含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，该疫苗组合物含有免疫量的重组VP2蛋白和佐剂；该亚单位基因工程疫苗组合物能够有效地防治鸡传染性法氏囊病，该重组抗原蛋白采用的纯化技术显著减少了疫苗组合物中内毒素的含量，明显降低鸡个体的副反应，大大提高了疫苗的安全性。
【专利说明】含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，属于兽药领域。
【背景技术】
[0002]传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(Infectious BursalDiseaseVirus, IBDV)导致的一种高度接触性传染病。以法氏囊肿大、肝脏损伤为主要特征，能引起雏鸡的免疫抑制。该病呈世界性分布，我国也时有发生，造成了严重经济损失。
[0003]鸡传染性法氏囊病活疫苗主要分为传染性法氏囊病囊体组织灭活疫苗和传染性法氏囊病毒细胞培养灭活疫苗；灭活疫苗目前在市场上存在有20多种，包括2512HEP、LZD228、Lukert、228E、D78 及 B2 等。
[0004]IBDV的VP2上至少包含3组抗原表位即中和性抗原表位、非中和性抗原表位及毒力相关性抗原表位，VP2具有血清型特异性位点，并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体，是IBDV的主要保护性抗原基因。动物免疫试验表明，大肠杆菌表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后在抵抗强毒攻击的同时，会伴随着很强的副作用，可能与疫苗中包括大量的大肠杆菌产内毒素有关。而酵母表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后，能够产生特异性抗体，并在一定程度上抵抗超强毒的致死性攻击，但还不能保护法氏囊组织完全不受侵害和损伤，免疫效果尚不如常规灭活疫苗和大肠杆菌产的亚单位疫苗，这可能是与酵母表达的过程中VP2蛋白中的过度糖基化、免疫剂量和佐剂 配比等因素有关。
[0005]随着我国养鸡业的集约化发展，传染性法氏囊病已成为危害养鸡业的一种主要传染病，变异株和超强株的出现，使该病防制的难度加大，目前虽然研制了多种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗，但其安全性和制作工艺尚有不尽人意之处。如为抵抗超强毒的攻击，使用中强毒力的毒株研制活疫苗，给IBD的防制带来极大的隐患；灭活苗存在着抗原制备的困难。因此，亟需免疫原性好、安全性高的新型疫苗问世。用大肠杆菌、酵母、杆状病毒表达IBDV vp2等系统，普遍存在表达量低，副反应大，保护率不高等缺点。用大肠杆菌表达系统研究开发亚单位疫苗和活菌载体疫苗的研究也进行了多年，但已知的研究结果是，大肠杆菌表达IBDVVP2蛋白无免疫原性或形成不溶性包涵体无法用作疫苗。
[0006]Rong J 等人(Jun Rong, Taipin Cheng, Xiaona Liu, Taozhen Jiang, HongGu, Guolin Zou，预防雏鸡传染性法氏囊病的新型重组VP2疫苗，Vaccine 23(2005)4844 -4851)在大肠杆菌中表达出VP2蛋白，请参见图1，蛋白免疫印迹分析重组蛋白，蛋白条带用辣根过氧化物酶标签显色，泳道I和2分别为E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分别为E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物；并证实VP2亚单位疫苗能有效保护鸡受到高致病性传染性法氏囊病病毒的侵袭。然而，现有技术中存在以下两种问题:
[0007]1、现有技术所得到的VP2蛋白多以包涵体形式存在，生产成本高。[0008]2、现有技术纯化后的蛋白中内毒素含量高，会引起严重的负反应。
【发明内容】
[0009]因此，本发明要解决的技术问题是:
[0010]1、减少包涵体的形成，增加VP2蛋白的可溶性表达的量，降低生产成本。
[0011]2、采用新的纯化技术减少VP2蛋白中内毒素的含量，降低负反应。
[0012]本发明的目的在于克服现有技术的不足，将鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA克隆到表达载体中，优化重组蛋白分离、纯化技术，提供一种E.Coli VP2菌种和用所述菌种生产IBD基因工程亚单位疫苗和生产IBD基因工程疫苗的方法及应用。
[0013]本发明首先要解决的技术问题是将鸡传染性法氏囊病病毒VP2cDNA克隆到表达载体中，提供一种适合在大肠杆菌中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2 cDNA。
[0014]本发明提供了一种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列，本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的基因或多肽在保持其功能的范围内，序列号I的核酸序列，序列号2的氨基酸序列可以发生置换、插入或缺失等变异。
[0015]本发明所要解决的第一个技术问题是提供一个含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的大肠杆菌表达载体及含有所述表达载体的大肠杆菌，并能表达SEQ ID NO:2所不氨基酸序列的蛋白质，与Genebank公布的超强毒株VP2基因序列同源性较高。
