专利名称：传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法。
背景技术：
传染性法氏囊病(Infectious bursal disease，IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)引起的急性、高度接触性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致免疫抑制和免疫缺陷，同时造成其它疫苗的免疫失败，是目前危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV是双链RNA病毒，属于双RNA病毒科(Biranviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，其基因组由A、B两个节段组成。B节段(约2.8kb)编码VP1蛋白，为RNA依赖的RNA聚合酶。A节段(约3.3kb)具有两个相互重叠的开放阅读框架(ORF)，下游的ORF1编码的前体蛋白VP2/4/3可进一步剪切加工为VP2、VP4、VP3。其中VP2是病毒的主要宿主保护性抗原，与病毒的抗原变异和毒力相关；VP4为一种丝氨酸蛋白酶，负责前体蛋白VP2/4/3的自我剪切；VP3则是病毒的结构蛋白之一，具有群特异性抗原。上游的ORF2(438bp)编码非结构蛋白VP5(约15kDa)，该蛋白非病毒复制所必需，与病毒致病性有关。
将IBDV D78弱毒株ORF A2的起始密码ATG换成AGG(编码Arg)，其cRNA转染鸡胚细胞(CEC)获得无VP5表达的缺陷型病毒IBDV/VP5-可正常感染Vero细胞，提示VP5在IBDV复制并非必要。Yao等用VP5缺陷的D78弱毒株(rD78NSΔ)及亲本病毒rD78分别感染3周龄SPF鸡，前者即使加大接种剂量也不引起任何临床症状与法氏囊组织损伤，后者相反；并且两者诱生IBDV中和抗体的能力相似。进一步的研究表明，将VP5置于CMV启动子下游分别转染鸡B淋巴细胞(RP9)和鸡胚成纤维，结果VP5的表达诱导了RP9和鸡胚成纤维的细胞凋亡，而缺失了VP5拯救的病毒引起的细胞病变比野生型轻，复制速度比野生型慢，细胞上清液的病毒量比野生型降低30倍，缺失了VP5的病毒大大降低了细胞溶解释放病毒的能力，可见VP5具有很强的细胞毒性，与成熟病毒从胞内向胞外释放及病毒的致病性有关。因此对VP5相关生物学特性进行研究，将有助于我们进一步了解IBDV的致病和免疫机制。
发明内容
本发明的目的是提供一种一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法。
方法的步骤为1)性法氏囊病病毒基因组A、B节段RNA的抽提及其cDNA全长的克隆；2)VP5基因缺失的基因组A节段全长序列的获得及A、B节段感染性克隆的构建；3)上述感染性克隆共转染培养细胞，拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒ANhe2株；所述的传染性法氏囊病病毒基因组A、B节段RNA的抽提及其cDNA全长的克隆收集细胞培养的HZ2株传染性法氏囊病病毒，抽提其基因组A、B节段RNA，用长距离精确RT-PCR扩增基因组A、B节段cDNA全长，克隆于pGEM-T easy，获得重组载体pGEM-T-A/HZ2和pGEM-T-B/HZ2，并进行序列测定。
VP5基因缺失的基因组A节段全长序列的获得及A、B节段感染性克隆的构建回收pGEM-T-A/HZ2经Ndel酶切后的长片段并重新自连获得pGEM-T-AN；以上下游突变引物The2SAGATCAGACAAACGATCGCAG和TheAGcTaGcAATGATAGCGTTATAGAAG、TaKaRa MutanBEST Kit进行PCR介导的定点突变，获得3603bp的线性化载体并直接自身连接后，获得含有点突变和片段删除的突变体pGEM-T-The2，并测序证实。将pGEM-T-The2623bp的EcoRI/Nde I酶切片段与来自于pGEM-T-A/HZ2的2615bp的Nde I/Kpn I片段线性连接后，直接插入经EcoR I/Kpn I酶切的pCI载体，获得最终用于转染的真核表达质粒pCI-ANhe2，其保藏号为CGMCC No.1507，以重组质粒pGEM-T-B/HZ2为骨架，以EV5CGCCCTTAAGACCGGTCGaTAtcGGAACGAAG和B3ATTTCTAGAGGGGGCCCCCGCAGGCGAA为突变引物，使用Pfu聚合酶扩增出573bp的突变片段，同时对573bp片段和pGEM-T-B/HZ2进行Af1 II/Xba I双酶切，用573bp片段替换pGEM-T-B/HZ2的对应部分，得到含有EcoRV标记的B节段重组子pGEM-T-mB/HZ2，测序证实后，以EcoRI/XbaI/Pvu I酶切pGEM-T-mB/HZ2，回收2833bp片段，与经过EcoRI/XbaI酶切的pCI载体连接，获得用于转染的真核表达质粒pCI-mB/HZ2，其保藏号为CGMCC No.1506。
