对免疫系统分子进行人源化的方法

专利名称：对免疫系统分子进行人源化的方法
技术领域：
本发明涉及制造人源化免疫系统分子的方法。本发明一方面提供对抗体进行人化的方法，其涉及使个别抗体构架区之间(而不在于使较大构架区或可变区之间)的序列相似性最优化。本发明有许多用途，包括用于生产具有合适结合亲合性并且人类免疫原性最小化的人源化单克隆抗体。
背景技术：
现已普遍认识到抗体有重要用途。例如许多抗体已知可以良好特异性检测抗原。已有文献报告多克隆及单克隆抗体。一般参见MolecularBiology of the Cell(B.Alberts等人编辑，第二版)(1989)GarlandPublishing，Inc.New York及其中引用的参考文献。
过去对探讨抗体结构及功能有相当大的兴趣。例如对可变(V)区的结构与功能已有很多了解。几乎所有抗体V区均包括高变的互补性决定区(“CDRs”)及构架区(“FRs”)。对大多数抗体分子而言，单一CDR与另一个CDR之间被间插的FR所隔开。现已普遍认识到FRs充当分子骨架，有助于将CDR环定位在适当构象中，供抗原识别与结合。一般参见上述B.Alberts等人的文献及其中引用的文献。
许多研究者使用“构架”来说明来自单一抗体轻链可变区(VL)或重链可变区(VH)的完整FRs。因此，一个抗体V区包括构架区亚群(FR1、FR2、FR3与FR4)，其中各亚群连接其相应的CDR(CDR1、CDR2与CDR3)。构架由来自单一抗体的整个构架区亚群组成。
至少有些抗体的FRs的氨基酸残基被认为有助于抗原结合。参见Foote，J.and G.Winter(1992)J.Mol.Biol.224487。
已有人尝试使用单克隆抗体作为治疗剂。然而，此方法却受到至少某些抗体的挑战。例如已报导有些人类个体在暴露于衍生自非人类来源的抗体之后发展出不期望的免疫副反应。在有些情形下，这些反应可能引起严重健康问题，并且可能危及生命。
有人尝试制造对人类个体而言在免疫上更能接受的抗体。尽管已有一些人类单克隆抗体的报导，但普遍认为这样的分子很难制造和使用。
另一种制造人类较能接受的抗体的方法是将编码人类抗体的基因引入非人类动物(例如小鼠)。已有报告指出这样的“转基因”动物可产生具有人类序列的抗体。然而，这样的动物通常很难制造，并且耗费时间。此外，这样的转基因小鼠享有产权，而且所拥有的人类抗体基因库仍不够多。
另一个制造免疫上可接受的抗体的方法是使用重组DNA技术。一个观念是克隆并修饰非人类抗体，以产生类似人类抗体的分子。这样的抗体总称为“人源化的”。参见美国专利案Nos.5,766,886(授予Studnicka等人)、5,693,762(授予Queen等人)、5,985,279(授予Waldeman等人)、5,225,539(授予Winter)、5,639,641(授予Pedersen等人)及其中引用的参考文献。
已有人提出几种使抗体人源化的具体方法。
其中一种方法涉及制备被描述成嵌合抗体分子的分子。典型作法是使用抗原免疫非人类动物，如小鼠。然后采用常规技术，由该动物制造单克隆抗体。采用常规聚合酶链反应(PCR)扩增法生成编码该单克隆抗体的基因。编码鼠抗体可变区的分离序列经标准重组DNA技术与编码人类抗体恒定区的序列进行基因融合。此方法已用于制造人类-小鼠嵌合抗体。参见例如S.L.Morrison和V.Oi(1989)Adv.Immunol.4465。
可惜仍有些报告指出有些嵌合抗体的制造及使用存在问题。具体而言，有文献公开该抗体对人体给药后会出现无法接受的免疫反应。循环半寿期短也被认为至少是有些嵌合抗体的问题。参见例如Boulianne等人的Nature312643(1984)；Junghans等人的CancerRes.501495(1990)and Bruggemann等人(1989)J.Exp.Med.1702153。
其他制造人源化抗体的方法已有报导。
其中一种方法称为“CDR移植法”(有时称为“构架移植”或“抗体重塑”)。CDR移植法涉及将鼠CDRs插入人类V区中。然后用该鼠CDRs替代相应的人类CDRs。参见E.Padlan，Mol.Jmmunol.28489(1991)。通常，V区内的所有FRs均衍生自单种人类抗体。所属领域中的有些人预测构架的人类FRs将会使鼠CDRs正确定位而结合抗原。预计这样的抗体应可避免被人类免疫系统所识别。参见例如Jones等人，Nature 321522-525(1986)；如上述Junghas等人的文献。
然而，使用许多CDR移植技术也有问题。
例如，有些“移植”抗体具有无法接受的抗原结合性质。参见Gorman等人，PNAS(USA)884181(1991)。改善抗原结合性的尝试通常是再将鼠残基加回到CDR移植的V区中，但并非总能成功。参见Queen等人，PNAS(USA)8610029(1989)；及Co等人，PNAS(USA)882869(1991)。
也有人尝试采用所谓“抗体表面重塑”的方法制造人源化抗体。其中一种方法是以经常出现在宿主抗体中的氨基酸残基置换同种异基因抗体上的暴露氨基酸残基。此作法希望可以降低抗体的免疫原性，同时尽可能保留抗原结合功能。参见Roguska等人，PNAS(USA)91969(1994)。
可惜多种这样的现有抗体重塑技术的使用仍有问题。
例如，许多重塑抗体具有无法接受的抗原结合性质。参见E.Padlan，Mol.Immunol.28489(1991)。此外，大多数重塑技术需要详细了解所要重塑的抗体的结构。通常需要有关溶剂可及性及相关参数的详细信息。然而，对于需要人源化的抗体并非总能得到这样的信息。
大多数抗体人源化技术共同的主要缺陷是对于需要人源化的所需抗体而言，需选用相当大的构架或V区来进行移植或重塑操作。使用这样的大型抗体区段作为加工非人类抗体的基础产生了不期望的结果，例如降低了抗原结合亲合性及保留了无法接受的免疫原性。为了克服这样的缺点，需进一步努力以恢复亲合性。这样的努力通常最终是在添加足量的非人类氨基酸残基来增强亲合性与避免添加太多氨基酸而使免疫原性提高之间取得妥协。
更具体而言，据信许多已有的人源化技术涉及使用无法接受的大型抗体构架、或更糟糕地使用整个V区进行操作，使抗体人源化。根据其中一种方法，使用大型非人类构架或V区作为参考物，鉴别出与该参考物具有可接受的序列同一性的一组人类构架。所鉴别出来的人类构架若与参考的非人类序列在所使用的检索参数方面具有最高序列同一性时，则常常被称为“最佳匹配(best-fit)”。
据信过去依据与相当大的构架或V区进行比较来选择最佳匹配的人类构架的作法已阻碍了许多人源化免疫系统分子的制造与使用。例如，据信采用过去的抗体人源化法已错失了许多有可能的“最佳匹配”类型。也就是说，将“最佳匹配”符合物群局限于构架或V区时，已降低了对许多抗体进行人源化的能力。
此外，许多制造人源化抗体的现有技术采用完整抗体序列搜索“最佳匹配”符合物。然而，此方法有严重缺点。
例如，这样的搜索法无法包括来自测序不完整的人类抗体的FR序列。此缺点导致很难利用更为完整的人类抗体序列信息库。
制造人源化抗体的现有方法据认为仍有其他缺陷。
例如，已知许多人源化抗体不具有最佳抗原结合亲合性。与人类FRs相邻的非人类CDRs的氨基酸和FRs中关键位置上的氨基酸残基(称为微调区残基)之间的立体阻碍(有时称为干扰性)被认为是其原因。由于据信现有技术的人源化法会错失许多潜在的“最佳匹配”人类FR序列，解决这些及其相关干扰问题的能力也受到限制。
若能有使免疫系统分子人源化的更有效方法将会很有用。更明确而言，若有制备人源化抗体的方法将是十分有益的，所述方法包括使作为制备具有合适结合亲和性并且人类免疫原性减至最低的人源化免疫系统分子基础的各构架亚群之间的序列相似性最佳化。

发明内容
本发明涉及使免疫系统分子人源化的有效和有用的方法。本发明一方面提供了制造人源化抗体及其片段的方法，其中使个别构架区亚群(FRs)之间的序列相似性最佳化。可避免较大抗体构架及/或可变区之间的比较，选择出的“最佳匹配”人类FRs用于制造人源化免疫系统分子。本发明有多种重要用途，包括用于制造具有合适抗原亲合性、且人类免疫原性最小化的人源化免疫球蛋白。
我们已发现一种使多种免疫系统分子(例如抗体及其抗原结合性片段)进行“人源化”的新方法。该方法通常涉及在至少一个非人类FR亚群与至少一个相应的人类FR之间的序列相似性最适化。通常对1、2或3个非人类FRs，更优选为对所有四个FRs(亦即FR1、FR2、FR3与FR4)进行序列相似性的最佳化。可通过配合使用目的，根据需要而一次针对一种(例如连续FRs，如FR1与FR2)或一次针对多种(例如所有四种FRs)FR而对序列相似性进行最适化。选择出与相应的非人类FR亚群具有最高序列相似性的一种或多种鉴定出的人类FR亚群，供进一步操作。供选择的人类FR亚群经常称之为与所比较的非人类FR亚群“最佳匹配”。本发明的实施还包括用至少一个“最佳匹配”的人类FR亚群替代至少一个相应的非人类FR亚群。因此，本发明的优选用途是使至少一种、最好是所有个别人类与非人类FR亚群之间的序列相似性最大化。避免了在构架群(亦即所有FR1、FR2、FR3与FR4)及整个可变区水平进行序列相似性的最优化。所选出的最佳匹配的人类FR亚群随后用作装配本文所公开的人源化免疫系统分子的成分。
本发明提供许多重要优点。
例如，先前技术实践经常依据整个构架群或抗体可变区之间的相似性来检测最佳匹配人类构架(亦即FR1-4)。据信此方法阻碍了人源化免疫球蛋白的制造及使用，例如导致缺乏FR选择灵敏性。此外，错失了各人类FRs之间的许多最佳匹配符合物。
更具体地说，据信现有人源化法严重地限制最佳匹配可能性的数量。反之，本发明的实施并不如此受限。也就是说，本发明的最佳用法涉及在FR亚群水平鉴别序列相似性并使之最大化。更可避免更大型构架群和/或抗体可变区之间的较不敏感的序列比较。本发明所提供的这些及其相关优点均可扩大最佳匹配可能性的数量，通常是所要人源化的免疫系统分子上FR亚群数目的算术阶乘。本发明的这一性质大幅度加强了制造及使用人源化分子的机会，有助于降低与人源化法有关的成本，并提供了装配近乎任何所需人源化免疫系统分子的合理基础。
例如，本发明可用于使所需非人类抗体人源化。此实例中，进行序列比较的可供利用的人类FR亚群库是各重链和轻链上其序列信息可供利用(也包括来自不完整的可变区序列的FR序列信息)的四个构架亚群(FR1、FR2、FR3与FR4)各自的算术阶乘。关键性的结果是库大小增加至少约4倍。有些实施方案中，因为可从不完整的V区序列取得最佳匹配FRs，库的大小甚至会更大。这显然优于现有技术方法，因为这样扩大了可供选择所用的库的大小。由此增加了潜在最佳匹配人类FR的可能性。因此，根据本发明检测到最佳匹配的人类FR亚群的机会高于过去曾使用的方法。
本发明的实施可提供其他重要优点。
如上述讨论，本发明的一个目的是针对所要人源化的各非人类FR亚群进行最适化并选择最佳匹配的符合物。不同于过去的方法，本方法基本上独立于目标免疫系统分子内的其他FRs而进行。因此，采用本发明方法可大幅降低错配氨基酸数量(如果存在的话)。过去的方法经常受到可供利用的已完全测序的人类抗体及可变区库的限制，与此不同，使用本发明方法可以有新的机会选择出最佳匹配的人类FR亚群。本发明更有可能检测到最佳匹配人类FRs，其与相应的非人类FR相比没有或很少有错配。本发明的实施因此可增加制造及使用多种免疫系统分子的机会。重要的是，这样的方法可用于制备比亲代的非人类或由其制得的嵌合性分子更大幅保留了抗原结合亲合性的人源化抗体及其片段。
因此，本发明一方面提供一种制造人源化抗体可变(V)区或其片段的方法。优选的片段可以单独地或与其相应的V区结合伙伴或片段相结合地特异性结合抗原。大多数实施方案中，本方法包括下列至少一个步骤，最好包括下列所有步骤。
通常，将所需非人类抗体FR亚群的至少一个氨基酸序列，优选4种以下的这种FRs，更优选约一种FR，例如FR1或FR2，与相应的人类氨基酸抗体或可变区序列或其片段的集合库比较。大多数例子中，使用相应的人类抗体构架氨基酸序列集合进行比较，但其他集合也可用于一些用途，包括部分构架序列集合。从与相应非人类FR亚群具有最佳匹配性的集合库中选择出相应的人类FR亚群。一般而言，合适的最佳匹配人类FR亚群与相应的非人类FR亚群比较时，将具有至少约75％序列同一性，优选至少约80％序列同一性，更优选至少约90％直至约100％序列同一性。
随后，将该非人类FR亚群诱变成基本上编码上述最佳匹配的人类FR亚群。可依下文所述，采用一种标准诱变法或其组合。最好进行非人类FR亚群的诱变法来制造人源化FR亚群(有时称为“huFR”，其实质上与所选择的人类FR亚群相同，即与所选择的亚群至少约75％相同，优选至少约80％相同，更优选至少约90％相同直至约100％相同。
若必要时可以重复本发明的现有人源化步骤，使非人类V区的一个或多个所需FR亚群人源化。更具体地，可重复该步骤一次、两次、三次或甚至更多次，这些步骤在可产生多数DNA序列的条件下进行，其中各DNA序列编码相应的huFR亚群。大多数例子中(例如当需要完全人源化免疫系统分子时)，重复该步骤约三至四次，以使各FR亚群(FR1、FR2、FR3与FR4)人源化会比较有用。因此，在需要非人类抗体具体实施方案中，将对各免疫球蛋白轻链与重链上的各FR亚群进行上述人源化步骤。
本发明的成功实施不需依赖非人类FRs人源化的任何具体顺序，只要可达到所需结果即可。
然后，采用标准重组法，将一种编码huFR亚群的DNA序列或其组合取代进入合适的(第一)载体中。优选地，该第一载体至少编码所要人源化的非人类抗体的V区。然而，有些实施方案中，第一载体还编码共价连接到V区上的免疫球蛋白轻链或重链恒定区或其片段。
优选的取代步骤通常在其中使用至少一种、优选地所有huFR DNA序列置换由该载体编码的一个或多个相应非人类FR亚群的条件下进行。FR取代的顺序通常并不重要，只要产生所需的人源化分子即可。因此，例如可先对非人类FR1进行人源化，再对非人类FR2进行人源化。或者，可先对非人类FR2进行人源化，然后对非人类FR1人源化。优选取代步骤依据一般操作法进行，所产生的各huFR亚群与一个或多个相应的互补性决定区(CDR)操纵性连接。
第一载体可用于在下文中将讨论的多种合适宿主细胞中表达一种或多种所编码的人源化免疫系统分子。一般优选的方法有助于在宿主细胞中表达人源化抗体V区或其片段。此外，优选方法可与计划用于自同时存在的细胞成分中纯化出人源化分子的方法完全相容。
本发明与多种重组法完全相容，该重组法将指定的非人类FR亚群上的每个错配位置上的非人类氨基酸转化成所需的人类氨基酸。一个可接受的重组法实例为定点诱变法或相关的基于PCR的方法。由于根据本发明，潜在的最佳匹配人类FR亚群库更大，因此鉴定出错配较少的人类FR亚群的机率较高。本发明的这一特定有助于降低在对特定免疫系统分子人源化时所必需考虑的FR错配数。这样的及其他本发明优点有助于比许多现有人源化法更节省成本与时间。
如上述讨论，大多数先前技术的人源化法因所得分子的无法接受的抗原结合性而受到阻碍。更具体地说，大多数先前技术的人源化抗体对关联抗原的亲合性远低于亲代分子。许多亲代嵌合抗体的抗原结合特性则优于抗体的人源化形式。在不希望受到理论限制下，推测这种无法接受的抗原结合性大部份可归因于邻近CDRs(游标区残基)的FR亚群中一个或多个氨基酸所产生的遮蔽性。有报告指出，至少有些抗体的游标区残基可参与抗体V区的抗原结合。
过去曾尝试尽量降低游标区遮蔽问题，但大多没有成功或需要更复杂的电脑算法来校正且极依赖基于计算机的分子建模与结构知识。
