹肌肉瘤细胞并在病毒的入侵步 骤发挥作用
[0010] A.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染人横纹肌肉瘤细胞的影响(RNA水平）；
[0011 ] B.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染人横纹肌肉瘤细胞的影响（蛋白水平）；
[0012] C.对照组PBS和实验组抑制剂对细胞活性的影响的检测；
[0013] D.不同时间点给药(抑制剂处理)对EV71感染人横纹肌肉瘤细胞的影响(胞内病毒 RNA水平）；
[0014] E.不同时间点给药(抑制剂处理)对EV71感染人横纹肌肉瘤细胞的影响(胞外病毒 载量）；
[0015] 图2 FN抑制剂-四肽RGDS可以抑制EV71感染小鼠并提高小鼠的健康状况和存活率
[0016] A.对照组PBS和实验组抑制剂（inhib i tor)对小鼠体重影响的检测；
[0017] B.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染的小鼠体重影响的检测；
[0018] C.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染的小鼠健康状况影响的检测；
[0019] D.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染的小鼠存活率影响的检测；
[0020] E.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染的小鼠体内脑干和骨骼肌中病毒载量影 响的检测；
[0021 ] F.对照组PBS和实验组抑制剂对EV71感染的小鼠体内脑干和骨骼肌中病毒蛋白含 量影响的检测；
【具体实施方式】
[0022]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施 例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0023]【实施例1】FN抑制剂-四肽RGDS抑制EV71病毒感染人横纹肌肉瘤细胞并在病毒的 入侵阶段发挥作用
[0024] 实验材料
[0025] 1、细胞、病毒毒株
[0026]人横纹肌肉瘤细胞系RD由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，由本实验室保 存。EV71病毒由本实验室从感染者体内分离纯化。
[0027] 2、生化试剂及试剂盒
[0028] MEM培养基和胎牛血清(Gibco-BRL ,Gaithersburg ,MD)购自武汉生命生物技术公 司，VPl抗体购自Abnova公司，FN抑制剂-四肽RGDS购自sigma公司。
[0029] 3、逆转录酶等
[0030] M-MLV逆转录酶和RNA抑制剂(RNas in)购自Promega公司
[0031] Trizol、dNTP和Oligo dT(18T)购自 Invitrogen公司
[0032] SYBR Green PCR Master Mix，购自ABI公司
[0033] 4、耗材及仪器
[0034] 细胞培养板、细胞培养皿和细胞培养瓶购自Corning公司
[0035] 4°C高速离心机、小型高速离心机、二氧化碳细胞培养箱和细胞操作台购自Herus
[0036] 超纯水系统购自mi Ilipore
[0037] 荧光定量 PCR 系统 LightCycler480II 购自 Roche
[0038] RNA提取所使用的RNase free的各种型号枪头和EP管购自Eppendorf
[0039] 常规PCR仪购自东胜创新 [0040] 超声破碎仪购自Fisher公司
[0041]凝胶成像系统、电泳仪及Western转膜仪购自北京君意东方公司 [0042] Western扫描系统购自日本富士公司 [0043]实验方法
[0044] 1、哺乳动物细胞(贴壁)的培养
[0045] 细胞复苏
[0046] 1)预先准备好37°C_38°C温水，从液氮罐中取出需要复苏的细胞，用眼科手术镊子 固定，迅速置于水中，保证冻存管完全浸没与水中，使其均匀受热，直到冻存管内的细胞完 全融化；
[0047] 2)用酒精消毒冻存管；
[0048] 3)用吸管预先吸取5ml细胞培养基于T25细胞培养瓶中，再用新的吸管将融化的细 胞转移到细胞瓶中并轻轻吹打一遍；
[0049] 4)盖好细胞瓶盖，将细胞瓶放置于细胞培养箱中，37°C，5%C02静置培养；
[0050] 5)约6-8小时后(取决于不同的细胞），更换信息培养基以消除细胞冻存液中存留 的DMSO对细胞生长的影响。
[0051 ]细胞的传代和冻存
[0052] 1)当细胞长满T25细胞瓶后，用吸管吸取培养基并弃去；
[0053] 2)加入IOml的PBS，轻柔洗涤细胞后用吸管吸取并弃去；