将上述感染性克隆共转染培养细胞，拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒ANhe2株在脂质体Lipofectamine 2000介导下，以pCI-ANhe2/pCI-mB共转染80％融合度的鸡胚成纤维细胞，通过细胞病变、模拟病毒传代、分别以兔抗IBDV血清和兔抗IBDV VP5血清为一抗的间接免疫荧光试验、电镜观察病毒粒子，RT-PCR和酶切鉴定等实验证实拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒，将该病毒命名为ANhe2株。
图1是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A、B节段cDNA扩增和克隆过程及图谱。
图2是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A节段RT-PCR鉴定图谱。
图3是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组B节段RT-PCR鉴定图谱。
图4是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组A节段突变体及其真核表达质粒的构建过程及图谱。
图5是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组A节段突变体的测序情况。
图6是本发明提供的含有传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组A节段突变体的真核表达质粒pCI-ANhe2的酶切鉴定图谱。
图7是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组B节段突变体的构建过程及图谱。
图8是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组B节段突变体的测序情况。
图9是本发明提供的含有传染性法氏囊病病毒(IBDV)的基因组B节段突变体的真核表达质粒pCI-mB的酶切鉴定图谱。
图10是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因缺失株ANhe2株的细胞病变效应观察(100×)。
图11是本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因缺失株ANhe2株细胞培养物的间接免疫荧光试验观察病毒结构蛋白与非结构蛋白的表达情况(100×)。
具体实施例方式
2005年10月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏号为CGMCCN01506和CGMCCNO1507。
实施例1本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组A、B节段全长序列的获得方法，长距离RT-PCR扩增并克隆IBDV双节段基因组的整个实验过程如图1所示。
(一)RT-PCR扩增传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株基因组A、B节段全长序列收集传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株的鸡胚成纤维(鸡胚成纤维)细胞培养液反复冻融3次；5000rpm，4℃，5min离心，取上清；14000rpm，4℃，5min离心，取上清；上清用漏斗加至透析袋中，置于50％聚乙二醇(PEG)中，置4℃过夜，浓缩100倍；用移液器吸出浓缩后的病毒液，-20℃保存备用。
取200μl透析后的病毒液，加入一新的用DEPC处理过的0.5ml eppendorf管中；分别加入SDS和蛋白酶K至终浓度为0.5％和1mg/ml，50℃，消化2hrs；分别用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/1)、氯仿/异戊醇(24/1)抽提一次，离心取上清，加入3M NaAc至终浓度为0.3M，再加入650ml冰冷无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃过夜，沉淀RNA；12000rpm，4℃，离心10min，沉淀用预冷的75％乙醇漂洗；室温挥发乙醇，视沉淀量加入适量DEPC处理水，轻轻吹打混匀；经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，-20℃保存备用。
针对基因组A、B节段全长序列分别设计引物，见表1，A5/A3用于扩增A节段全长序列，B5/B3用于扩增B节段全长序列。所有引物均用DEPC处理水稀释至25μM，-20℃保存备用。
表1传染性法氏囊病病毒基因组A、B节段cDNA扩增用引物序列