例如，其中一种方法采用电脑协助的建模软件来帮助降低遮蔽性。这样的软件通常很复杂且很难使用。本发明解决此问题的方法并不借助复杂的软件即可使最佳匹配huFR亚群的检测和选择最佳化。亦即本发明提供更多的最佳匹配候选物，由此降低待人源化的免疫系统分子中游标区和任何其他位置出现错配的机会。因此，使用本发明可以显著维持亲代免疫系统分子的抗原结合亲合性。当所需的非人类抗体对抗原具有不寻常的高亲合性(Kd＞10-9M或以上)时，本发明的优势特别重要。在这样的情况下，高亲合性通常要求CDR保持在适当构象。本发明通过尽量降低或消除游标区的潜在不相容性来满足这样的要求。过去曾使用基于X-射线结晶学或计算机的抗体信息来协助解决游标区不相容性。本发明可显著降低、许多情况下甚至可避免使用者对这样的资料的依赖性。
下文中讨论本发明其他方面。


部分图1A与1B显示H36D2.B7(鼠抗组织因子抗体)的轻链与重链可变区的核酸(SEQ ID NOS1与3)和氨基酸(SEQ ID NOS2与4)序列，其中超变区(CDRs或互补性决定区)以下划线表示(单下划线指核酸序列，双下划线指氨基酸序列)。
图2是人源化抗-TF IgG1抗体表达载体的质粒图谱(pSUN-34)。
图3A至3D是抗-TF抗体的部分与完全人源化轻链(LC)可变区的序列(SEQ ID NO72-82)。图3A显示称为“LC-09”、代表完全人源化LC构架的序列(SEQ ID NO79)。cH36与LC-09的轻链CDR序列示于第3B至3D(分别为SEQ ID NOS.103、6和7)中。
图4A至4D显示抗-TF抗体的部分与完全人源化重链(HC)可变区的序列(SEQ ID NOS.83-96)。图4A显示称为“HC-08”，代表完全人源化HC构架的序列(SEQ ID NO.91)。cH36与HC-08的重链CDR序列示于图4B至4D(分别为SEQ ID NOS.104，104，9，101，10和10)中。
图5A及5B显示IgG1抗-组织因子抗体(hOAT)的人类恒定区的序列，图5A显示人类κ轻链恒定区(SEQ ID NO97)，图5B显示人类IgG1重链恒定区(SEQ ID NO98)。这些图中显示了hOAT(IgG1)恒定区氨基酸序列。
图6A及6B显示了IgG4抗-组织因子抗体(hFAT)的人类恒定区的序列。图6A显示人类κ轻链恒定区(SEQ ID NO99)，图6B显示人类IgG4重链恒定区(SEQ ID NO100)。
图7A与7B显示A110(嵌合抗-LTA抗体)的轻链与重链可变区的核酸(SEQ ID NOS.105和107)与氨基酸(SEQ ID NOS106和108)序列，超变区(CDRs或互补性决定区)以下划线表示(单下划线指核酸序列，双下划线指氨基酸序列)。
图8显示编码人源化抗-LTA IgG1的表达载体的质粒图谱(pJRS391) 。
图9A至9H显示了抗-LTA抗体的部分与完全人源化的可变区的序列。图9A显示人源化轻链(LC)可变区构架区的序列(分别为SEQ IDNOS.109-114)。图9B至9D显示轻链CDRs1-3(分别为SEQ IDNOS.115-117)。图9E显示部分与完全人源化的重链(HC)可变区构架区的序列(分别为SEQ ID NOS.118-123)。图9F至9K显示重链CDRs1-3(分别为SEQ ID NOS.124-126)。
图10是显示生产人源化A110抗体的质粒构建体的分析表。
图11显示不同源粒表达人源化抗-LTA抗体的结果。
图12显示LTA结合测定的结果。
发明详述如上述讨论，本发明涉及制造人源化免疫系统分子的方法。这样的分子的实例包括人源化抗体可变(V)区、人源化抗体(嵌合及单克隆)及其抗原结合片段。例如，本发明提供了使抗体人源化的新方法，其涉及使至少一种非人类构架(FR)亚群(典型地指其中2、3或4种亚群)与一种或多种相应的人类FR亚群之间的序列相似性最佳化。用至少一种选择的人源化FR亚群(huFR)替代相应的非人类FR亚群，以使该分子人源化。本发明的优选人源化免疫系统分子的特色为于人体中具有良好抗原结合亲合性与最小化的免疫原性。
使用本发明对免疫系统分子进行人源化的优点可由下文中包括实施例6-9的公开内容证实。如上述讨论，过去的人源化法与本发明的关键差异在于本发明方法搜索最佳匹配的FRs。相比之下，先前技术的方法则采用整个构架(通常来自单一抗体可变区)，或更糟糕地采用整个可变区来确定最佳匹配性。因此，对于每一抗体链，利用本发明所鉴定的FRs可来自多达四种不同的抗体，或每种抗体总共有8种FRs。本发明的这一特点大幅增加了可供利用的可检测最佳匹配FRs库。这种在搜索最佳匹配的FRs方面的弹性使搜索过程受到的限制减少，因此可分析较多的FRs。这样的有利点有助于在需要进行较少的氨基酸取代作用、较少地改变游标残基与较好的同源性或同一性分数下即可达到更好的匹配性。在搜索具有最佳匹配的整个构架时，其结果是整个构架的折衷最佳匹配性。有些实例中，两条链的整个构架来自在一种抗体，或在限制范围较小的搜索中，各链的构架可来自不同抗体。
更具体地，下文中实例6提供了过去对抗-TAC抗体人源化的尝试与本发明方法(本文中有时称为“FR最佳匹配人源化法”)的电脑(insilico)比较结果。如本实例所示，采用本发明可提供优越的人源化结果。也就是说，根据本发明的抗-TAC抗体的实质人源化可产生更好的抗体。
采用本发明的其他优点可从实例7(Mc3抗体)、实例8(抗-TF抗体)和实例9(抗-LTA抗体)所示的电脑比较结果了解。当与先前技术的人源化法比较时，这些实例(包括实例6)中，上述抗体的实质人源化结果产生了极佳的人源化抗体。因此，本发明的一种一般用途是用于制造及使用多种人源化免疫系统分子。
如上述讨论，本发明可用于对多种免疫系统分子(如抗体与其片段)进行人源化。可采用特定的本发明方法来制造人源化抗体可变(V)区或其抗原结合性片段。如上所述，优选的片段特异性结合抗原，通常是与相应的V区结合伙伴或片段相组合实现的。在一个实施方案中，该方法包括至少一个下述步骤，优选所有步骤
a)将非人类抗体可变(V)区的构架区(FR)亚群的氨基酸序列与人类抗体构架或可变区氨基酸序列或其片段的序列集合库进行比较，b)自集合库中选择出与该非人类FR亚群的氨基酸序列具有最大同一性的人类FR亚群，c)对非人类FR亚群的DNA进行诱变，以编码具有与步骤b)所选择出的人类FR亚群实质上相同的氨基酸序列的人源化FR亚群，d)对非人类V区中的各FR亚群重复步骤a)至c)，以制造许多DNA序列，其中各DNA序列编码一种人源化FR亚群(huFR)，及e)在至少编码该非人抗体的V区的第一载体内，用来自步骤d)的各huFR DNA序列取代该载体所编码的相应非人类FR亚群；其中该取代作用将各huFRs操纵性连接其相应的互补性决定区(CDR)；和在有助于制造人源化抗体V区、完整抗体或其抗原结合性片段的条件下在宿主细胞中表达该第一载体。
待人源化的V区或抗原结合性片段将包括至少一个鼠互补性决定区(CDR)。能理解的是，免疫球蛋白轻链与重链共有某些结构相似性，例如，各包括四个构架区亚群(FR1-4)的构架，其序列相对保守。FR1-4中每个(FR1、FR2、FR3、FR4)通过三个CDRs(亦即CDR1、CDR2、CDR3)共价连接。现已普遍认识到四种FR主要呈β-折叠片构象，而中间连接的CDRs则形成连接环，在有些情况下则形成β-折叠片结构的部分。大多数CDRs密切邻近FRs，并且与来自相反的轻链或重链的相应CDR一起有助于形成抗原结合位点。已公开了许多种CDRs与FRs。参见例如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest FifthEdition，U.S.Dept.of Health and Human Services，U.S.GovernmentPrinting Office(1991)NIH Publication No.91-3242。
还可参见EP-A-0239400与美国专利No.5,985,279(其描述了制造改变了的抗体的方法，其中CDRs衍生自与FR不同的物种)。
“抗原结合性片段”一词指特异性结合抗原的至少一部份抗体。这样的片段的实例包括抗体V区及其V区结合伙伴。其他合适片段还包括V区的部份，该V区与V区结合伙伴的组合分子量在约15kD至约40kD之间，优选在约20kD至约30kD之间，更优选约25kD，该分子量是采用多种标准方法测定的，包括使用适当大小的标记物片段进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法或分子筛析层析法，质谱仪测定或氨基酸序列分析法。
此外，合适的抗原结合性片段包括仅抗原结合性V区的至少部分或与关联恒定(C)区或其片段组合(“关联”用于表示同一个免疫球蛋白重(H)或轻(L)链的两种成分之间的相关性)。典型的C区片段的分子量在约5kD至约50kD之间，更优选为约10kD至约40kD之间，该分子量是采用多种标准方法测定的，包括使用适当大小的标记物片段进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法或分子筛析层析法，质谱仪测定或氨基酸序列分析法。下文将公开其他合适的抗原结合性片段。
“特异性结合”或类似术语指本文所公开的分子与另一分子结合，由此形成特异性结合对。然而，该分子并不识别或结合其它分子，此结果可由例如Western blotting ELISA、RIA、迁移率漂移分析法(mobilityshift assay)、酶免疫分析法、竞争性分析法、饱和分析法或本领域中已知的其他蛋白质结合性分析法测得。一般参见Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratoly Manual(2ded.1989)；与Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，1989。有关检测分子之间的专一结合性的方法实例参见Harlow与Lane，AntibodiesALaboratory Manual(1988)Cold SpringHarbor，New York。
“人源化”一词指免疫球蛋白中包括至少一个人类FR亚群，优选至少两个或三个，更优选四个人类FR亚群，以及非人类来源的一个或多个CDRs，通常为啮齿类如大鼠或小鼠免疫球蛋白。典型地，本发明优选的人源化免疫球蛋白包括两个或多个CDR，优选三个CDRs。恒定区不一定存在，但经常有助于协助人源化抗体在体内的预期功能。若存在的话，优选的恒定区与人类免疫球蛋白恒定区实质性相同，亦即在氨基酸序列方面至少约90％相同，优选至少约95％或更高水平相同。因此，除了CDRs可能例外以外，人源化免疫球蛋白的几乎所有部分最好与天然人类免疫球蛋白序列的相应部分实质上相同。
测定氨基酸序列同一性的方法是相关领域内的标准方法，包括目视检查及采用BLAST与FASTA(可自National Library of Medicine(USA)网站取得)、由电脑协助的方法。大多数具体实施方案的优选匹配程序可自国际ImMunoGeneTics(IMGT)数据库网站获得，此具体实施方案的更优选匹配程序是称为Match的程序，其可自Kabat数据库取得，参见Johnson G，WuT.“Kabat database and its applicationFuturedirections，”Nucleic Acids Res.(2001)29205-206。
“人源化抗体”一词指包括人源化轻链与人源化重链免疫球蛋白的抗体。参见上述S.L.Morrison；上述Oi等人的文献；上述Teng等人的文献；上述Kozbor等人的文献；上述Olsson等人的文献；以及前面引用的其他参考文献。因此，“人源化抗体片段”指该抗体的一部份，优选为可特异性结合抗原的部分。
如上述讨论，本发明包括将各非人类FR的氨基酸序列与人类氨基酸序列集合、优选包括人类抗体构架氨基酸序列的序列集合进行比较并使之最优化的一个或多个方法步骤。操作时，序列同一性分数最高的人类构架FR为相应于该非人类抗体FR的FR，但搜索参数并不要求此点。“相应”一词指来自抗体V区上相同或类似位置的两种FRs之间的关系。例如，来自特定抗体轻链的啮齿类FR1相应于来自该轻链的人类FR1。相应关系通常由FR编号表示，亦即啮齿类FR1相应于人类FR1，啮齿类FR2相应于人类FR2，等等。
在本方法的一个具体实施方案中，上述V区或片段来自非人类抗体轻链。如上述讨论，FR亚群人源化的确切顺序通常并不重要。因此，在本发明一个实施例中，本方法步骤a)的轻链FR亚群将为第一个可变区构架区(FR1)。然而，在其他实施方案中，其他FR亚群将在FR1之前人源化，例如FR2、FR3或FR4。
如上述讨论，本方法的步骤b)涉及自许多人类氨基酸序列中选择出与该非人类FR亚群具有最大氨基酸序列同一性的人类FR亚群。在所要人源化的非人类构架为FR1的实施方案中，非人类抗体轻链的FR1与所选择的人类FR亚群之间的序列同一性优选为至少约70％，更优选至少约80％，甚至更优选至少约95％。
亦如上述讨论，本发明的具体方法涉及反复(通常是依次)进行各非人类构架区的人源化。因此，在首先操作FR1的实施方案中，该方法包括随后操作FR2、FR3与FR4。如上述，对FRs人源化的确切顺序并不重要，但以方便性而言，按数字顺序进行轻链与重链构架的人源化，亦即FR1、FR2、FR3与FR4，可能较有利。
因此，在本发明的一个具体实施方案中，本方法的步骤d)还包括将非人类轻链(或重链)V区的第二个非人类构架区(FR2)与集合库的序列进行比较，并选择出与其人类FR亚群(实际情况下，这通常是人类FR2)具有至少约70％序列同一性，优选至少约80％，更优选至少约95％序列同一性的人类FR亚群。本方法的步骤d)还包括将非人类轻链(或重链)V区的第三个构架区(FR3)与集合库进行比较，并选择出与其人类FR亚群(实际情况下，这通常指人类FR3)具有至少约70％序列同一性、优选至少约80％、更优选至少约95％序列同一性的人类构架区。典型地，本方法的步骤d)包括将非人类轻链(或重链)V区的第四个构架区(FR4)与集合库进行比较，并选择出与其相应的人类构架亚群(实际情况下，这通常指人类FR4)具有至少约70％序列同一性、优选至少约80％、更优选至少约95％序列同一性的人类构架区。
由本文公开内容可了解的是，本发明可用于对多种免疫系统分子进行人源化，包括任何杂二聚体免疫球蛋白样分子的轻链V区、重链V区，包括(但不限于)T-细胞受体、主要组织相容性复合物、抗体；与其抗原结合性片段。在一个具体实施方案中，人源化的轻链(或重链)包括依次共价连接的下列成分huFR1-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4。本发明方法还包括轻链或重链V区的抗原结合性片段，以及还包括相关恒定区与其片段的分子。
如上述，本发明的一个目的为生产人源化抗体(及抗原结合性片段)，其中至少一个V区上的潜在游标区遮蔽问题已尽量降低，最好已消除。本发明的这一特色有助于使免疫系统分子与其关联抗原之间的专一结合性达最大化。因此，在本发明的一个实施方案中，当将非人类FR亚群与抗体V区的相应人类FR亚群比较时，可变区的至少一条轻链与重链上的各FR亚群中游标区氨基酸残基相同。例如，轻链或重链上非人类FR1的游标区氨基酸残基应与人类FR1亚群中的相应残基相同。