[0016]本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术途径实现的:
[0017]—种重组大肠杆菌表达载体,含有IBDV VP2基因核苷酸序列。
`[0018]本发明提供了一种重组DNA表达载体，所述DNA表达载体的多克隆位点间包含所述实质上编码含有SEQ.N0.2的DNA序列，所述表达载体包括pCold III表达载体。
[0019]本发明的重组大肠杆菌表达载体可通过本领域的常规方法构建而成，即将IBDVVP2基因插入到大肠杆菌表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使IBDV VP2基因可操作的与大肠杆菌表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将IBDVVP2基因核苷酸序列插入到大肠杆菌表达载体pCold III的多克隆位点之间，使所述核苷酸序列位于冷休克基因(CspA)启动子和lac Z启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达载体。
[0020]本发明所述构建的重组大肠杆菌表达载体可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞类型可为DH5c1、BL21。作为本发明的一个优选的实施方案，优选为将重组大肠杆菌表达载体采用CaCl2转化方法转化BL21 (DE3)大肠杆菌株(E Col1.BL21 (DE3))。
[0021]本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。
[0022]本发明提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述蛋白实质上含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
[0023]本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术途径实现的:
[0024]一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述重组VP2蛋白主要由IBDV VP2基因核苷酸序列所编码。
[0025]本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法。[0026]本发明提供了一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0027]用所述的重组DNA表达载体转化大肠杆菌，诱导所述重组VP2蛋白的表达，回收并纯化表达的所述重组VP2蛋白；
[0028]其中，所述大肠杆菌包括DH5 a、BL21。
[0029]本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种纯化鸡传染性法氏囊病病毒重组抗原蛋白的方法，所述方法能有效地清除重组抗原蛋白中的绝大部分内毒素。
[0030]纯化所述重组抗原蛋白的方法包括以下步骤:
[0031]将表达的所述重组抗原蛋白溶液和终浓度为1%的Triton X-114涡旋振荡；所述溶液混匀后在冰上放置5分钟，冷却后，所述溶液立即放入37°C水浴中温浴5min，使得所述溶液产生新的两相；然后所述溶液在37°C离心60s ;离心过后，吸取所述溶液上部水相，使用所述水相再次用Triton X-114提纯,整个操作循环3次。
[0032]本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中内毒素含量为l(Tl00EU/ml。
[0033]优选地，所述鸡传染性法氏囊病毒亚单位抗原为免疫量的重组VP2蛋白，所述疫苗组合物包括佐剂；更优选地，所述的重组VP2蛋白AGP抗原效价在1:8-1:64之间，所述佐剂为油佐剂。
[0034]本发明提供的所述的亚单位基因工程疫苗组合物可进一步包含其他抗原，所述抗原包括鸡新城疫抗原、鸡传染性支气管炎抗原。
[0035]本发明所述重组VP2蛋白可按照本领域常规的方法制备成蛋白亚单位基因工程疫苗。`
[0036]本发明提供了一种制备含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物的方法，用PBS磷酸盐缓冲液将所述重组VP2蛋白溶液稀释至600 μ g/mL,然后将所述重组蛋白溶液与佐剂按1:2的比例混匀，乳化。
[0037]本发明提供了一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物预防和治疗鸡传染性法氏囊病的应用。
[0038]本发明提供的所述的亚单位抗原的疫苗组合物能够有效地防治鸡传染性法氏囊病，并显著减少了疫苗组合物中内毒素的含量，明显降低鸡个体的副反应，大大提高了疫苗的安全性。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为现有技术中重组VP2的Western-blotting分析；
[0040]图2为内毒素检测标准曲线图；
[0041]图3为Triton X-114清除粗提VP2蛋白中内毒素效果图；
[0042]图4为IBDV-VP2基因工程亚单位疫苗对鸡的体重增加的影响；
[0043]图5为内毒素清除与否对实验动物的体重增加的影响；
[0044]图6为IBDV-VP2基因工程亚单位疫苗与其它疫苗联合使用对鸡只体重增长的影响。