使用前以下各种成分混匀并短暂离心5μl病毒RNA基因组悬液，2μl反转录引物(2.5μM)，2μl 10×PCR buffer，2μl MgCl2(25mM)，1μl dNTP(10mM)，2ul DTT(0.1M)；98℃，5min，立即冰淬灭1min；50℃，5min；加1μl(200U)MMLV反转录酶至管内，混匀，50℃，50min；70℃，15min终止反应，冰淬灭；立即进行PCR反应；或冷冻保存。按照Roche公司Expand HighFidelity PCR System的操作指南进行PCR反应，以反转录合成的第一链为模板，PCR反应参数为94℃预变性3min，94℃变性15sec，60℃退火30sec，68℃延伸5min；循环30次，72℃延伸10min。反应完毕后取1～21％琼脂糖凝胶电泳检测，结果得到约3.3kb的A节段cDNA(见图2。1，DNA maker；2&3，A节段cDNA)和2.8kb的B节段cDNA(见图3。M，DNA maker；1，B节段cDNA)。
(二)IBDV HZ2株基因组A、B节段全长序列的克隆割胶回收PCR产物直接连接到pGEM-T easy载体(Promega公司)上。具体按照说明书进行，在0.5ml离心管中，依次加入以下试剂2×Buffer 5μl，pGEM-T easy 1μl，回收的PCR产物4μl，T4DNA liagase 1μl，室温连接1h，转化大肠杆菌HD5α，涂布含氨苄青霉素的LB平板，挑取单菌落，以LB培养基过夜扩大培养，抽提质粒DNA，进行PCR和酶切鉴定。为进一步证实序列的正确性，每个节段各选3个独立的阳性克隆进行测序。测序用引物步进法，在ABI3730测序仪上进行。对测序正确的克隆分别命名为pGEM-T-A/HZ2和pGEM-T-B/HZ2。测序结果表明，HZ2株的A节段共有3259bp，序列如下1 ggatacgatc ggtctgaccc cgggggagtc acccggggac aggtcgccaa ggccttgttc61 caggatggaa ctcctccttc tataacgcta tcattgatgg tcagtagaga tcagacaaac121 gatcgcagcg atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag181 ccttctgatg ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac241 tctcaggtca gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat301 tgtctttttc cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa361 tgggaactac aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagttacaa421 ctactgcagg ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacacttc ctggtggcgt481 ttatgcacta aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac541 agatgttagc tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa601 cgtcctagta ggggaagggg tcaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta661 tgtgaggctt ggtgacccca ttcccgcaat agggcttgac ccaaaaatgg tagccacatg721 tgacagcagt aacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc781 atcacagtac caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgccat841 cacaagcctc agcgttgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccatg gccttgtact901 gggcgccacc atctacctca taggcttcga tgggacagcg gtaatcacca gggctgtggc961 cgcaaacaat gggctgacga ccggcaccga caaccttttg ccattcaatc ttgtgattcc1021 aacaaacgag ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag1081 tggtggtcag gcaggggatc agatgtcatg gtccgcaaga gggagcctag cagtgacgat1141 ccatggtggc aactatccag gggccctccg tcccgtcacg ctagtggcct