本方法中使用的第一个载体典型地包括所编码的免疫系统分子在所需宿主中适当表达所需的序列信息。该免疫系统分子为人源化轻链V区的实施方案中，若该第一个载体还包括人类轻链恒定区或其片段时，则经常会比较有用。通常人类轻链恒定区或片段将共价连接人源化轻链，但并非必须如此。
在优选实施方案中，人类轻链恒定区为Cκ、Cλ或其片段。人源化轻链片段的氨基酸长度经常在约80至约250个氨基酸之间，优选为约95至约235个氨基酸之间，更优选为约104至约225个氨基酸。人源化轻链片段的大小可由多种标准方法测定，包括使用适当大小的标记物片段进行的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法或分子筛析层析法，质谱仪测定或氨基酸序列分析法。
在其中人源化免疫系统分子为重链V区的实施方案中，人源化重链片段的氨基酸长度经常在约80至约650个氨基酸之间，优选为约95至约540个氨基酸之间，更优选为约102至约527个氨基酸，其可由例如使用适当大小的标记物片段进行的标准SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法或分子筛析层析法，质谱仪测定或氨基酸序列分析法测定。
如上述讨论，本发明的一个目的为提供新颖的人源化方法，其中将来自非人类免疫系统分子的各构架区分别与人类构架亚群集合库进行比较。因此，例如，为对嵌合抗体进行人源化，将重链(HC)可变区的第一个构架区(FR1)序列与人类抗体重链可变区中的FR亚群的所有已知序列比较。鉴定出同一性或同源性程度最高的候选物(氨基酸序列中不符合处最少)。然后最好对HC的各FR2、FR3与FR4重复该过程。对轻链可变区中的FR进行类似过程。依本发明计划用途的需要，自相同或不同的抗体中获取最佳匹配的人类FR亚群。此点显著不同于其他人源化法，其中后者所选择的最佳匹配序列是来自单一人类抗体序列中的整个构架。
在本方法的特定实施方案中，第一个载体还包括与人源化重链共价连接的人类重链恒定区或其片段。
优选地，人类恒定区为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型或其片段之一。
“嵌合抗体”或包括复数形式的相关名词指其轻链与重链基因已由属于不同物种的免疫球蛋白基因区段进行构建，典型地采用基因工程法进行的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变(V)区可连接人类恒定(C)区，如γ1、γ2、γ3、或γ4。因此典型的治疗性嵌合抗体为由来自小鼠抗体V区或抗原-结合区与来自人类抗体的C区或效应物区组成的亲合蛋白，但也可使用其他哺乳动物物种。具体的嵌合抗体包括下文将公开的抗组织因子抗体cH36与抗脂磷壁酸质抗体c96-110(有时候称为A110)。
如上述讨论，本发明方法中将非人类抗体可变(V)区构架区(FR)的氨基酸序列与许多人类氨基酸序列进行比较，优选与人类抗体构架氨基酸序列或其片段的序列集合库进行比较。这样的集合的一个实例是包括完全测序的人类抗体列表的数据库。不同于先前技术的人源化，该集合库可另包括部分测序的人类抗体的一个或多个氨基酸序列。或者，该集合库可基本上仅包括部份测序的人类抗体。这样的集合库的实例包括(但不限于)下列数据库GenBank、IMGT、Swiss-Prot与上述的Kabat。
在本发明的更具体实例中，提供了一种制造人源化抗体或其抗原结合性片段的方法。在一个实施方案中，该方法包括至少一个下列步骤，最好所有下列步骤a)将非人类抗体轻链可变(V)区构架区(1-FR)的氨基酸序列与人类抗体轻链构架氨基酸序列集合库进行比较，b)自集合库中选择与1-FR具有最高氨基酸序列同一性的人类FR亚群，c)使1-FR的DNA突变，以编码与步骤b)中所选择的人类FR亚群具有实质上相同的氨基酸序列的轻链人源化FR亚群(L-huFR)，d)对轻链V区中各FR亚群重复步骤a)至c)，产生许多DNA序列，其中各DNA序列编码L-huFR，e)用来自步骤d)的各L-huFRDNA序列取代至少编码该非人类抗体轻链V区的第一载体中所编码的相应1-FRs；其中该取代作用操纵性连接各L-huFRs与相应的互补性决定区(CDR)，f)将非人类抗体重链可变(V)区构架区(h-FR)的氨基酸序列与人类抗体重链氨基酸序列集合库进行比较，g)自集合库中选择与h-FR具有最高氨基酸序列同一性的人类FR亚群，h)使h-FR的DNA突变，以编码具有与步骤g)中所选择的人类FR亚群实质上相同的氨基酸序列的人源化重链FR亚群(H-huFR)，i)对非人类重链V区中的各h-FR重复步骤f)至h)，产生许多DNA序列，其中各DNA序列编码H-huFR，j)用来自步骤i)的各H-huFR DNA序列取代至少编码该非人类抗体重链V区的第二载体中的相应h-FRs；其中该取代作用操纵性连接各H-huFRs至其相应的重链CDR处，及k)在宿主细胞中，在有助于产生人源化轻链与重链并制造人源化抗体或其片段的条件下表达该第一和第二载体。
在上述方法的实施方案中，在同一宿主细胞中表达该第一和第二载体。在另一实施方案中，编码人源化轻链与重链或其片段的DNA分子包含在一个载体上，并于同宿主细胞中共表达。
适用于上述抗体人源化法的第一载体包含所编码的免疫系统分子适当表达所需的序列信息。例如，可接受的第一载体包括与人源化轻链V区共价连接的人类轻链恒定区或其片段。优选地，该恒定区为Cκ、Cγ或其片段。
根据本发明方法，优选的第二载体典型地还包括与人源化重链V区共价连接的人类重链恒定区或其片段。例如，人类恒定区可为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型(包括其片段)或者其他同种型(IgA、IgD、IgE或IgM)之一。
本发明还与用于自天然共同存在的细胞成分中纯化人源化免疫系统分子的额外步骤相容。因此，在一个实施方案中，上述方法还包括一个或多个自宿主细胞中纯化人源化抗体、以制造实质上纯的抗体制剂的步骤。优选地，该实质上纯的人源化抗体与抗原特异性结合，其亲合力不会低于亲代非人类抗体的约十分之一。
本发明显然可用于制造许多种人源化免疫系统分子。例如，本发明的人源化抗体包括1)轻链与重链构架区(FRs)，其各自与人类FR亚群的氨基酸序列分别至少约90％相同，优选至少95％相同，更优选至少约98％至100％相同，2)至少一种来自啮齿类(如小鼠)的CDR，优选所有CDR均来自小鼠，3)以及一免疫球蛋白恒定区，其与相应的人类免疫球蛋白恒定区至少约90％相同，优选至少95％至约100％相同。较好的是抗体已经过“人源化”方法进行“人源化”，因为所得的人源化抗体预计可与提供CDRs的抗体结合相同的抗原。
还可以理解的是，本文所公开的特定人源化免疫系统分子，通常是人源化抗体，可另具有一个或多个保守性氨基酸取代，其依需要可以是连续或非连续的。例如，这样的取代作用典型地对抗原结合性或其他免疫球蛋白功能的影响实质上很小或没有。“保守性取代”指例如gly←→ala；val←→ile←→leu；asp←→glu；asn←→gln；ser←→thr，lys←→arg；与phe←→tyr。
本文所公开的方法与分析法中所使用的本发明抗体最好相当纯。抗体“相当纯”意指该抗体或蛋白质已与其他共同天然存在的成分分开。例如，采用标准的免疫亲合或蛋白质A亲合纯化技术，可自杂交瘤中或细胞培养基中，使用天然TF作为抗原或蛋白质A树脂纯化本发明抗体。同样地，可使用本发明抗体，利用标准免疫亲合纯化技术得到相当纯的天然TF。具体地说，当至少50％的总蛋白质(占指定样品中总蛋白质重量％)为本发明的抗体或蛋白质时，则该抗体或蛋白质是相当纯的。优选地，该抗体或蛋白质占总蛋白质的至少60重量％，更优选至少75重量％，甚至更优选至少90重量％，最优选占总物质的至少98重量％。纯度很容易依已知方法分析，如SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)、柱层析法(例如亲合层析法、大小排阻层析法)、质谱术或HPLC分析法。
这样的相当纯的人源化抗体可用于特异性结合多种抗原。例如，在一个实施方案中，本发明所产生的抗体可用于特异性识别和结合脂磷壁酸质或相关脂肪酸。也可制造能特异性识别和结合人类组织因子的其他人源化抗体与片段。
根据本发明的人源化免疫系统分子可提供多种重要用途。例如，本发明的人源化抗体与抗原结合性片段可用于预防或治疗人类或动物疾病。其他用途包括用作诊断产品。
用于依据本发明方法进行人源化抗体可很容易从多种来源获得。或者，其可从头制造。其中一种制造这样的分子的方法为使用天然人类TF的纯化样品或如上述讨论的免疫原性肽，单独或与载体相复合，或者作为与佐剂的混合物，接种动物。合适的哺乳动物包括典型的实验室动物，如绵羊、山羊、兔子、豚鼠、大鼠与小鼠。大鼠与小鼠，尤其是小鼠、优选用于取得单克隆抗体。抗原可依许多合适途径中的任一种对哺乳动物给药，如皮下、腹膜内、静脉内、肌内或皮内注射。最佳的接种间隔、接种剂量等等可在相当大范围内变化，并可依据本公开内容凭经验确定。典型的方法涉及在几个月内注射抗原数次。采用标准技术从已接种动物的血清中收集抗体，并节选发现对所需抗原特异的抗体。单克隆抗体可在会产生抗体的细胞中生成，并使用形成融合瘤细胞的标准融合技术利用这些细胞生产单克隆抗体。参见G.Kohler等人，Nature256456(1975)。典型地，这涉及将产生抗体的细胞与永生化细胞株(如骨髓瘤细胞)融合，产生杂合细胞。或者，可采用Huse等人，Science，2561275(1989)中的方法从细胞中生成单克隆抗体。若需要时，可采用一般方法对这样的抗体测序。
有些用途中可能需要使用嵌合抗体作为待人源化的抗体，例如非人类动物可变区与人类恒定区组合形成的抗体分子。可制备多种这样的嵌合抗体，包括例如制造人类可变区嵌合体，其中可变区的部分(尤其是抗原结合性区的保守区)来自人类，而仅超变区来自非人类来源。有关人源化嵌合抗体与其制造方法也可参见S.L.Morrison，Science，2291202-1207(1985)；Oi等人，BioTechniques 4214(1986)；Teng等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，807308-7312(1983)；Kozobor等人，Immunology Today 472-79(1983)；Olsson等人，Meth.Enzymol.923-16(1983)。
此外，可使用转基因基因小鼠来制造特定的人类单克隆抗体。例如，已构建出带有人类抗体组成库的转基因小鼠，其可接种感兴趣的抗原。来自这样的已接种转基因小鼠的脾细胞即可用于制备可分泌与抗原特异性反应的人类单克隆抗体的杂交瘤。参见N.Lonberg等人，Nature，368856-859(1994)；L.L.Green等人，NatureGenet.，713-21(1994)；S.L.Morrison，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，816851-6855(1984)。
编码本发明抗体的核酸也可利用聚合酶链反应制备(参见下文中实例1所公开的引物)。一般参见Sambrook等人，Molecular Cloning(第2版1989)。这样的核酸也可依已知方法合成，例如磷酸三酯法(参见Olig onucleotide Synthesis，IRL Press(M.J.Gait，ed.，1984))，或采用市售自动化寡核苷酸合成仪。所制成的这样的本发明核酸可用于通过已知技术表达本发明抗体。例如，可将编码本发明抗体的核酸依已知方法引入至合适载体中，如使用限制酶切割载体，供插入构建体，然后连接。随后可将含有所插入的核酸序列并与启动子序列适当地操纵性连接的载体引入至宿主细胞中进行表达。一般参见上述Sambrook等人的文献。合适的载体可依据与克隆方案相关的因素凭经验选择。例如，载体应与所使用的宿主细胞相容，且具有适当的复制子。此外，载体必须可接纳所插入的核酸序列。合适的宿主细胞将包括多种原核生物或真核生物细胞，如大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)或其他细菌宿主，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或其他酵母菌，黑曲霉(Aspergillus niger)或其他真菌、或其他微生物宿主、CHO、BK或NSO哺乳动物细胞、鸟类或植物细胞，等等。
根据特定的本发明实施方案，本文所描述的方法包括在适合载体在那样的细胞中表达的条件下将一种或多种所需载体类型至引入植物细胞中的步骤。感兴趣的特定植物细胞有拟南介属(Arabidopsis)。参见美国专利No.6,417,429与其中引用的文献。
例如，在上述制造V区或其抗原结合性片段的方法中，步骤e)包括将第一载体引入至植物细胞中，优选拟南芥属(Arabidopsis)细胞，并在其中表达该第一载体，产生抗体V区。该方法可很容易用于表达完整抗体(包括其抗原结合性片段)。
至于上述制造人源化抗体或其抗原-结合性片段的方法，步骤k)包括将第一与第二载体引入至植物细胞中，优选拟南芥属(Arabidopsis)细胞，并在其中表达载体，产生所需分子。在有些本发明实施方案中，可换用下文中称为“mega”的载体，替代该第一与第二载体。
本发明抗体的分子量依多种因素而异，如预定用途及该抗体是否包括缀合或重组融合的毒素、药物、放射性同位素或可检测标记物，等等。分子量也可依抗体可能进行的任何翻译后修饰法(如糖基化)的性质及程度而异。这些修饰则随用于表达的宿主为产生非糖基化抗体的大肠杆菌及产生糖基化抗体的真核细胞如哺乳动物细胞而定。通常，本发明抗体的分子量为约20至150kDa之间。这样的分子量很容易采用分子大小测定法测定，如SDS-PAGE，然后进行蛋白质染色或Western blot分析法。
“本发明抗体”或其他类似术语指完整免疫球蛋白及可结合所需抗原的免疫活性片段。免疫球蛋白与其免疫活性(抗原结合性)片段包括表位结合位点(亦即能被识别抗体的抗原特异性结合的位点或表位)。抗体片段实例包括例如Fa b、F(v)、Fab’、F(ab’)2片段，由还原免疫球蛋白的二硫键而衍生的“半分子”，单链免疫球蛋白、或其他合适的抗原结合性片段(参见例如Bird等人，Science，242423-426(1988)；Huston等人，PNAS，(USA)，855879(1988)；Webber等人，Mol.Immunol，32249(1995))。抗体或其免疫活性片段可来自动物(例如啮齿类，如小鼠或大鼠)、或嵌合型(参见Morrison等人，PNAS，816851(1984)；Jones等人，Nature，321522(1986))。本发明的单链与人源化抗体可用于本发明的某些应用中。
因此，根据另一实施方案，上述方法还包括旨在从人源化V区制备人源化单链抗体(sc-Fv)的额外步骤。此外，可依一般方法制造人源化抗体的片段，例如F(v)、F(ab’)2、Fab’或Fab；及其抗原结合性片段。
同样地，“本发明的核酸”指可表达而产生本发明上文中明确说明的抗体的核苷酸序列。