[0054] 3)用吸管吸取1-1.5ml胰酶，使其覆盖住细胞瓶底部，将细胞瓶放入37°C，5 %⑶2 细胞培养箱静止3_5min(消化时间的长短取决于细胞种类）；
[0055] 4)显微镜观察，贴壁细胞变圆并且全部从细胞瓶壁脱离；
[0056] 5)在细胞操作台内，用吸管吸取约4ml培养基，加入细胞瓶内，轻柔的吹打，以吹散 细胞和中和胰酶的消化效果；
[0057] 6)用吸管吸取吹匀的细胞悬液(体积约1/3-2/3)到另一新的细胞瓶，再补加5ml的 培养基，放置于细胞培养箱中，37 °C，5 % CO2的环境下继续静置培养。
[0058] 2、EV71 感染 RD 细胞
[0059] EV71感染RD前，将含有胎牛血清的完全培养基换成无血清培养基，EV71感染的剂 量为2M0I，感染或处理9h后，收集细胞和培养上清进行下一步实验。
[0060] 3、逆转录荧光定量PCR检测目的基因 mRNA的表达水平
[0061] 1)逆转录反应体系如下
[0063] 逆转录反应条件：37 cC Ih，75Γ IOmin
[0064] 2)Real_time 反应体系
[0065]①目的基因的检测引物和内参引物
[0066] VPl:5，-AACGCACGTCATCTGGGATT-3，（ sense)，
[0067] 5，-GTCCAATCGGTGACTGCTCA-3,（antisense)
[0068] GAPDH:5，-GGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAACGG-3，（ sense)
[0069] 5，-CTCGCTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3,（antisense)
[0070] ②反应体系
[0072]③反应程序：
L 〇〇74j 4、Western检测蛍臼表达水平
[0075] 蛋白制样（以6孔细胞培养板培养细胞为例）
[0076] 1)贴壁细胞弃去培养基贴壁细胞弃去培养基，用预冷的PBS洗涤一次，再加入一定 量的PBS，细胞刮轻柔刮动细胞生长面，收集细胞；
[0077] 2)4°C，2000rpm离心10min，收集细胞，弃去PBS上清；
[0078] 3)加入60-80μ1已预先加好蛋白酶抑制剂Cocktail和终浓度为0.5mM DTT，预冷的 细胞裂解液，用移液枪吹打，重悬细胞；
[0079] 4)超声破碎仪调至3档，冰上超声，每次3_5s，重复3次；
[0080] 5)4°C，12000rpm离心10min，将上清转移至另一新的EP管，即得到细胞总蛋白；
[0081] 6)测定样品蛋白浓度；
[0082] 7)按实验设计的上样量分装，加入loading buffer，煮沸样品5min制样 [0083] SDS-PAGE分离蛋白和转膜曝光
[0084]①SDS-PAGE胶上样，Tris-gly缓冲液系统电泳分离蛋白，90V进浓缩胶，IIOV进分 离胶，以预染的蛋白质marker为指示；
[0085]②将SDS-PAGE胶从电泳系统中取下，浸入转膜缓冲液平衡，同时将相应大小的NC 膜也浸入转膜缓冲液平衡；
[0086]③按转膜垫、三层滤纸、NC膜、SDS-PAGE胶、三层滤纸、转膜垫的三明治模型制备转 膜芯体系，放入转膜槽，负极对SDS-PAGE胶，正极对NC膜，并且NC膜和SDS-PAGE胶的接触面 事先做好标记；
[0087]④4°C，70V恒压转膜2h，转膜结束，撤下NC膜，用圆珠笔根据预染的蛋白质marker 的位置，划定标识，用丽春红预染，粗略判断目的蛋白是否转膜成功 [0088]⑤PBS洗去丽春红，5 %的脱脂牛奶室温封闭1-2h，PBS洗去脱脂牛奶，用PBS根据说 明书的介绍稀释一抗，室温孵育Ih;
[0089]⑥TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次5min，用PBS根据说明书的介绍稀释二抗， 室温孵育30min;
[0090]⑦TBS-T洗膜缓冲液，摇床洗膜5次，每次IOmin，滤纸吸管膜上的洗膜缓冲液，按比 例加入曝光底物，暗处孵育5min;
[0091]⑧Western扫描系统采集信号分析。
[0092] 5、EV71拷贝数快速检测方法(Real time PCR)
[0093] 1)质粒浓度与拷贝数换算
[0094]①在分光光度计上，取2yL质粒溶液测定其浓度，重复几次，要求测得浓度值稳定， 初步估计质粒纯度以及是否有蛋白质污染的状况。
[0095] ②配制琼脂糖凝胶，检测质粒纯度及条带亮度。
[0096] ③根据以下公式将浓度换算为质粒拷贝数： r ^ amounl χ 6.022 x 10''
[0097] 拷贝数=--- lcnglh x I χ 10) χ650
[0098] amount:0D值（ng/yL);
[0099] length:质粒DNA喊基对数目（bp)。
[0100] 2)标准品制备