acgaaagagt1201 ggcaacagga tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc1261 tgaactagca aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta1321 cacaaaattg atactgagtg agaggggccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag1381 ggagtacact gactttcgtg aatacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa1441 gattgcagga gcattcggct tcaaagacat aatccgggcc ataaggagga tagctgtgcc1501 ggtggtctcc acattgttcc cacctgccgc tcccctagcc catgcaattg gggaaggtgt1561 agactacctg ctgggcgatg aggcacaggc tgcttcagga actgctcgag ccgcgtcagg1621 aaaagcaaga gctgcctcag gccgcataag gcagctgact ctcgccgccg acaaggggta1681 cgaggtagtc gcgaatctat tccaggtgcc ccagaatccc gtagtcgacg ggattcttgc1741 ttcacctggg gtactccgcg gtgcacacaa cctcgactgc gtgttaagag agggtgccac1801 gctattccct gtggttatta cgacagtgga agacgccatg acacccaaag cattgaacag1861 caaaatgttt gctgtcattg aaggcgtgcg agaagacctc caacctcctt ctcaaagagg1921 atccttcata cgaactctct ctggacacag agtctatgga tatgctccag gtggggtact
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(一)含有VP5基因缺失的A节段的真核表达质粒的构建，整个构建过程如图4所示。
以NdeI酶切pGEM-T-A/HZ2，回收长片段(2645bp)，并重新自连，获得含有IBDV A节段5’端647bp的重组T载体pGEM-T-AN。以上下游突变引物(The2SAGATCAGACAAACGATCGCAG，129-149nt；TheAGcTaGcAATGATAGCGTTATAGAAG，77-101nt，NheI)、TaKaRa MutanBEST Kit进行PCR介导的定点突变，获得3603bp的线性化载体并直接自身连接，获得含有点突变和片段删除的突变体pGEM-T-The2，并测序证实(见图5，方框内为突变后的序列GCTAGC，为NheI酶切位点；箭头所指中括号内为野生病毒基因序列GATGGTCAGTAG。)。将pGEM-T-The2的EcoRI/NdeI酶切片段(623bp)与来自于pGEM-T-A/HZ2的NdeI/KpnI片段(2615bp)线性连接后，直接插入经EcoRI/KpnI酶切的pCI载体，获得最终用于转染的真核表达质粒pCI-ANhe2，并酶切鉴定(图6。泳道M、DNA maker，1、XhoI酶切，2、NdeI酶切；结果与预期的完全一致。)。
(二)含有B节段真核表达质粒的构建，整个构建过程如图7所示。
以重组质粒pGEM-T-B/HZ2为骨架，通过PCR介导的定点突变在B节段cDNA上引入新的酶切位点EcoRV(GATATC)作为分子标记。突变引物EV5CGCCCTTAAGACCGGTCGaTAtcGGAACGAAG(2265～2296nt)，其中“CTTAAG”为B节段上唯一的Afl II位点；小写黑体标记的序列(a、t、c)为置换的点突变核苷酸。这些突变没有改变B节段上VP1基因的氨基酸编码。以重组质粒pGEM-T-B/HZ2为模板，EV5与B3为引物，使用Pfu聚合酶扩增出573bp的片段。同时对573bp片段和pGEM-T-B/HZ2进行Afl II/Xba I双酶切，用573bp片段替换pGEM-T-B/HZ2的对应部分，得到含有EcoRV标记的B节段重组子pGEM-T-mB/HZ2，并测序证实(图8，pGEM-T-B/HZ2所示为野生病毒B节段相应位置的基因序列；pT-mB所示为突变后B节段相应的基因序列，插入EcoRV酶切位点)。以EcoRI/XbaI/Pvu I酶切pGEM-T-mB/HZ2，回收长片段(2833bp)，与经过EcoRI/XbaI酶切的pCI载体连接，获得pCI-mB/HZ2，并酶切鉴定(图9。M、DNAmaker，1&2、EcoRV/XhoI酶切；结果与预期的完全一致。)。
实施例3本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5基因缺失毒株ANhe2株的获得方法。