在有些例子中，可能需要修饰本发明抗体，以便向其赋予所需的生物学、化学或物理学性质。因此，本发明方法可与旨在使一个或多个人源化免疫系统分子与治疗剂缀合(亦即共价连接)的额外的一般步骤相容。这样的连接法可采用几种方法完成，包括使用连接分子，如异双功能性蛋白质交联剂，例如SPDP、碳化二亚胺等等，或利用重组法。可与本发明人源化抗体的用法相容的特定缀合法已公开在PCT申请WO99/21572(Rhode，P.等人)中。亦参见Ausubel等人，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，(1989)；Harlow与Lane，AntibodiesALaboratory Manual，CSHPublcations，NY(1988)。
本发明的特定人源化抗体可以是多克隆或单克隆的，这依需要而定，并且可具有(但不限于)IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型或IgA、IgD、IgE、IgM。
本文所公开的人源化抗体可由一种策略或多种策略的组合(下文实例1-9中说明的那些方法)制造。
在实施例1与4描述的方法中，采用四种一般步骤对抗体进行人源化。首先，由cH36小鼠-人类嵌合抗体得到小鼠抗体轻链与重链氨基酸序列。第二，通过确定哪一个人类抗体构架区可产生“最佳匹配”，亦即最类似小鼠构架区氨基酸序列，对cH36进行人源化。第三，对相关的轻链与重链FR序列进行人源化，并且第四，转染和表达编码该人源化轻链或重链(或人源化轻链与重链，例如参见下文描述的mega载体)的分离核酸(群)。
更具体而言，采用“FR最佳匹配”方法来进行嵌合抗组织因子抗体cH36的人源化。在此方法中，使用示于图1A和1B的鼠轻链与重链可变区序列(SEQ ID NO2与4)来搜索(“比较”)所有可供利用的蛋白质数据库，寻找与鼠可变区同源性最高的人类抗体可变区序列。参见例如上述Kabat等人的文献。可采用许多容易获得的电脑程序进行此步骤，如BLAST、FASTA与相关程式。轻链与重链的构架区1、2、3与4特别值得注意，因为几乎十分清楚这些位置将CDRs保留在适合抗原结合的方向上。搜索后的结果输出通常为与所探讨的小鼠序列最为同源的序列、与各序列的同源性百分比及各人类序列与相应的鼠序列排列的列表。该分析通常分别对轻链与重链进行。
根据“FR最佳匹配”方法，使所探讨的小鼠FR亚群与人类FR亚群之间不匹配的氨基酸数目降至最少。在大多数情况下，合适的人类构架区亚群依据下列同一性标准选择。以轻链为例，鼠FR1的氨基酸序列与人类FR亚群至少约80％相同；鼠FR2与人类FR亚群至少约90％相同；鼠FR3与人类FR亚群至少约90％相同；并且鼠FR4与人类FR亚群至少约75％相同。以重链为例，所选择的鼠FR1的氨基酸序列与人类FR亚群至少约80％相同；鼠FR2与人类FR亚群至少约85％相同；所选择的鼠FR3与人类FR亚群至少约70％相同；并且鼠FR4与人类FR亚群至少约90％相同。通常，当评估类似的人类构架区候选序列时，以保守性氨基酸取代作用优先。已发现，当考虑这样的因素时，所得的人类构架区即可作为嵌合cH36抗体进行人源化的良好参考点。
一旦决定制造所需的人类构架区后，即采用重组聚合酶链式反应(PCR)技术，在轻链与重链二者中制造所需的氨基酸取代。通常，制造并使用寡核苷酸来使小鼠可变区构架突变，从而包含所需的残基。可采用多种不同长度的寡核苷酸。有关重组PCR与相关方法的一般说明，参见WO92/07075。
通常，采用例行的PCR进行克隆，以导入克隆或诊断用限制性内切核酸酶位点及改变位于可变区末端的氨基酸残基。采用基于PCR的诱变法一次改变多个氨基酸残基，当这些残基位于可变区的中间时尤其可如此进行。采用定点诱变法一次引入1或2个氨基酸取代。各步骤之后，对部分人源化的克隆测序，其中有些可变区则在后来克隆入表达载体中。进行这些操作法的更明确方法说明于实施例中。
进行上述“FR最佳匹配”方法以对各非人类FR进行人源化后，将编码人源化构架区(huFR)和/或CDR的突变核酸连接编码轻链或重链恒定区的适当DNA。随后将这样的构建体克隆到表达载体中，并转染至宿主细胞内，优选哺乳动物细胞。这些步骤可采用本领域中已知的重组法与细胞培养技术完成。
在一种途径中，通过下述一般方法制造人源化抗体(a)制备第一表达载体，其包括适合表达宿主的复制子及操纵性连接DNA序列合适启动子，该DNA序列至少编码Ig重链或轻链的可变区，该可变区包含来自所需抗体的各自人源化的构架区(FR1-4)与鼠CDRs1-3；(b)制备第二可复制表达载体，其包括操纵性连接DNA序列的合适启动子，该DNA序列至少分别编码互补性Ig轻链或重链的可变区，该可变区包含来自该抗体的相应的、各自人源化的构架区(FR1-4)与鼠CDRs1-3；(c)使用已制备的第一或两种载体转染细胞株；及(d)培养该转染细胞株以产生人源化抗体。
步骤(a)与(b)中的DNA序列最好编码来自在人类抗体链的合适恒定区。合适的同种型包括例如(但不限于)IgG1与IgG4。
或者，本发明合适的人源化抗体可通过制造一种可复制的“mega”载体而制得，该载体包括操纵性连接DNA序列的适当启动子，该DNA序列至少编码Ig重或轻链的可变区，该可变区包含来自所需抗体的各自人源化的各构架区(FR1-4)及鼠CDRs1-3。
在一个实施方案中，mega载体还包括操纵性连接DNA序列的适当启动子，该DNA序列相应地至少编码互补性Ig轻链或重链的可变区，该可变区包含来自cH36抗体或其他合适CDRs的相应的、各自人源化的构架区(FR1-4)与鼠CDRs 1-3。若需要由一种载体表达人源化抗体时，经常适合使用mega载体。
显然上述制造人源化cH36抗体的方法可很容易用来制造根据本发明的其他人源化抗体与抗原结合性片段。
极适合本发明人源化方法的具体抗体实例公开于USSN No.09/990,586；与60/343,306申请及其实例中。
“装配”意指采用标准重组技术将编码人源化构架或构架区的DNA序列引入至载体中。这样的装配法可依下列一种方法或多种方法的组合进行，包括(但不限于)将反复的变化引入至单一构架或构架区序列中，切割片段并粘贴在一起(利用限制性内切核酸酶与连接酶)，或利用合成性DNA合成技术。一般参见上述Harlow与Lane的文献，及上述Ausubel等人的文献。
上述制造人源化抗体的方法可使用几乎任何可接受的诱变技术来实施。具体而言，相关的方法步骤可使用定点诱变法和/或标准PCR方法，以适当的人类氨基酸置换构架中的所需啮齿类氨基酸。亦可通过DNA合成已修饰的片段或整个编码区，或采用标准重组DNA进行体外重组法或基因工程技术或其任何组合来实现。典型地，被修饰(人源化)的构架或构架区的序列相应于自数据库中选择的人类构架或构架区序列。
本发明合适的核酸编码至少一种本文所公开的人源化抗体重链或轻链或其片段。典型地，该核酸为重组DNA载体，其包括分离的核酸。该DNA载体典型地还包括操纵性连接人源化免疫球蛋白编码序列的表达控制多核苷酸序列，包括天然相关的或异源性的启动子区。优选地，表达控制序列为可转化或转染真核生物宿主细胞的载体中的真核生物启动子系统，但也可使用原核生物宿主的控制序列。一旦载体已被引入适当宿主中后，即在适合高水平表达该核苷酸序列的条件下保持宿主，需要时可随后收集并纯化轻链、重链、轻/重链二聚体或完整抗体、结合性片段或其他免疫球蛋白形式。
最终可表达所需人源化抗体的本发明核酸序列可由多种不同多核苷酸(基因组或cDNA、RNA、合成性寡核苷酸，等等)与组分(例如V、J、D与C区)，及采用多种不同技术而形成。将适当基因组与合成性序列相连接的方法是目前最常用的制造法，但也可利用cDNA序列。参见例如上述S.L.Morrison的文献，上述Oi等人的文献，上述Teng等人的文献，上述Kozbor等人的文献，上述Olsson等人的文献，欧洲专利公告No.0239400与Riechmann，L.等人，Nature，332323-327(1988)；以及其中摘录的文献。
本发明可适用于许多种合适的宿主，例如哺乳动物、植物或微生物宿主细胞。在一个实施方案中，合适的DNA表达载体包括一个或多个选择标记，例如四环素、氨苄青霉素、遗传霉素(geneticin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)或新霉素(或类似物)，以便检测经所需DNA序列转化了的那些细胞(参见例如美国专利No.4,704,362，其公开内容已引入本文作为参考)。大肠杆菌是一种特别适于克隆本发明多核苷酸的原核生物宿主。其他适合的微生物宿主包括(但不限于)芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilus)，与其他肠杆菌，如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serralia)、多种假单胞菌属(Pseudomonas)及其他微生物，如放线菌类(例如链霉菌属(Streptomyces speies))、酵母菌(例如酵母属(Saccharomycess pecies))或真菌(例如曲霉属(Asperillusspecies))。在这样的原核生物宿主中，也可制造表达载体，其通常包含可与宿主细胞相容的表达控制序列(例如启动子与复制起点)。此外，任何数量的多种已知启动子均可存在，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子典型地将控制表达，可视需要使用操纵子序列，且具有核糖体结合位点序列等等，供启动及完成转录和翻译。其他微生物，如酵母菌，也可用于表达。酵母是具有合适载体的优选宿主，该载体中含有表达控制序列，如启动子，包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(glycolytic enzyme)，及依需要含有复制起点、终止序列等等。
除了上述以微生物为基础的系统外，也可使用真核生物宿主来表达及生产本发明的多肽(参见Winnacker，“From Genesto Clones”，VCHPublishers，N.Y.，N.Y.(1987)，其公开内容引入本文中作为参考)。在许多实施方案中，通常优选真核生物宿主，常使用哺乳动物细胞株，(但不限于)包括CHO细胞株、多种不同COS细胞株、NSO细胞、BK细胞、HeLa细胞，优选骨髓瘤细胞株，等等，或杂交瘤的转化B-细胞。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，如复制起点、启动子与增强子(Queen等人，Immunol.Rev.8946-68(1986))，及必要的加工信息位点，如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多聚腺苷酸化位点与转录终止子序列。优选表达控制序列是衍生自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等等的启动子。在其他实施方案中，真核生物宿主中，通常优选真核生物宿主为植物或植物细胞，其包括(但不限于)例如拟南芥属(Arabidopsis)、烟草属(Micotinia)，等等，植物细胞培养物也可用于表达与生产本发明抗体。在其他实施方案中，通常优选真核生物宿主为昆虫细胞、鸟类细胞或转基因动物。
用于实施本发明的优选DNA载体包括下列操纵性连接的序列抗生素抗性标记，例如氨苄青霉素抗性、F1起点与重链(HC)或轻链(LC)可变区。该可变区可插入到适当HC表达载体中，后者包括依次操纵性连接的下述成分HC可变区、人类IgG1或IgG4恒定区、第一个polyA位点、SV40启动子、抗生素抗性标记如新霉素抗性、第一个polyA位点、巨细胞病毒(CMV)启动子/增强子及合适的Leader。
其他优选的DNA载体包括操纵性连接啮齿类κ-内含子(intron)(例如小鼠)的LC可变区，该内含子操纵性连接合适的人类κ-恒定区；与抗生素抗性标记如新霉素抗性。
如上述讨论，常常很有用的是由单一核酸表达本发明的人源化抗体。优选的DNA载体有时候在本文中称为“mega”载体，其包括依次操纵性连接的下列成分SV40启动子、抗生素抗性标记如新霉素、第一个polyA位点、第一个CMV启动子/增强子、LC可变区、啮齿类κ-内含子(例如小鼠)、人类κ-外显子(exon)；第二个polyA位点、第二个CMV启动子/增强子、HC可变区与人类IgG1或IgG4重链恒定区。这样的mega载体的具体实例是人源化抗-TF IgG1抗体表达载体，其描述于下文实施例1-3中。也可参见图2。
A.人源化抗组织因子结合性抗体的制备人源化抗组织因子结合性抗体的制备与用途已描述于待审美国申请No.09/990,586与06/343,306中。亦参见下文实施例1-3。
简言之，优选抗体结合人类组织因子，形成结合复合物。组织因子可以是天然或重组的人类组织因子(rhTF)。优选地，因子X或因子IX与复合物的结合受到抑制。在本发明的优选实施方案中，人源化抗体对hTF的表观亲合常数(KA，M-1)低于约1nM；优选低于约0.5nM，更优选约0.01nM至约0.4nM之间。有关测定人源化抗体亲合常数的更详细资料参见下文实施例1-3。“特异性结合”意指人源化抗体与TF(或rhTF)、但不与其他抗原形成可检测的结合复合物，其可由标准免疫技术测定，如RIA、Western blot ELISA.
根据本发明制备的更优选人源化抗-TF给合性抗体对天然人类TF的表观亲合常数(KA，M-1)为至少约1×108M-1，其由表面质粒基因组分析法测定(具体地为根据下文实施例3的BIACore分析法)，更优选为由表面质粒基因组分析法测得至少约5×108M-1，仍更优选由表面质粒基因组分析法测得对天然人类TF的表观亲合性常数(KA，M-1)至少约3×109M-1。本发明抗体的这种相当高的结合亲和性显然与过去文献所报告的极低结合亲合性相反。
因此，可使用有效浓度相当低的人源化组织因子结合性抗体，例如，在如下文实施例3所述的体外分析法中，可使用相当低浓度的抗体来抑制TF功能(例如至少约95、98或99％抑制性)。
已经过本发明方法人源化的特定组织因子结合性抗体的核酸(SEQID NO.1与3)与氨基酸(SEQ ID NO.2与4)序列，亦即H36.D2.B7。参见图1A与1B。SEQ ID NOS.1与2分别为轻链可变区的核酸与氨基酸序列，SEQ ID NOS.3与4分别为重链可变区的核酸与氨基酸序列，其中所有序列中的超变区(CDRs或互补性决定区)以下划线表示。
本发明其他组织因子结合性人源化抗体将与图1A与1B所示轻链或重链序列中之一或二者的氨基酸序列具有实质性的氨基酸序列同一性。更具体而言，这样的抗体包括与SEQ ID NOS.2及/或4具有至少约70％同源性(氨基酸序列同一性)的那些，更优选为与SEQ ID NOS.2及/或4具有约80％或更高同源性，仍更优选与SEQ ID NOS.2及/或4具有至少约85、90或95％同源性。
更具体而言，本发明的组织因子结合性人源化抗体与SEQ ID NOS.2与4超变区具有高度氨基酸序列同一性(图1A与1B中以双下划线表示)。特定的抗体将具有轻链可变区1、2或3个超变区，它们与H36.D2.B7的轻链可变区的1、2或3个相应超变区具有高度序列同一性(至少90％或95％氨基酸序列同一性)或相同，那些超变区以下划线示于图1A中，具体如下1)LASQTID(SEQ ID NO5)；2)AATNLAD(SEQ ID NO6)；和3)QQVYSSPFT(SEQ ID NO7).