[0101]将上述已知拷贝数的质粒用灭菌去离子水进行稀释，如稀释到lX101()C〇pieS/yL， 然后再进行倍比稀释，浓度依次为 IO9，IO8，IO7，IO6，IO6，IO 5，IO4，IO3，IO2，IO1CopiesAiL t3 以 此作为测定EV71拷贝数的标准品。
[0102] 3)Real-time PCR
[0103] ①反应体系：
[0105]②VPl检测片段引物：
[0106] VPl:5，-AACGCACGTCATCTGGGATT-3，（ sense)，
[0107] 5，-GTCCAATCGGTGACTGCTCA-3,（antisense)
[0108] ③反应程序：
[0110] 实验结果和讨论
[0111] 用FN抑制剂-四肽RGDS(5μg/ml，下同）或者对照I3BS预处理RD细胞6小时，然后感染 EV71病毒，9小时后检测病毒感染情况，发现不论是胞内的EV71RNA水平或者病毒VPl的蛋白 水平，实验组抑制剂处理的含量都显著低于对照组PBS处理的，这说明FN抑制剂-四肽RGDS 可以抑制EV71病毒感染RD细胞（图IA，1B)。然后还检测了抑制剂对细胞活性的影响，发现和 对照组PBS相比，实验组抑制剂对细胞无明显毒性（图1C)。在不同的时间点使用抑制剂处理 RD细胞，然后感染EV71病毒，检测抑制剂在不同时间点对病毒感染的影响，结果发现在病毒 感染前或者感染早期（3H及以前)使用抑制剂处理对EV71感染RD有显著的抑制作用，而病毒 感染中后期处理却几乎没有显著的抑制作用（图1D，1E)，这说明FN抑制剂-四肽RGDS对EV71 病毒感染的抑制作用是在病毒早起的入侵阶段发挥作用的。
[0112] 【实施例2】FN抑制剂-四肽RGDS抑制EV71病毒感染小鼠并改善小鼠的健康状况，提 高小鼠的存活率
[0113] 实验材料
[0114] I、SPF级BALB/c小鼠购自上海斯莱克公司
[0115] 2、EV71小鼠适应株病毒由武汉大学潘兹书老师馈赠
[0116] 3、其他使用的试剂，仪器等均和前面所述相同 [0117]实验方法
[0118] 1、EV71感染初生小鼠（1日龄）；
[0119] 1)准备好合适滴度的EV71小鼠适应株病毒；
[0120] 2)配置好FN抑制剂-四肽RGDS(5mg/kg小鼠体重）；
[0121] 3)将对照PBS或者EV71小鼠适应株病毒和抑制剂通过腹腔注射进入小鼠体内；
[0122] 4)每天观察小鼠健康状况，进行临床得分评判并称量小鼠体重作好记录；
[0123] 5)每天观察小鼠存活状况，并做好记录；
[0124] 6)在EV71感染后第八天处死小鼠并分析其脑干和骨骼肌中EV71拷贝数和病毒VPl 蛋白含量；
[0125 ]小鼠临床得分标准：
[0126] 〇 健康
[0127] 1皮毛褶皱，驼背
[0128] 2肌无力，行动迟缓
[0129] 3-后肢瘫痪
[0130] 4双后肢瘫痪
[0131] 5垂死或者死亡
[0132] 实验结果和讨论
[0133] 通过前面的实验我们已经证明，在体外实验中，FN抑制剂-四肽RGDS可以有效抑制 EV71病毒感染细胞，那么在体内是否存在相似的效果呢?首先，我们验证了 FN抑制剂-四肽 RGDS对小鼠健康状况和体重的影响，我们发现和对照组I3BS处理相比，FN抑制剂处理后，小 鼠的健康状况和体重没有任何显著性的差异（图2A)，这说明FN抑制剂对小鼠没有毒性。接 下来，我们检测了FN抑制剂处理对小鼠感染EV71后体重变化以及临床指标的影响，发现FN 抑制剂可以显著恢复EV71病毒感染导致的小鼠体重的降低并改善小鼠的健康状况（图2B， 2CKEV71感染会导致小鼠死亡，而用FN抑制剂处理过的小鼠，其死亡率显著下降（图2D)，这 说明FN抑制剂可以有效降低EV71感染的小鼠的死亡率。不仅如此，在小鼠感染期，我们检测 了FN抑制剂对小鼠体内病毒载量的影响，发现FN抑制剂处理的小鼠体内脑干和骨骼肌的病 毒含量显著低于PBS对照组处理的（图2E，2F )，这说明FN抑制剂可以有效降低EV71感染小 ￡3
[0134] 综合这部分的实验，我们可以得出EV71病毒感染小鼠可以被FN抑制剂阻断并提高 小鼠的健康状况和存活率。这可能为后续研究FN抑制剂-四肽RGDS在治疗EV71病毒感染方 向上提供了基础和如提。
[0135] 至此，我们确定FN抑制剂-四肽RGDS可有效、高效地抑制EV71病毒的感染，揭示了 尚未被发现的FN抑制剂-四肽RGDS的新生物学功能，能在体内体外都达到抗EV71病毒感染 的效果，这一新发现为研制抗病毒药物提供了理论和事实基础。
【主权项】
1. 精-甘-天冬-丝氨酸四肽RGDS在制备抗肠道病毒71型药物中的应用。2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述精-甘-天冬-丝氨酸四肽RGDS用于抑制 肠道病毒71结合到细胞表面及入侵。
【文档编号】A61K38/07GK105963675SQ201610327037
【公开日】2016年9月28日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】朱应, 任盛, 佘应龙
【申请人】武汉大学