按试剂盒说明书，以ConcertTMhigh purity plasmid purification system kit抽提pCI-ANhe2和pCI-mB两种转染级超纯质粒。在脂质体Lipofectamine 2000介导下，以pCI-ANhe2/pCI-mB共转染80％融合度的鸡胚成纤维细胞，同时设仅转染脂质体的对照组。用于转染及相关试验的鸡胚成纤维细胞在6孔板上培养。转染72h后，将各组细胞上清分别模拟病毒感染新鲜细胞，依次“传代”5次。
鸡胚成纤维细胞在转染后24h开始出现病变，并逐渐加剧。继续培养至转染后72h，收获细胞培养物上清液直接感染新鲜细胞，以后以这种方式类似地不断进行细胞培养上清液的“传代”。两个质粒组合在每次“传代”时都出现了细胞病变(CPE，图10A)，这种CPE与正常的IBDV感染培养细胞所产生的CPE极为相似，主要的表现为细胞圆缩，团聚、破裂，折光性增强，颗粒状物质增多；而从第2次传代开始，转染脂质体对照组没有出现类似的CPE(图10B)。以上提示已经拯救出IBDV，并且被拯救的IBDV在鸡胚成纤维细胞上不断复制和传代。
采用间接免疫荧光法检测病毒蛋白表达情况，每个试验组分别以兔抗IBDV血清和兔抗IBDV VP5血清为一抗，FITC标记的羊抗鸡IgG为二抗，检测病毒结构蛋白和非结构蛋白的表达。模拟感染36h后的鸡胚成纤维细胞，以兔抗IBDV抗血清为一抗检测时，可的“传代”细胞中观察到特异性的黄绿色荧光(图11B)；而以兔抗IBDV VP5抗血清检测时，则不能观察到特异性荧光(图11D)。无论是兔抗IBDV血清还是兔抗IBDV VP5血清均能从母本病毒HZ2株感染细胞中检测到特异性的黄绿色荧光(图11A、C)。以任何一种血清为一抗均不能从对照组中观察到特异性荧光(图11E、F)。上述结果提示，VP5蛋白在新构建的转染组合pCI-ANhe2/pCI-mB转染后不被表达。收集细胞培养液超速离心后，弃上清液用TEN溶液重悬浮，磷钨酸负染，在电镜下可以观察到培养物上清液中有直径为55～60nm、无囊膜的病毒粒子存在，这与双RNA病毒科病毒特有的形态特征一致。
尽管在共转染和多次细胞传代过程中没有接触其他IBDV，但为确定这种rIBDV的基因组确实来自pCI-ANhe2和pCI-mB，为此以A5/A3引物对重新扩增出rIBDV的A节段cDNA，以NheI酶切PCR产物验证定点突变引入的分子标记，可检测到预期分子量的条带存在，并测序证实。
把源自pCI-ANhe2/pCI-mB，并在鸡胚成纤维细胞中获救的rIBDV命名为ANhe2株。
实施例4本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5基因缺失毒株ANhe2株的生产方法。
IBDV ANhe2株细胞毒以100μl/胚的量接种11胚龄SPF鸡胚，4天后收集尿囊液，8000rpm离心10min，收集上清。上清以10倍梯度稀释接种长成单层的鸡胚成纤维细胞，从接种后24h开始观察细胞病变情况，直到120h；按Reed-Muench方法计算细胞培养组织半数感染量(TCID50)。结果表明ANhe2株通过SPF鸡胚增殖后，病毒滴度可达105.5TCID50。
所有尿囊液上清通过0.22μm孔径的细菌滤器过滤除菌后，若直接用于接种，则以无菌生理盐水稀释至5×104TCID50/ml浓度。每羽鸡的免疫剂量按5×103TCID50的病毒量计算。最后的接种剂量为100μl/羽。
若除菌后的病毒病毒(尿囊液上清)用于保存，可以直接将尿囊液密封于疫苗瓶中-20℃冷冻保存；如需长期保存，可以对尿囊液进行冷冻干燥后，密封于疫苗瓶中-20℃或-70℃冷冻保存。
实施例5本实施例描述了本发明提供的传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP5基因缺失毒株ANhe2株对雏鸡的安全性和致病性。
(一)基因缺失病毒的安全性和致病性试验共分6组，即ANhe2株病毒四个剂量组(5×102、5×103、5×104和105TCID50/羽)、HZ2株病毒一个剂量组(5×103TCID50/羽)、正常对照组，每组15只鸡，各试验组隔离饲养，专人管理。两种病毒均通过饮水途径接种，10日龄首免，28日龄加强免疫。接种前应停水2小时，以使鸡群产生渴感；接种前72小时和接种后24小时内，在饮用水中不得加入任何药物和消毒剂。免疫后每天观察鸡只的临床反应，并于首免后3天、加强免疫后3天、加强免疫后10天分别扑杀5只，全身、内脏器官检查后，剖取法氏囊，用10％甲醛固定，进行组织病理学检查。
结果见表2(*表示有法氏囊损伤的鸡数量)ANhe2株病毒四个剂量组和母本病毒HZ2株病毒免疫后，连续观察3周，雏鸡临床上均未出现任何不良反应。首次免疫后3天扑杀，经检查，法氏囊、脾脏等均无眼观变化，病理组织学观察表明ANhe2株病毒四个剂量免疫组的所有法氏囊均正常，HZ2免疫组有3只鸡的法氏囊(3/5)出现轻微的损伤。加强免疫后3天扑杀，结果表明所有免疫组的法氏囊均无眼观变化，病理组织学观察表明ANhe2株病毒四个剂量免疫组均正常，而HZ2免疫组有3只鸡(3/5)出现轻微的损伤。加强免疫后10天扑杀，所有试验组鸡法氏囊无病理变化。上述结果说明，ANhe2株病毒对雏鸡尚失了致病性，对雏鸡是安全的，而HZ2弱毒苗对雏鸡还具有一定的毒力。