经过本文所述方法人源化且可结合组织因子的其他特定抗体将具有重链可变区的1、2或3个超变区，它们与H36.D2.B7的重链可变区的1、2或3个相应超变区具有高度序列同一性(至少90％或95％氨基酸序列同一性)或相同，那些超变区以下划线示于图1B中，具体如下1)TDYNVY(SEQ ID NO8)；2)YIDPYNGITIYDQNFKG(SEQ ID NO9)；和3)DVTTALDF(SEQ ID NO10).
本发明某些核酸的长度(优选为至少约100、200或250个碱基对)优选在下列中度严格条件(本文中称为“正常严格”条件)下足以结合SEQ ID NO.1与/或SEQ ID NO.3的序列采用的杂交缓冲液包含在0.9M盐水溶液/0.12M柠檬酸钠(6×SSC)缓冲液中的20％甲酰胺，温度37℃，于37℃ 下2×SSC缓冲液洗涤一次，仍保持结合。
更具体地说，本发明某些核酸(优选至少约100、200或250个碱基对)于下列高度严格条件(本文中称为“高度严格”条件)下可与SEQID NO.1与/或SEQ ID NO.3的序列结合采用的杂交缓冲液包含在0.9M盐水溶液/0.12M柠檬酸钠(6×SSC)缓冲液中的20％甲酰胺，温度42℃，于42℃下以1×SSC缓冲液洗涤二次，仍保持结合。
本发明核酸最好包含至少20个碱基对，更优选至少约50个碱基对，仍更优选本发明核酸包含至少约100、200、250或300个碱基对。
通常优选的本发明核酸将表达具有优选结合亲和性及本文中公开的其他性质的本发明抗体。
本发明的其他核酸也与图1A与1B所示轻链或重链中之一或二者之序列具有实质性序列同一性。更具体而言，优选核酸包含与SEQ ID NOS.1与/或3具有至少约70％同源性(核苷酸序列同一性)、更优选与SEQ IDNOS.1与/或3具有至少约80％或更高同源性，仍更优选与SEQ ID NOS.1与/或3具有至少约85、90或95％或者更高同源性的序列。
本发明的其他具体核酸序列与SEQ ID NOS.1与3的超变区(图1A与1B中以下划线表示)具有高度序列同一性。这样的核酸包括编码抗体轻链可变区并具有编码超变区的1、2或3个序列且与编码H36.D2.B7相应超变区的1、2或3个序列具有高度序列同一性(至少90％或95％核苷酸序列同一性)或相同的那些核酸，H36.D2.B7的超变区示于图1A中，以下划线表示，具体如下1)CTGGCAAGTCAGACCATTGAT(SEQ ID NO11)；2)GCTGCCACCAACTTGGCAGAT(SEQ ID NO12)；和3)CAACAAGTTTACAGTTCTCCATTCACGT(SEQ ID NO13).
更具体的核酸也编码抗体重链可变区，具有编码超变区的1、2或3个序列，并且与编码H36.D2.B7的相应超变区的1、2或3个序列具有高度序列同一性(至少90％或95％序列同一性)或者相同，H36.D2.B7的超变区示于图1A中，以下划线表示，具体如下1)ACTGACTACAACGTGTAC(SEQ ID NO14)；
2)TATATTGATCCTTACAATGGTATTACTATCTACGACCAGAACTTCAAGGGC(SEQ ID NO15)；和3)GATGTGACTACGGCCCTTGACTTC(SEQ ID NO16).
本发明与TF结合的更具体人源化抗体为其中构架区(FRs)1、2、3与4中每一个均与图3A所示轻链FR序列(SEQ ID NO.72-82)(优选图3A中以“LC-09”表示的序列)具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％或更高同一性的那些。其他具体的人源化抗体包括与图5A(SEQ ID NO.97)或图6A(SEQ ID NO.99)所示氨基酸序列具有至少约90％同一性、优选至少约95％或更高序列同一性的轻链恒定区。
其他明确的人源化抗体为其中构架区(FRs)1、2、3与4中每一个与图4A(SEQ ID NO.83-96)(图4A中以“HC-08”表示的序列)所示重链序列具有至少约90％氨基酸序列同一性、优选约95％或更高同一性的那些。其他人源化抗体具有与图5B(SEQ ID NO.98)或图6B(SEQ IDNO.100)所示氨基酸序列有至少约90％同一性、优选至少约95％或更高序列同一性的重链恒定区。
在某些实施方案中，人源化抗体具有如待审美国申请No.09/990,586和60/343,306所公开的IgG1(hOAT)或IgG4(hFAT)同种型。
本发明也提供本文所公开的人源化抗体的功能性片段。这样的片段的实例包括(但不限于)与TF结合的亲合常数(Kd)低于约1nM、优选低于约0.5nM、更优选在约0.01nM至约0.4nM之间的那些。特别优选抗原结合性Fab、Fab′和F(ab)2片段。
如上述讨论，本发明的特色在于包括至少一个鼠互补性决定区(CDR)(例如CDR1、CDR2、CDR3)的人源化抗体。在本发明一个实施方案中，抗体特异性结合人类组织因子(TF)，形成复合物。典型地，因子X或因子IX与TF或TFFVIIa的结合及TFFVIIa的活化作用受到抑制。如上述，优选CDRs(轻链与重链)来自啮齿类，通常为小鼠。
在本发明人源化抗体的一个实施方案中，抗体还包括至少一个人类构架区(FR)亚群。优选地，所有FRs(轻与重链)都是人类的。
在更具体的实施方案中，与人类TF结合的重链超变区的第一个CDR(CDR1)与图4B(SEQ ID NO.104)所示的CDR1氨基酸序列至少90％相同，优选至少约95％或以上相同。典型地，该重链超变区的第二个CDR(CDR2)与图4C(SEQ ID NO.9和101)所示的CDR2氨基酸序列至少90％相同，优选至少约95％或以上相同。同样优选地，该重链超变区的第三个CDR(CDR3)与图4D(SEQ ID NO.10)所示的CDR3氨基酸序列至少90％相同，优选至少约95％或以上相同。
在本发明另一个实施方案中，与人类TF结合的轻链超变区的第一个CDR(CDR1)与图3B(SEQ ID NO.103)所示的CDR1氨基酸序列至少90％相同，优选至少约95％或以上相同。典型地，该轻链超变区的第二个CDR(CDR2)与图3C(SEQ ID NO.6)所示的CDR2氨基酸序列至少90％，优选至少约95％或以上相同。优选地，该轻链超变区的第三个CDR(CDR3)与图3D(SEQ ID NO.7)所示的CDR3氨基酸序列至少90％相同，优选至少约95％或以上相同。
本发明的其他人源化抗体包括结合人类TF的重链超变区的第一个构架区(FR1)，该FR1与图4A(SEQ ID NO.91)所示氨基酸序列(以“FR1 HC-08”表示)至少90％相同，优选约95％或以上相同。在一个实施方案中，FR1包含至少一种下列氨基酸变化E1变成Q；Q5变成V；P9变成G；L11变成V；V12变成K；Q19变成R；与T24变成A。优选地，FR1包括其中2、3、4、5或6种变化，在许多应用中优选所有这些氨基酸变化。
本发明其他适合人类TF的人源化抗体包括重链超变区的第二个构架区(FR2)，该FR2与图4A(SEQ IE NO.91)所示氨基酸序列(以“FR2HC-08”表示)至少90％相同，优选的95％或以上相同。在一个实施方案中，FR2包括至少一种下列氨基酸变化H41变成P；与S44变成G。优选的FR2包括这两种氨基酸变化。
本发明之特色还在于结合人类TF的人源化抗体，其中重链超变区的第三个构架区(FR3)与图4A(SEQ ID NO.91)所示氨基酸序列(以“FR3 HC-08”表示)至少90％相同，优选约95％或以上相同。在一个实施方案中，FR3包括至少一种下列氨基酸变化S76变成T；T77变成S；F80变成Y；H82变成E；N84变成S；T87变成R；D89变成E；与S91变成T。优选的FR3包括其中2、3、4、5或6种变化，通常优选具有所有这7种氨基酸变化。
本发明之特色还在于适合结合人类TF的人源化抗体，其中重链超变区的第四个构架区(FR4)与图4A(SEQ ID NO.91)所示氨基酸序列(以“FR4HC-08”表示)至少90％相同，优选约95％以上相同。优选地，FR4包括下列氨基酸变化L113变成V。
根据本发明的结合人类TF的其他人源化抗体的特色在于其中轻链超变区的第一个构架区(FR1)与图3A(SEQ ID NO.79)所示氨基酸序列(以“FR1 LC-09”表示)至少约90％相同，优选至少约95％或以上相同。在一个实施方案中，该FR1包括至少一种下列氨基酸变化Q11变成L；L15变成V；E17变成D；与S18变成R。优选的FR1包括其中2或3种氨基酸变化，通常优选具有所有这4种氨基酸变化。
本发明的特色还在于结合人类TF的人源化抗体，其中轻链超变区的第二个构架区(FR2)与图3A(SEQ ID NO.79)所示氨基酸序列(以“FR2 LC-09”表示)至少约90％相同，优选至少约95％或以上相同。优选的FR2包括下列氨基酸变化Q37变成L。
本发明亦涵盖结合人类TF的人源化抗体，其中轻链超变区的第三个构架区(FR3)与图3A(SEQ ID NO.79)所示氨基酸序列(以“FR3LC-09”表示)至少约90％相同，优选至少约95％或以上相同。在一个实施方案中，该FR3包括至少一种下列氨基酸变化K70变成D，K74变成T，A80变成P，V84变成A，与N85变成T。优选地，该FR3包括其中2、3或4种氨基酸变化，通常首选具有所有这5种氨基酸变化。
本发明结合人类TF的其他人源化抗体包括轻链超变区的第四个构架区(FR4)，该FR4与图3A(SEQ ID NO.79)所示氨基酸序列(以“FR4LC-09”表示)至少约90％相同，优选至少约95％或以上相同。在一个实施方案中，该FR4包括至少一种、最好包括所有下列氨基酸变化A100变成Q；与L106变成I。
本发明亦包括上述人源化抗体的人类TF结合性片段。这样的片段实例包括Fab、Fab′与F(ab)2。
有关根据本发明制造的其他优选人源化抗-TF抗体可参见USSN09/990,586与60/343,306专利申请。如本文中所公开的，下列三种核酸载体pSUN36(人源化抗-TF抗体IgG1-HC表达载体)、pSUN37(人源化抗-TF抗体Ig4-HC表达载体)与pSUN38(人源化抗-TF抗体LC表达载体)已依布达佩斯条约(Budapest Treaty)保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culure Collection)(ATCC)(10801University Boulevard，Manassas VA 20110-2209)。这些载体的保藏号为PTA-3727(pSUN36)；PTA-3728(pSUN37)；与PTA-3729(pSUN38)。
制造及使用本发明人源化抗-TF抗体的合适表达与纯化策略已公开于USSN 09/990,586与60/343,306专利申请中。
B.人源化抗-LTA结合性抗体的制备原始抗-LTA嵌合抗体是下列专利申请的主题“Opsonic andProtective Monoclonal and Chimeric Antibodies specific ofLipotechoic Acid of Gram Positive Bacteria”，待审U.S.S.N.09/097,055(已公开为WO 98/57994)。
人源化抗-LTA(lipotechoic acid(脂磷壁酸质))结合性抗体的制备与使用描述在下文实施例4-5中。优选抗体通常会结合LTA而形成特异性结合复合物。特定的嵌合性抗-LTA抗体结合抗原的表观亲和常数(KA，M-1)低于约1μM，优选低于约100nM，更优选为约20nM至约2nM之间。有关表征抗-LTA抗体的进一步说明参见下文实施例5。
脂磷壁酸质为一种出现在某些革兰氏阳性细菌中的细胞成分，这样的细菌包括葡萄球菌属(Staphylococcus species)某些链球菌属(Streptococcu sspecies)与肠杆菌属(Entercoccus)。其掺入在细胞壁中，成为混合大分子聚合物的一部分，该聚合物的分子量为杂分散性，因此LTA成分可存在于细胞壁及其片段中，可能具有相当宽的分子量范围。
更优选的人源化抗-LTA结合性抗体对LTA的结合常数(KA，M-1)为至少约5×106M-1，这是由表面胞质基因组分析法测定(具体而言，根据下文中实施例3的BIACore分析法)，更优选为由表面胞质基因组分析法测得至少约1×107M-1，仍更优选由表面胞质基因组共振分析法测得对LTA的KA为至少约1×108M-1。
在一个实施方案中，结合LTA抗原的轻链超变区的第一个CDR(CDR1)与图7A(下划线)所示CDR1氨基酸序列至少约90％相同，优选至少约95％或以上的同一性。典型地，同一轻链超变区的第二个CDR(CDR2)与图7A(下划线)所示CDR2氨基酸序列至少约90％相同，优选至少约95％或更高序列同一性。同样优选的是，轻链超变区的第三个CDR(CDR3)与图7A(下划线)所示CDR3氨基酸序列至少约90％相同，更优选至少约95％或更高序列同一性。
在重链超变区方面，其他优选的抗-LTA抗体与图7B(下划线)所示CDR1氨基酸序列至少约90％相同，优选至少约95％或更高同一性。典型地，同一重链超变区的第二个CDR(CDR2)与图7B(下划线)所示CDR2氨基酸序列至少约90％相同，优选至少约95％或更高同一性。同样优选的是，重链超变区的第三个CDR(CDR3)与图7B(下划线)所示CDR3氨基酸序列至少约90％相同，优选至少约95％或更高序列同一性。
本发明的其他具体的抗-LTA抗体包括其中各轻链构架区亚群(FRs)1、2、3与4与实施例5中表6所示各轻链FR序列具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％、98％至100％同一性的类型。在一个实施方案中，该构架包括至少一种、最好包括所有下列氨基酸变化D1变成Q；S5变成T；L11变成M；E17变成D；M21变成I；S41变成Q；R76变成A；V77变成M；及M102变成K。特别优选的抗-LTA抗体具有实施例5表6中针对A110-LC所示的各L链FR亚群中至少一个或最好是所有序列，所述FR亚群指的是LC-FR1(SEQ ID NO.109的残基1-23)；LC-FR2(SEQ ID NO.109的残基24-38)；LC-FR3(SEQ ID NO.109的残基39-70)与LC-FR4(SEQ ID NO.109的残基71-80)。
其他特异性结合LTA抗原的特定人源化抗体包括其中各构架区(FRs)1、2、3与4与实施例5中表7所示重链序列具有至少约90％氨基酸序列同一性，优选至少约95％、98％至约100％序列同一性的类型。在一个实施方案中，该构架包括下列氨基酸变化中的至少一种、最好包括全部M3变成Q；K15变成G；Q78变成K；S79变成N；M80变成S；N87变成S；M95变成V；V99变成A与L119变成V。特别优选的抗-LTA抗体具有实施例5表7中针对A110-HC所示的各H链FR亚群中至少一个或最好所有序列，所述FR亚群指的是HC-FR1(SEQ ID NO.118的残基1-25)；HC-FR2(SEQ ID NO.118的残基26-39)；HC-FR32(SEQ IDNO.118的残基40-71)；与HC-FR4(SEQ ID NO.118的残基72-82)。
在某些实施方案中，人源化抗-LTA抗体具有IgG1重链恒定区(类似hOAT)或IgG4重链恒定区(类似hFAT)同种型。参见待审USSN09/990,586与60/343,306专利申请。
其他优选的抗-LTA抗体具有实施例5的表6与7中所示的轻链与重链FRs。
其他优选的人源化抗-LTR抗体的氨基酸轻链可变区与图9A(SEQ IDNO.109)所示氨基酸序列具有至少95％序列同一性，优选至少约98％或更高同一性。更优选地，这样的抗体的轻链可变区与图9A(SEQ IDNO.109)所示氨基酸序列相同。其他优选的抗体的氨基酸重链可变区与图9E(SEQ ID NO.118)所示氨基酸序列具有至少95％序列同一性，优选至少约98％或更高同一性。更优选地，这样的抗体的重链可变区与图9E(SEQ ID NO.118)所示氨基酸序列相同。
在本发明的特定实例中，提供了一种特异性结合LTA的人源化抗-LTA抗体，其包括至少一个啮齿类CDR，通常来自小鼠。优选地，该LTA抗原会特异性地结合抗体，形成复合物。同样优选地，这样的人源化抗-LTA抗体在重链上包含下列成员中的至少一个，优选全部a)第一个CDR(CDR1)，其与图9F(SEQ ID NO.124)所示CDR1氨基酸序列至少95％相同，b)第二个CDR(CDR2)，其与图9G(SEQ ID NO.125)所示CDR2氨基酸序列至少95％相同，