[0045]附图标记[0046]图1蛋白免疫印迹分析重组蛋白，蛋白条带用辣根过氧化物酶标签显色，泳道I和2分别为E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分别为E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物。
【具体实施方式】
[0047]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0048]实施例1:pCold III _IBDV_VP2表达体系的构建
[0049]1、实验材料
[0050]质粒提取试剂盒购自天根生物；T4 DNA Ligase购自BioLab ;EcoRl、Sail限制性内切酶、pCold III _DH5 α菌株购自TaKaRa ;琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。
[0051]2、实验步骤
[0052]2.1VP2 cDNA 制备
[0053]2.1.1 总 RNA 的提取
[0054]总RNA简要过程 如下:将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒LQ9株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200 μ L病料补加TE (IOmM Tris, ImM EDTA，ρΗ8.0)至500 μ L，加入5yL蛋白酶K和10% (W/V)十二烷基磺酸钠(SDS)50 μ L，56°C水浴3小时。加入等体积苯酚/氯仿(1: 1，V/V)抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一 1.5mL离心管，加入1/10体积的NaAc (3M, pH5.2)、等体积异丙醇，_20°C沉淀2小时。4°C、10000转/分离心15分钟，用75%乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水0.5ml重新溶解。
[0055]2.1.2 VP2 cDNA 制备
[0056]根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下:
[0057]VP2-EcoRl-f:CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC
[0058]VP2-Sall-r:ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT
[0059]2.2含酶切位点的VP2片段扩增
[0060]对上述制备的VP2 cDNA进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20°C保存。
[0061]2.3pCold III质粒 EcoRl、Sall 双酶切
[0062]利用EcoRl、Sail对pCold III质粒进行双酶切，形成具有粘性末端的连接片段，反
应体系如下:
[0063]
【权利要求】
1.一种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
2.—种重组DNA表达载体，所述DNA表达载体的多克隆位点间包含如权利要求1所述的DNA序列,所述质粒包括pCold III质粒。
3.一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述蛋白实质上含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。
4.一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: 用如权利要求2所述的重组DNA表达载体转化大肠杆菌，诱导所述重组VP2蛋白的表达，回收并纯化表达的所述重组VP2蛋白； 其中，所述大肠杆菌包括DH5 a、BL21。
5.一种纯化鸡传染性法氏囊病病毒重组抗原蛋白的方法，所述方法包括以下步骤: 将表达的所述重组抗原蛋白溶液和终浓度为1%的Triton X-114涡旋振荡；所述溶液混匀后在冰上放置5分钟，冷却后，所述溶液立即放入37°C水浴中温浴5min，使得所述溶液产生新的两相；然后所述溶液在37°C离心60s ;离心过后，吸取所述溶液上部水相，使用所述水相再次用Triton X-114提纯，整个操作循环3次。
6.一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中内毒素含量为10~100EU/ml。
7.如权利要求6所述的疫苗组合物，其中，所述鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原为免疫量的的重组VP2蛋白，·所述疫苗组合物包括佐剂；优选地，所述的重组VP2蛋白AGP抗原效价在1:8-1:64之间，所述佐剂为油佐剂。
8.如权利要求6所述的疫苗组合物，所述疫苗组合物进一步包含其他抗原，所述抗原包括鸡新城疫抗原、鸡传染性支气管炎抗原。
9.一种制备如权利要求7所述的疫苗组合物的方法，用PBS磷酸盐缓冲液将所述重组VP2蛋白溶液稀释至600 μ g/mL，然后将所述重组蛋白溶液与佐剂按1:2的比例混匀，乳化。
10.权利要求6~7任一项所述的疫苗组合物在预防和治疗鸡传染性法氏囊病的应用。
【文档编号】A61P31/14GK103849631SQ201210494909
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月28日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司