表2传染性法氏囊病病毒ANhe2株对雏鸡的致病性与安全性试验结果
权利要求
1.一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法，其特征在于，方法的步骤为1)传染性法氏囊病病毒基因组A、B节段RNA的抽提及其cDNA全长的克隆；2)传染性法氏囊病病毒VP5基因缺失的基因组A节段全长序列的获得及A、B节段感染性克隆的构建；3)上述感染性克隆共转染培养细胞，拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒ANhe2株；
2.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法，其特征在于，所述的传染性法氏囊病病毒基因组A、B节段RNA的抽提及其cDNA全长的克隆收集细胞培养的HZ2株传染性法氏囊病病毒，抽提其基因组A、B节段RNA，用长距离精确RT-PCR扩增基因组A、B节段cDNA全长，克隆于pGEM-Teasy，获得重组载体pGEM-T-A/HZ2和pGEM-T-B/HZ2，并进行序列测定。
3.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法，其特征在于，所述的VP5基因缺失的基因组A节段全长序列的获得及A、B节段感染性克隆的构建回收pGEM-T-A/HZ2经NbeI酶切后的长片段并重新自连获得pGEM-T-AN；以上下游突变引物The2SAGATCAGACAAACGATCGCAG和TheAGcTaGcAATGATAGCGTTATAGAAG、TaKaRa MutanBEST Kit进行PCR介导的定点突变，获得3603bp的线性化载体并直接自身连接后，获得含有点突变和片段删除的突变体pGEM-T-The2，并测序证实。将pGEM-T-The2 623bp的EcoRI/NdeI酶切片段与来自于pGEM-T-A/HZ2的2615bp的NdeI/KpnI片段线性连接后，直接插入经EcoRI/KpnI酶切的pCI载体，获得最终用于转染的真核表达质粒pCI-ANhe2，其保藏号为CGMCC No.1507，以重组质粒pGEM-T-B/HZ2为骨架，以EV5CGCCCTTAAGACCGGTCGaTAtcGGAACGAAG和B3ATTTCTMGAGGGGGCCCCCGCAGGCGAA为突变引物，使用Pfu聚合酶扩增出573bp的突变片段，同时对573bp片段和pGEM-T-B/HZ2进行AflII/XbaI双酶切，用573bp片段替换pGEM-T-B/HZ2的对应部分，得到含有EcoRV标记的B节段重组子pGEM-T-mB/HZ2，测序证实后，以EcoRI/XbaI/PvuI酶切pGEM-T-mB/HZ2，回收2833bp片段，与经过EcoRI/XbaI酶切的pCI载体连接，获得用于转染的真核表达质粒pCI-mB/HZ2，其保藏号为CGMCC No.1506。
4.根据权利要求1所述的一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法，其特征在于，所述的将上述感染性克隆共转染培养细胞，拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒ANhe2株在脂质体Lipofectamine 2000介导下，以pCI-ANhe2/pCI-mB共转染80％融合度的鸡胚成纤维细胞，通过细胞病变、模拟病毒传代、分别以兔抗IBDV血清和兔抗IBDV VP5血清为一抗的间接免疫荧光试验、电镜观察病毒粒子，RT-PCR和酶切鉴定等实验证实拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒，将该病毒命名为ANhe2株。
全文摘要
本发明公开了一种传染性法氏囊病病毒无毒力毒株构建方法。方法的步骤为1)传染性法氏囊病病毒基因组A、B节段RNA的抽提及其cDNA全长的克隆；2)VP5基因缺失的基因组A节段全长序列的获得及A、B节段感染性克隆的构建；3)上述感染性克隆共转染培养细胞，拯救出VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒ANhe2株；该方法比传统的细胞传代致弱的方法更加稳定，并有效地保留了病毒的免疫原性。本发明提供了一种VP5基因缺失的传染性法氏囊病病毒(IBDV)ANhe2株，该病毒不表达VP5蛋白，尚失对鸡的致病力的同时，保留了良好的免疫原性，且毒力不返祖。该病毒制备简单、使用方便。ANhe2毒株的其他特性与传统的弱毒疫苗病毒株一致。
文档编号C12N15/79GK1804029SQ200510061550
公开日2006年7月19日 申请日期2005年11月14日 优先权日2005年11月14日
发明者于涟, 李龙, 魏永伟 申请人:浙江大学