c)第三个CDR(CDR3)，其与图9H(SEQ ID NO.126)所示CDR3氨基酸序列至少95％相同，d)第一个构架亚群(FR1)，其与表6A(SEQ ID NO.109的残基1-23)所示氨基酸序列(以“LC-FR1”表示)至少95％相同，e)第二个构架亚群(FR2)，其与表6A(SEQ ID NO.109的残基24-38)所示氨基酸序列(以“LC-FR2”表示)至少95％相同，f)第三个构架亚群(FR3)，其与表6A(SEQ ID NO.109的残基39-70)所示氨基酸序列(以“LC-FR3”表示)至少95％相同，及g)第四个构架亚群(FR4)，其与表6A(SEQ ID NO.109的残基71-80)所示氨基酸序列(以“LC-FR4”表示)至少95％相同。
在特定的实施方案中，该人源化抗-LTA抗体还在轻链上包含下列成分中的至少一个，优选全部h)第一个CDR(CDR1)，其与图9B(SEQ ID NO.115)所示CDR1氨基酸序列至少95％相同，i)第二个CDR(CDR2)，其与图9C(SEQ ID NO.116)所示CDR2氨基酸序列至少95％相同，j)第三个CDR(CDR3)，其与图9D(SEQ ID NO.117)所示CDR3氨基酸序列至少95％相同，k)第一个构架亚群(FR1)，其与图7A(SEQ ID NO.118的残基1-25)所示氨基酸序列(以“HC-FR1”表示)至少95％相同，l)第二个构架亚群(FR2)，其与图7A(SEQ ID NO.118的残基26-39)所示氨基酸序列(以“HC-FR2”表示)至少95％相同，m)第三个构架亚群(FR3)，其与图7B(SEQ ID NO.118的残基40-71)所示氨基酸序列(以“HC-FR3”表示)至少95％相同，及n)第四个构架亚群(FR4)，其与图7B(SEQ ID NO.118的残基72-82)所示氨基酸序列(以“HC-FR4”表示)至少95％相同。优选地，该人源化抗体还包括图6A(hFAT(IgG4)SEQ ID NO.99)所示轻链恒定序列。同样优选地，该抗体包括图6B(IgG4 SEQ ID NO.100)所示重链恒定区。
本发明还包括编码分别示于图9A(SEQ ID NO.109-114)与9E(SEQID NO.118-123)的氨基酸抗-LTA轻链可变区与抗-LTA重链可变区中一个或多个的核酸分子。更具体的核酸表达抗-LTA结合性抗体的至少一部份，其具有本文所公开的优选结合亲和性与其他性质。这样的核酸的分子量通常低于约1000个碱基对(bp)，优选约200bp至约750bp(通过常规凝胶电泳法测定)。
根据本发明特别优选的核酸为图8(pJRS 391)所示的质粒。
本发明还提供本文所公开的人源化抗-LTA抗体的功能性片段。这样的片段的实例包括(但不限于)结合LTA的表观亲合常数(KA，M-1)低于约100nM、优选低于约25nM、更优选约1nM至约5nM的类型。特别优选的是抗原结合性Fab、Fab′与F(ab)2片段、单链Fv及全长度抗体。
一般地，分离本发明核酸，其通常占所指定部份中核酸总重量的至少约0.5％，优选至少约2％，更优选至少约5％。部份纯化的核酸通常占所指定部份中核酸总重量的至少约10％，优选至少约30％，更优选至少约60％。纯核酸通常占所指定部份中核酸总重量的至少约80％，优选至少约90％，更优选至少约95％。
以下列非限制性实施例说明本发明。在下列实施例以及其它地方，应用本发明方法对鼠抗组织因子抗体H36与抗-脂磷壁酸质抗体A110进行人源化。H36也称为H36.D2与H36.D2.B7，但H36是由母克隆产生的抗体，H36.D2得自一级克隆，而H36.D2.B7则得自二级克隆。这三个克隆所产生的抗体之间，在抗体抑制TF的能力或其他物理性质方面并无差异。在一般应用中，H36经常用于指示任何这些克隆或可产生该抗体的相关细胞株所产生的抗-TF抗体。H36的小鼠-人类嵌合型称为cH36(也称为Sunol-cH36)。抗-脂磷壁酸质抗体A110也称为96-110、c96-110与BSYX-A110，它是小鼠-人类嵌合抗体。
有关制备与H36抗体的进一步内容参见USSN 09/990,586与60/343,306专利申请。也可参见美国专利N.5,986,065。
本文所述及的所有文献均全文引入本文中作为参考。
实施例1-抗组织因子抗体的人源化称为H36.D2(有时候也称为H36，如上述)的特定鼠抗体的制造与使用描述在美国专利No.5,986,065中。本实施例显示该抗体的人源化形式的制备与使用。人源化H36抗体具有多种用途，包括协助尽量降低人类抗-小鼠抗体(HAMA)的潜在免疫反应。这些及其他不期望的反应困扰着H36抗体在人类治疗性应用中的用途。
A.嵌合抗组织因子抗体(cH36)的制备前述H36抗体为IgG2a鼠抗体。H36首先被转变成小鼠-人类嵌合抗体，供临床开发。其作法是克隆H36的重链与轻链基因(参见美国专利No.5,986,065)。取重链可变区与人类IgG4恒定(Fc)区融合，取轻链可变区与人类K-轻链恒定区融合。所得的IgG4K嵌合抗体被称为cH36(也被称为Sunol-cH36)。H36或cH36在慢性病患者中有多种用途，以完全人源化的cH36为首选，这样可降低或消除任何人类抗-嵌合抗体(HACA)免疫反应。cH36的人源化说明如下。
B.cH36抗体的人源化方法嵌合抗组织因子抗体cH36的人源化是采用本发明的“FR最佳匹配”法进行的。此方法充分利用公开数据库有大量具有已知氨基酸序列的人类IgGs或人类IgG片段的序列可供利用这一事实。将cH36中小鼠重链与轻链可变区的单个构架区序列与 Kabat数据库(参见http//immuno.bme.nwu.edu)中相应的重链或轻链可变区或人类构架(或其片段)的序列进行比较。采用下列标准来选择用于人源化的所需人类IgG构架区亚群(1)尽可能使不匹配的氨基酸数量降低。(2)保持“游标”)区内的氨基酸不改变(此区内的氨基酸可调整CDR结构并微调其与抗原的配合性，参见Foote，J.and Winter，G.，J.ofMol.Bio.224(2)487-499 )。(3)当评估类似候选物时，以保守性氨基酸取代作用优先。用于此比较法的匹配程式可参见Kabat数据库。参见Johnson G，WuT.“Kabat database and its applicationFuture directions.”Nucleic Res.(2001)29205-206。该程式在Kabat数据库中找出小鼠序列与人类序列之间具有同源性的区域并进行比较。采用此独特的FR最佳匹配方法，预期目标IgG的人源化LC或HC可变区的所有四个FRs可能仅来自一种人类IgG分子或来自多达四种不同的人类IgG分子。
B(i).人类IgGκ-轻链可变区构架区的选择将cH36LC各构架区氨基酸序列与Kabat数据库中人类IgGκ轻链可变区的FRs氨基酸序列进行比较。依据上述三个标准选择最佳匹配FR。
选择Kabat数据库ID No.005191的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行CH36 LC FR1的人源化。选择Kabat数据库ID No.019308的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行cH36 LC FR2的人源化。在cH36 LC FR1中产生下列突变，使之符合Kabat数据库ID No.005191的人类IgGκ轻链可变区氨基酸序列Q11变成L，L15变成V，E17变成D，S18变成R。在cH36 LC FR2中产生一种突变Q37变成L，使之符合Kabat数据库ID No.019308(有关序列信息参见表1A)的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列。
选择Kabat数据库ID No.038233的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行cH36 LC FR3的人源化。选择Kabat数据库ID No.004733的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行cH36 LC FR4的人源化。在cH36 LC FR3中产生下列突变，使之符合Kabat数据库ID No.038233的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列K70变成D，K74变成T，A80变成P，V84变成A，N85变成T。在cH36LCFR4中产生两种突变A100变成Q与L106变成I，使之符合Kabat数据库ID No.004733(有关序列信息参见表IB)的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列。
B(ii)人类IgG重链可变区构架区的选择将cH36 HC的各构架区氨基酸序列与Kabat数据库中人类IgG重链可变区的FRs氨基酸序列进行比较。依据上述三个标准选择最佳匹配FR。
选择Kabat数据库ID No.000042的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行cH36 HC FR1的人源化。选择Kabat数据库ID No.023960的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行cH36 HC FR2的人源化。在cH36HC FR1中产生下列突变，使之符合Kabat数据库ID No.000042的人类IgG重链可变区的氨基酸序列E1变成Q，Q5变成V，P9变成G，L11变成V，V12变成K，Q19变成R，T24变成A。在cH36 HC FR2产生两种突变H41变成P与S44变成G，使之符合Kabat数据库ID No.023960的人类IgG重链可变区的氨基酸序列(有关序列信息参见表2A)。
选择Kabat数据库ID No.037010的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行cH36 HC FR3的人源化。选择Kabat数据库ID No.000049的人类IgG重链可变区氨基酸序列进行cH36 HCFR4的人源化。在cH36 HCFR3中产生下列突变，使之符合Kabat数据库ID No.037010的人类IgG重链可变区的氨基酸序列S76变成T，T77变成S，F80变成Y，H82变成E，N84变成S，T87变成R，D89变成E，S91变成T。在cH36 HC FR2中产生一种突变L113变成V，使之符合Kabat数据库ID No.000049的人类IgG重链可变区的氨基酸序列(有关序列信息参见表2B)。
表1.cH36与人类轻链(LC)FR序列的比较表1A

表1B

表2.cH36(SEQ ID No83与人类重链(HC)(SEQ ID NO91))FR序列的比较表2A

表2B

一旦确定了所需的人类构架区，即采用下列三种技术在轻链与重链中进行所需的氨基酸取代(1)采用一般PCR进行克隆，以引入克隆性或诊断性限制性内切核酸酶位点，并改变位于可变区末端的氨基酸残基。(2)采用以PCR为基础的诱变法，一次改变多个氨基酸残基，当这些残基位于可变区中间时尤其可如此。(3)采用定点诱变法，一次引入1或2个氨基酸取代。依Stratagene公司的“QuickChangeSite-Directd Mutagenesis Kit”(Catalog #200518)所描述的方法进行定点诱变法。
继各步骤之后，对部份人源化的克隆测序，其中有些可变区以后会克隆至表达载体中。采用质粒tKMC180来表达LC突变体，分别采用pJRS355或pLAM356载体来表达HC突变体(为IgG1或IgG4)。有些这样的克隆随后组合在一起，再在COS细胞中瞬时表达，以便通过ELISA测定表达程度。
将抗-TF重链与轻链可变区的最终完全人源化形式克隆至本文中有时候称为“mega载体”的载体中，转染至CHO与NSO细胞中，以表达IgG。然后使用稳定细胞株生产供分析用的足量人源化抗-TF。所得的人源化形式100％来自人类(当不考虑CDR序列时)将人源化IgG4κ型称为hFAT(人源化IgG Four Anti-Tissue Factor antibody)，IgG1κ型称为hOAT(humanized IgG One Anti-Tissue Factor antibody)。cH36的这些完全人源化形式可用于治疗慢性病症，如血栓、癌症与炎症。
C.人源化抗-TF抗体重链的形成1.使用质粒pJAIgG4TF.A8(嵌合H36的表达载体)作为模板与引物TFHC1s2与TFHCLas2进行PCR扩增抗-TF mAb cH36重链(HC)可变区并克隆至pGem T-easy中。引物TFHC1s2在起始密码子上游引进一个BsiW1位点，并在构架(FR)中引进一个氨基酸变化，即由E1变成Q。引物TFHC1as在FR4引进一个氨基酸变化，即由L113变成V。此步骤得到构建体HC01。
2.采用上述构建体(HC01)与下列四种引物进行基于PCR的诱变，产生构建体HC02。上游PCR使用引物TFHC1s2与TFHC7as。下游PCR使用引物TFHC7s与TFHC1as2。使用上游与下游PCR产物作为模板，并使用引物TFHC1s2与TFHC1as2进行PCR，得到HC02。使用引物TFHC7s与TFHC7as在FR2中引进了两种氨基酸变化即H41变成P与S44变成G。
3.采用HC02作为模板与下列四种引物进行基于PCR的诱变，产生构建体HC03。上游PCR使用引物TFHC1s2与TFHC5as2。下游PCR使用引物TFHC5s与TFHC1as2。使用上游与下游PCR产物作为模板及引物TFHC1s2与TFHC1as2进行PCR，得到HC03。使用引物TFHC5s与TFHC5as2在FR3中引进三个氨基酸变化T87变成R，D89变成E与S91变成T。还在位置87引进一Bg1 II位点。
4.使用引物TFHC2s与TFHC3as，并使用pGem中的HC03作为模板进行PCR扩增。TFHC2s位于pGem中克隆位点上游。TFHC3as位于构架3中，并在FR3中引进两种氨基酸变化H82变成E与N84变成S。将所得的PCR条带克隆至pGem中，然后使用BsiW1与Bgl II消化适当大小的插入片段。将此片段克隆至HC03中，得到HC04。
5.使用HC04作为模板与下列引物，进行基于PCR的诱变，得到HC05。上游PCR使用引物TFHC1s2与TFHC6as。下游PCR使用引物TFHC6s与TFHC1as2。使用上游与下游PCR产物作为模板以及引物TFHC1s2与TFHC1as2进行诱变PCR，得到HC05。此步骤在FR3中引进下列氨基酸变化S76变成T，T77变成S及F80变成Y。
6.使用HC05作为模板与下列四种引物进行基于PCR的诱变，产生HC06。上游PCR使用引物TFHC2s与TFHC2as2。下游PCR使用引物TFHC3s2与TFHC1as2。使用TFHC2as2的扩增在FR1中引进一种氨基酸变化即P9变成G。引物TFHC3s2使Q19变成R及T24变成A。使用上游与下游PCR产物作为模板以及引物TFHC1s2与TFHC1as2进行的PCR得到HC06。
7.在构建HC06之时，在FR1的位置2处自发引进了一个点突变，即由I变成M。使用HC06作为模板及TFHC1s3与TFHC1as2作为引物的PCR扩增校正此错误取代，并在FR1中引进一个氨基酸变化即Q5变成V。所得构建体为HC07。
8.使用HC07作为模板以及下列引物，通过基于PCR的诱变制备构建体HC08。使用TFHC2s与TFHC2as3作为上游产物。下游产物已事先使用TFHC1s3与TFHC1as2扩增(参见步骤7)。使用引物TFHC2as3在FR1中引进两个氨基酸变化L11变成V及V12变成K。一个自发的点突变造成CDR2中位置64的苯丙氨酸变成亮氨酸(F→L)。进一步筛选及测序，得到构建体HC08R1，其在CDR2中位置64具有正确序列F。
9.由HC07进行定点诱变法产生两种构建体HC11与HC12。使用两种互补引物TFHC8sP与TFHC8asP以及HC07作为模板，产生HC11，它在FR1中包含三种氨基酸变化G9变成P，L11变成V，与V12变成K。然后，使HC11甲基化，进行柱纯化，以便进行下一轮定点诱变。使用HC11作为模板以及互补引物TFHC9sL与TFHC0asL进行PCR，得到HC12，其在FR1中具有V11变成L的突变。
10.构建体HC09是通过使用HC12作为模板以及互补引物TFHC10sk与TFHC10ask进行PCR而衍生自HC12的。HC09在FR1中包含一种氨基酸变化K12变成V。
11.构建体HC10是由HC09制成的。使用HC09作为模板以及互补引物LV-1与LV-2进行PCR，产生HC10，其在FR1中包含一种突变，即L11变成V。
在每一突变步骤之后，对所述部份人源化或完全人源化的克隆测序，然后将有些这样的可变区克隆至表达载体中。使用pJRS355或pLAM356载体来表达与人类IgG1或IgG4的Fc相融合的HC突变株。
图3A至3D综合说明了步骤1-11，显示了FR1-4中逐渐引进氨基酸变化。除了HC08外，所有其他重链突变株与cH36均在CDR2中位置64处包含F。HC08在位置64具有一种突变，即由F变成L。图4B至4D显示了重链CDR序列。
用于重链人源化法的引物TFHC1s25’TTTC00000000GTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGCAGCAGTC3’(SEQ ID NO31)TFHC1as25’AGCGAATTCTGAGGAGACTGTGACAGTGGTGCCTTGGCCCCAG3’(SEQ IDNO32)TFHC7s5’GTGAGGCAGAGCCCTGGAAAGGGCCTTGAGTGGATTGG3’(SEQ ID NO33)TFHC7as5’CCAATCCACTCAAGGCCCTTTCCAGGGCTCTGCCTCAC3’(SEQ ID NO34)TFHC5s5’GCATCTCAACAGCCTGAGATCTGAAGACACTGCAGTTTATTTCTGTG3’(SEQ ID NO35)TFHC5as25’CTGCAGTGTCTTCAGATCTCAGGCTGTTGAGATGCATGAAGGC 3’(SEQ IDNO36)TFHC3as5’GTCTTCAGATCTCAGGCTGCTGAGCTCCATGAAGGCTGTGGTG 3’(SEQ IDNO37)TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’(SEQ ID NO38)TFHC6s5’CTGTTGACAAGTCTACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAG3’(SEQ IDNO39)TFHC6as5’CTGCTGAGCTCCATGTAGGCTGTGCTGGTAGACTTGTCAACAG3’(SEQ IDNO40)TFHC2as25’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCACCTCCAGACTGCTGCAGC3’(SEQ ID NO41)TFHC3s25’CTGGGGCTTCAGTGCGGGTATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCAC3’(SEQ ID NO42)TFHC1s3
5’TCGTACGTCTTGTCCCAGATCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGGTGAGC 3’(SEQID NO43)TFHC2as35’GCACTGAAGCCCCAGGCTTCTTCACCTCACCTCCAGACTGCACC3’(SEQ IDNO44)TFHC9sL5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGGG3’(SEQ ID NO45)TFHC9asL5’CCCCAGGCTTCTTCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’(SEQ ID NO46)TFHC8sP5’GCTGGTGCAGTCTGGACCTGAGGTGAAGAAGCC3’(SEQ ID NO47)TFHC8asP5’GGCTTCTTCACCTCAGGTCCAGACTGCACCAGC3’(SEQ ID NO48)TFHC10sK5’GCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTC3’(SEQ ID NO49)TFHC10asK5’GAAGCCCCAGGCTTCACCAGCTCAGGTCCAGACTGC3’(SEQ ID NO50)LV-15’CAGTCTGGACCTGAGGTGGTGAAGCCTGGG3’(SEQ ID NO51)LV-25’CCCAGGCTTCACCACCTCAGGTCCAGACTG3’(SEQ ID NO52)
D.人源化抗-TF抗体轻链的形成1.使用质粒pJAIgG4TF.A8(嵌合H36的表达载体)作为模板以及引物TFLC1s2.1与TFLC1as进行PCR扩增。此步骤在编码区上游引进了一个克隆位点，即AgeI。还在FR4中引进了L106I突变。此步骤产生构建体LC03。
2.使用互补引物TFLC5s与TFLC5as，并使用LC03作为模板，进行定点诱变。此步骤在FR2中引进突变Q37L，并增加了PstI位点，供诊断用。此新构建体称为LC04。
3.使用LC04作为模板，并使用引物TFHC2s与TFLC2as1进行PCR扩增。此步骤产生片段A，其将用于步骤6中。此步骤在FR1中引进Q11L与L15V突变。
4.使用LC04作为模板，并使用引物TFLC1s2.1与TFLC1asR进行PCR扩增。此方法在LC可变区末端引进KpnI位置。将此PCR片段克隆至pGEM中，产生pGEM04K，其将用于步骤6中。
5.使用LC04作为模板，并使用引物TFLC2s与TFLC4as进行PCR扩增。此步骤产生片段C，其将用于步骤6中。此步骤引进三种突变FR1中的E17D、S18R及FR4中的A100Q。
6.使用片段A与片段C作为模板以及引物TFHC2s与TFLC4as进行以PCR为基础的诱变，产生片段D。将片段D克隆至pGEM04K中，产生构建体LC05。
7.使用pGEM04K作为模板以及引物TFLC1s2.1与TFLC4as进行PCR扩增。此步骤产生片段H，随后将其克隆至pGEM04K中。此步骤在FR4中引进A100Q突变，该构建体被称为LC06。
8.使用LC06作为模板以及引物TFLC1s2.1与TFLC3as进行PCR扩增。此步骤产生片段I，其将用于步骤10。此步骤在FR3中引进了K70D与K74T突变。
9.使用LC06作为模板以及引物TFLC3s2与TFLC4as进行PCR扩增。此步骤产生片段F，其将用于步骤10。此步骤在FR3中引进了A80P突变。
10.使用片段I与片段F作为模板以及引物TFLC1s2.1与TFLC4as进行PCR，产生片段J。将片段J克隆至pGEM中，产生构建体LC07。
11.使用互补引物TFLC08sds与TFLC08sdsa，并使用LC07作为模板，进行定点诱变。此步骤在FR3中引进了突变V84A与N85T。此构建体称为LC08。
12.将LC05中含有突变Q11L、L15V、E17D、S18R与Q37L的AgeI至Eco 0109I片段克隆至LC08中。结果产生构建体LC09。
13.使用LC09作为模板以及互补引物LC105与LC103进行定点诱变。此步骤在FR3中引进了T85N突变，产生构建体LC10。
14.使用LC10作为模板以及互补引物LC115与LC113进行定点诱变。此步骤在FR3中引进了D70K突变，产生构建体LC11。
15.使用LC11作为模板以及互补引物LC125a与LC123a进行定点诱变。此步骤在FR2中引进了K42Q突变，产生构建体LC12。
在每一突变步骤之后，对所述部分人源化或完全人源化的LC克隆测序，稍后将其中有些可变区克隆至表达载体tKMC180中。
用于轻链人源化的寡核苷酸引物TFLC1as25’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCCAG3’(SEQ IDNO53)TFLC1s2.15’ACCGGTGATATCCAGATGACCCAGTCTCC3’(SEQ ID NO54)TFLC5s5’GGTTAGCATGGTATCTGCAGAAACCAGGG3’(SEQ ID NO55)TFLC5as5’CCCTGGTTTCTGCAGATACCATGCTAACC3’(SEQ ID NO56)TFHC2s5’TACGACTCACTATAGGGCGAATTGG3’(SEQ ID NO57)TFLC2as15’CCACAGATGCAGACAGGGAGGCAGGAGACTG3’(SEQ ID NO58)TFLC1asR5’TTCGAAAAGTGTACTTACGTTTGATCTCCAGCTTGGTACCAGCACCGAACG3’(SEQ ID NO59)
TFLC2s5’CCTGTCTGCATCTGTGGGAGATAGGGTCACCATCACATGC3’(SEQ ID NO60)TFLC4as5’GATCTCCAGCTTGGTACCCTGACCGAACGTGAATGG3’(SEQ ID NO61)TFLC3as5’GTAGGCTGCTGATCGTGAAAGAAAAGTCTGTGCCAGATCC3’(SEQ ID NO62)TFLC3s25’CACGATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGTAAATTATTACTGTC3’(SEQ ID NO63)TFLC08sds5’GCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAAG3’(SEQID NO64)TFLC08sdsa5’CTTGTTGACAGTAATAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGC3’(SEQID NO65)LC1055’CAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAAATTATTACTGTCAAC3’(SEQ IDNO66)LC1035’GTTGACAGTAATAATTTGCAAAATCTTCAGGCTGTAGGCTGCTG3’(SEQ IDNO67)LC1155’CAGTGGATCTGGCACAAAGTTTTCTTTCACGATCAGCAGC3’(SEQ ID NO68)LC1135’GCTGCTGATCGTGAAAGAAAACTTTGTGCCAGATCCACTG3’(SEQ ID NO69)LC125a5’CTGCAGAAACCAGGGCAATCTCCTCAGCTCCTG3’(SEQ ID NO70)LC123a5’CAGGAGCTGAGGAGATTGCCCTGGTTTCTGCAG3’(SEQ ID NO71)图5A显示了人类κ轻链恒定区的序列(SEQ ID NO.97)。图5B显示了人类IgG1重链恒定区的序列(SEQ ID NO.98)。图6A显示了hFAT(IgG4)恒定区序列(SEQ ID NO.99)。图6B提供了人类IgG4重链恒定区(SEQ ID NO.100)。有关上述免疫球蛋白恒定区序列的进一步内容也可参见USSN Nos.09/990,586与60/343,306。
实施例2-人源化抗-TF抗体的表达与纯化将部分人源化或完全人源化的LC与HC克隆克隆至表达载体中。使用质粒tKMC18来表达与人类κ链融合的LC突变体，使用pJRS355或pLAM356载体来表达与人类IgG1或IgG4的Fc融合的HC突变体。将HC与LC克隆的有些组合共转染至COS细胞中。采用ELISA分析COS细胞中暂时表达的IgG，评估IgG总产量及与TF的结合性。有关这些特定载体的公开内容可参见待审美国申请Nos.09/990,586与60/343,306。
将抗-TF重链与轻链可变区的最终完全人源化的形式(HC08与LC09的组合)克隆至称为Mega表达载体的载体中(pSUN34，参见图2)，转染至CHO与NSO细胞中，以表达IgG。克隆产生IgG4κ或IgG1源化抗-TF抗体的稳定转染细胞株。然后使用所选择的稳定细胞株来产生足量的人源化抗-TF供分析用。所得人源化形式约100％来自人类(当不考虑CDR序列时)。人源化IgG4κ形式(由pSUN35产生)被称为hFAT(humanized IgG Four Anti-Tissue Factor antibody)及IgG1κ形式(由pSUN34产生)被称为hOAT(humanized IgG One AntiSSUeFactor antibody)。cH36的这些完全人源化型可用于治疗慢性病，如癌症与炎症。
将表达hOAT(HC08与LC09的组合)的一株NSO细胞株(OAT-NSO-P10A7)解冻，加至含10ml补充10％FBS的IMDM培养基的15mL试管中，离心。将细胞离心块重悬浮于10mL新鲜培养基中，移至T25烧瓶中，于37℃与5％CO2下培养。为了制备足量细胞以接种中空纤维生物反应器，使细胞扩增至总数达6×108个细胞。依制造商的仪器手册指示设定生物反应器。对收集的细胞离心，再悬浮于60mL含35％FBS的IMDM中，注射至生物反应器的毛细管外空间。每天监测葡萄糖与乳酸盐浓度，对收集材料离心，合并。以ELISA分析法测试所收集的材料的抗-TF抗体浓度。合并含有抗-TF抗体(hOAT)的样本后，依下文说明的方法纯化与分析。
A.重组蛋白质ASepharose快速流动层析法重组体人源化抗-TF单克隆抗体由两条轻链与两条重链组成。重链为小鼠可变区(未改变或依上述人源化)与人类IgG1或IgG4Fc区的融合体，而轻链包含小鼠可变区(未改变或依上述人源化)与人类κ区。已知人类IgGFc区对蛋白质A或重组体蛋白质A(rProteinA)具有高度亲合性。
合并所收集的含人源化抗-TF抗体(hOAT)的材料，每毫升样本添加0.08ml 1M Tris-HCl，pH8.0调至pH8.0±0.1。然后经低蛋白质结合性的0.22微米滤器过滤样本(例如使用聚醚砜膜的Nalgene无菌一次性组织培养滤器单元，来自Nalge Nunc International，Cat.No.167-0020)。添加样本后，rProtein A柱(来自Pharmacia药厂)用5倍柱床体积的20mM Tris-HCl，pH8.0洗涤，以去除未结合的物质，如培养基蛋白质。由于所收集的培养基含有高含量的牛血清，因此采用分段pH梯度洗涤法，以去除柱中的牛IgG。该分段pH梯度是通过提高缓冲液B(100mM乙酸)在缓冲液A(100mM乙酸钠)中的相对百分比而形成的。典型的分段pH洗涤法采用20％、40％与60％缓冲液B。以100％缓冲液B溶脱柱，依据A280收集级分。合并的级分通过添加1M Tris碱而调至pH8.5。
B.Q Sepharose快速流动层析法除离子交换层析法为一种依据电荷来分离蛋白质的极有效方法。将来自rProtein A柱中的洗脱样品调整pH后以两倍体积的水稀释，并检查和调整pH至8.5。然后添加样本至已先经20mMTris-HCl，pH8.5平衡的5ml(1.6×2.5cm)Q Sepharose快速流动柱中，以(1)5倍床体积的20mM Tris-HCl，pH8.5；及(2)4倍床体积的含100mM NaCl的20mM Tris-HCl，pH8.5洗涤柱。然后用床体积的含500mM NaCl的20mM Tris-HCl，pH8.5洗脱IgG蛋白质。合并蛋白质峰，使用超滤装置将缓冲液更换成PBS。
采用相同转染法、细胞培养、与纯化法、制备hFAT并纯化。
实施例3-人源化抗-TF抗体的性质
A.人源化抗-TF抗体对TF功能的抑制作用抗-TF抗体的重要性质之一是其抑制组织因子引起的血液凝结的能力。以标准PT分析法测定纯化的hOAT与hFAT抑制TF活性的能力。PT分析法广泛用于测定依赖组织因子的凝血时间。此分析法的原理在于组织因子(TF)与血浆中的因子VIIa形成复合物。此复合物随后会活化因子X成为FXa；FXa再在因子Va与磷脂的存在下将凝血酶原转变成凝血酶。凝血酶最终导致形成血凝块。在标准PT分析法中，添加脂化的TF至血浆中，启动凝血过程，采用Organon Teknika Coag-A-Mate凝血分析仪或相当物记录凝血。
抗-TF抗体H36以一种独特机制抑制人类TF活性。其会结合TF(游离形式或与因子VIIa形成的复合物)。因此阻止因子X及IX与TFFVIIa复合物结合，进而阻断TFFVIIa对FX与FIX的活化作用(参见美国专利No.5,986,065)。PT试验法中，凝血时间因添加抗-TF抗体至人类血浆中而延长，清楚表示此依赖TF的凝血过程已受到抑制。凝血时间与TF活性的量相关。测定系列稀释的TF的PT凝血时间，制作TF标准曲线。由TF标准曲线的数据即可确定抗-TF抗体对TF活性的抑制作用。
试剂Innovin(Cat No 68100-392)与Ci-Trol凝血对照试剂(Coagulation Control)，I级(Cat No 68100-336)，来自VWR药厂。依美国专利No.5,986,065所述制造脂化的重组人类TF。
方法PT试验法是在37℃下，使用凝血分析仪进行的。添加0.2ml脂化重组体人类组织因子(例如Innovin)至含0.01ml缓冲液(50mMTris-HCl，pH 7.5，0.1％BSA)或抗-TF抗体的0.1ml人类血浆(Ci-Trol对照试剂，I级)中，起始PT反应。
1.依据制造商的指示，添加纯水至Innovin小瓶中。使试剂温热至37℃。若该试剂保存在4-8℃下时，可稳定存放几天。
2.添加1mL纯水至Ci-Trol的各小瓶中。混合以便溶解。若使用一个以上小瓶时，则合并至一个容器中(例如10ml试管)。1mLCi-Trol可用于5次分析(每次分析使用2×0.1ml＝0.2ml)。Ci-Trol可保存在冰上，可维持几小时。
3.使用50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％BSA，由抗-TF抗体贮液中制备一系列抗-TF抗体溶液(200nM至1600nM)。
4.添加10μl 50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％BSA或10μl稀释的抗-TF至各含有0.1mlCi-Trol的双孔测光管的每一孔中。使用附有0.1ml吸头的吸液管混合各孔。确保各孔中没有气泡。混合抗-TF(或缓冲液)与血浆(Ci-Trol)后，添加0.2ml Innovin至血浆中，于10分钟内测定凝血时间。
5.制作TF标准曲线时，首先使用50mM Tris-HCl，pH7.5，0.1％BSA稀释Innovin(100％TF)至20％、10％、5％及2.5％。然后依步骤4所述进行PT分析法，但其中改用稀释的Innovin样本。
表3中概括cH36、hOAT与hFAT对PT凝血时间的影响。与表4的数据相比，cH36、hFAT与hOAT对TF功能展现极强的抑制作用。蛋白质浓度高于12.9nM时，所有抗体均达到约95％抑制作用。表3的结果还显示，采用上述方法对抗-TF(即cH36)人源化，对cH 36的抑制活性没有任何显著影响，因为hFAT与hOAT两者抑制依赖TF的凝血作用的能力极类似cH36。
表3嵌合(cH36)与(人源化)抗-TF抗体(hFAT与hOAT)#对凝血酶原时间的影响

#所有分析法均使用与表4相同的100％TF活性(浓度)样本。
表4 凝血时间与相对组织因子活性(浓度)

B.亲合常数的测定人源化抗-TF抗体对TF的亲合性采用表面胞质基因组共振分析法(BIAcore，来自Pharmacia Biosensor公司)，使用共价固定在CM5感应芯片上的重组体人类组织因子测定。亲合常数是由四种抗-TF单克隆抗体浓度(0.125nM、0.25nM、0.5nM与1nM)依据BIAcore电脑软件计算得到的平均值。表5中的结果显示，采用上述方法人源化抗-TF，cH36，对cH36与TF的亲和性没有任何显著影响，因为cH36与hFAT两者对TF具有类似的亲和性。
表5 抗-TF抗体的表观亲合性与解离常数

实施例4-抗-LTA抗体的人源化A.嵌合抗-LTA抗体B.抗-LTA抗体的人源化策略嵌合抗-LTA(脂磷壁酸质)抗体A110的人源化采用“FR最佳匹配”法进行。此方法充分利用了在公开数据库中有大量已知氨基酸序列的人类IgG可变区可供利用这一事实。将A110中小鼠重链与轻链可变区的单个构架区与Kabat数据库(参见http//immuno.bme.nwu.edu)中相应的人类构架进行比较。采用下列标准来选择用于人源化的所需人类IgG构架(1)尽可能使不匹配的氨基酸数量降低。(2)保持“游标”区内的氨基酸不改变(此区内的氨基酸可调整CDR结构并微调其与抗原的配合性，参见Foote，J.and Winter，G.，J.of Mol.Bio.224(2)487-499 )。(3)当评估类似候选物时，以保守性氨基酸取代作用优先。用于此比较法的匹配程式可参见Kabat互联网主页。该程式在数据库中找出小鼠序列与人类序列之间的同源区。并进行比较。采用此独特FR最佳匹配方法，预计目标IgG的人源化LC或HC可变区的所有四个FRs可能仅来自一个人种IgG分子，或者来自多达四种不同的人类IgG分子。
B(i)人类IgGκ-轻链可变区构架的选择将A110 LC各构架区氨基酸序列与Kabat数据库中的人类IgGκ轻链可变区的相应FR氨基酸序列进行比较。依据上述三个标准选择最佳匹配FR。
选出Kabat数据库ID No.036047的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行A110 LC FR1与FR3的人源化。选出Kabat数据库ID No.037658的人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列进行A110 LC FR2的人源化，并选出ID No.004763进行FR4的人源化。在A110 LC中产生下列突变，使之符合人类IgGκ轻链可变区的氨基酸序列D1变成Q，S5变成T，L11变成M，M21变成I，S42变成Q，R76变成A，V77变成M及M102变成K。(有关序列信息参见表6)。
B(ii)人类IgG重链可变区构架的选择将A110 HC的各构架区氨基酸序列与Kabat数据库中人类IgG重链可变区的相应FRs的氨基酸序列进行比较。依据上述三个标准选择最佳匹配FR。
选出Kabat数据库ID No.000468的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行A110 HC FR1的人源化。选出Kabat数据库ID No.000565的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行A110 HC FR2的人源化。选出Kabat数据库ID No.000628的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行A110 HC FR3的人源化。选出Kabat数据库ID No.031571的人类IgG重链可变区的氨基酸序列进行A110 HC FR4的人源化。在A110 HC FR1中产生下列突变法，使之符合Kabat数据库ID No.000468的人类IgG重链可变区的氨基酸序列M3变成Q，及K15变成G。A110 HC FR2没有必要为了符合Kaba t数据库ID No.000565 FR2序列而进行改变。在A110 HC FR3中产生下列6种突变，使之符合Kabat数据库ID No.000628中的人类IgG重链可变区的氨基酸序列Q78变成K；S79变成N，M80变成S，N87变成S，M95变成V及V99变成A。在A110 HC FR4中产生一种突变L119变成V，使之符合Kabat数据库ID NO.031571中的人类IgG重链可变区的氨基酸序列(有关序列信息参见表7)。
表6 A110(SEQ ID NO109)与人类轻链(LC)(SEQ ID NO127)FR序列的比较表6A

表6B

表7 A110(SEQ ID NO118)与人类重链(HC)(SEQ ID NO123)FR序列的比较表7A

表7B

一旦确定了所需的人类构架后，即采用下列三种技术在轻链与重链上进行所需的氨基酸取代(1)采用一般PCR进行克隆，以便引入克隆性或诊断性限制性内切核酸酶位点，并改变位于可变区末端的氨基酸残基。(2)采用PCR诱变法，一次改变多个氨基酸残基，当这些残基位于可变区中间时尤可如此。(3)采用定点诱变法，一次引进1或2个氨基酸取代。定点诱变法依Stratagene公司的“QuickChangeSite-Directed MutagenesisKit”(Catalog # 200518)所描述的方法进行。
在每一步骤之后，对所述部分人源化的克隆测序，稍后将其中有些可变区克隆至表达载体中。采用质粒tKMC180来表达LC突变体，采用pJRS 335来表达HC突体为IgG1。随后将有些这样的克隆组合在一起，再于COS细胞中瞬时表达。
将抗-LTA轻链与重链可变区的最终完全人源化的形式克隆至有时候称为“mega载体”的载体中，并转染至COS细胞中，以表达IgG，并分析LTA结合性。
C.人源化抗-LTA抗体重链的制备1.使用质粒pJRS334(A110的表达载体)作为模板以及引物HChuF1与HChuR2 PCR扩增抗-LTA mAb A110重链(HC)可变区，并克隆至pGEMT-easy(Promega)中。引物HChuF1在可变区的第一个密码子上游引进一个BsiW1位点，并在构架(FR)1中引进一个氨基酸变化，即由M3变成Q。引物HChuR2在FR4中引进一个氨基酸变化，即由L119变成V，为引进一个供克隆用的C末端EcoRI作为BsiWI至EcoRI的限制性切割片段限制性位点。此步骤得到构建体pJRS362。将此片段亚克隆至表达载体pJRS355中，产生pJRS370。
2.使用质粒pJRS334(A110的表达载体)作为模板以及引物HChuF1与HChuR1(用于N-末端片段)和引物HChuF2与HChuR2(用于C-末端片段)，PCR扩增抗-LTA mAb A110重链(HC)可变区片段。PCR产生的可变区片段在FR3中含有另两个突变即N87变成S及M95变成V。将此片段克隆至pGEM T-Easy中，产生构建体pJRS364。
3.采用QuikChange系统(Stratagene)进行定点诱变，在重链可变区中引进另一个突变。将一对互补引物JSS80与JSS81与质粒pJRS364组合，用Pfu Turbo DNA聚合酶扩增。使用DpnI消化产物后，使用此DNA转化大肠杆菌XL1B细胞。此操作导致在FR3中产生了V99变成A的突变，此构建体称为pJRS373。将此片段作为BsiW1至EcoRI限制性切割片段克隆至表达载体pJRS355中，产生质粒pJRS380。
4.采用Quik Change系统(Stratagene)进行定点诱变法，在重链可变区中引进另一个突变。将一对互补引物JSS82与JSS83与质粒pJRS373组合，使用Pfu Turbo DNA聚合酶扩增。消化产物后，使用此DNA转化大肠杆菌XL1B细胞。此操作法导致在FR1中产生了K15变成G的突变，此构建体称为pJRS378。将此片段作为BsiWI至EcoRI限制性切割片段克隆至表达载体pJRS355中，产生质粒pJRS381。
5.使用质粒pJRS381(A110的突变HCV的表达载体)作为模板，PCR扩增抗-LTA mAb A110重链(HC)可变区片段。对于N-末端片段使用引物MV-HC Leader与JSS87，对于C-末端片段使用引物JSS86与HCV Back。此PCR产生的可变区片段在FR3中含有3种其他突变Q78变成K，S79变成N，及M80变成S。将此片段作为BsiWI至EcoRI限制性切割片段克隆至pJRS355，产生构建体pJRS383。
用于重链人源化的引物D.人源化抗-LTA抗体轻链的制备1.使用质粒pJRS334(A110的表达载体A110)作为模板以及引物LChuF1与LChuR3，PCR扩增抗-LTA mAbA110重链(LC)可变区，并克隆至pGEM T-easy(Promega)中。引物LChuF1在可变区的第一个密码子上游引进一个AgeI位点，并在构架1中引进下述氨基酸变化由D1变成Q，S5变成T。引物LChuR3在FR4中引进一个氨基酸变化，即由M102变成L，并引进一个供克隆用的C末端BstBI限制性切割位点。此步骤产生构建体pJRS363。
2.使用质粒pJRS334(A110的表达载体)作为模板以及引物LChuF1与LChuR1(对于一个N-末端片段(LCN1))和引物LChuF1与LChuR2(对于第二个N-末端片段(LCN2))，PCR扩增抗-LTA mAb A110轻链(LC)可变区片段。使用引物LChuF2与LChuR3得到一种C-末端片段(LCC1)，使用LChuF3与LChuR3得到另一种C-末端片段(LCC2)，共得到两种C-末端片段。还使用引物LChuF2与LChuR2产生PCR之内部片段(LCI)。
3.使用片段LCN1与LCC1作为模板以及LChuF1与LChuR 3作为引物，进行PCR反应，将所得产物克隆至pGEM T-easy中，得到质粒pJRS365。此反应在FR2中引进另一个突变S41变成Q。
4.使用片段LCN2与LCC2作为模板以及LChuF1与LChuR3作为引物，进行PCR反应，将所得产物克隆至pGEM T-easy中，产生质粒pJRS366。此反应在FR3中引进另两个突变R76变成A，V77变成M。
5.使用片段LCI与LCC2作为模板以及LChuF1与LChuR3作为引物进行PCR反应。使用此新片段及LCN1作为模板以及LChuF1与LChuR3作为引物，进行第二次PCR。将所得产物克隆至pGEMA T-easy中，产生质粒pJRS367。此过程将所有轻链突变合并到一个轻链可变区片段中。
6.然后利用PCT将所有LC可变区克隆中的L102转变成K。使用质粒pLRS363、365、366与367作为模板，利用引物LChuF1与LChuR4再扩增可变区。再度将所得产物克隆至pGEM T-easy中，得到质粒pJRS363K、365K、366K与367K。
7.随后将所有四种人源化可变区作为AgeI至BstBI限制性切割片段克隆至轻链表达载体tKMC180中。将供哺乳动物细胞中表达各种突变轻链的最终构建体称为pJRS374、375、376与377。
8.使用质粒pJRS376(用于含有6种突变的人源化A110轻链的表达载体)作为模板以及引物MV-LC Leader与JSS89(对于N-末端片段(LCN1))及引物JSS90与LC reverse(对于C-末端片段)，PCR扩增抗-LTA mAb A110轻链(LC)可变区片段。使用这些片段作为模板以及引物MV-LC Leader与LC reverse进行PCR反应，产生含有突变L11→M及M21→I的产物。然后将这些产物作为AgeI至BstBI限制性切割片段克隆至tKMC180中，产生质粒pJRS384。
上述所有表达载体构建体在使用COS细胞的共转染实验中均展现有能力表达抗体的阳性反应。所有人源化重链与轻链A110可变区的组合在ELISA试验中测试时均可与LTA结合。随后构建组合表达载体，亦即同时具重链与轻链编码区的单一质粒。由自pJRS383与pJRS384切割的可变区制得的包含所有16个突变(8个在重链上，8个在轻链上)的最终表现质粒，称为pJRS394。由ELISA实验可见，当此质粒用于转染COS细胞时，所产生的抗体可以结合LTA。
用于克隆的引物名称寡核苷酸序列HC-MV Leader GGAGACCCAAGCTTGTTAAC(SEQ ID NO128)HCV back CCCAGAGGTGCTCTTGGAG(SEQ ID NO129)HChuF1 TGTTTTCGTACGTCTTGTCCGAAGTGCAGCTGGTGGAGTCTG(SEQ ID NO130)HChuF2 GAACAGCTTGAAAACTGAGGACACAGCCGTGTATTACTGTGTGAGAC (SEQ IDNO131)HChuR1 AATACACGGCTGTGTCCTCAGTTTTCAAGCTGTTCATTTGCAGATAGAGCATG(SEQ ID NO132)HChuR2 AATTCTGAATTCTGAGGAGACGGTCACTGAGGTTCCTTGACCCC(SEQ ID NO133)JSS80 CAGCCGTGTATTACTGTGCGAGACGGGGGGCTTC(SEQ ID NO134)JSS81 GAAGCCCCCCGTCTCGCACAGTAATACACGGCTG(SEQ ID NO135)JSS82 GGATTGGTGCAGCCTGGCGGGTCATTGAAACTCTC(SEQ ID NO136)JSS83 GAGAGTTTCAATGACCCGCCAGGCTGCACCAATCC(SEQ ID NO137)
JSS84 GAGGCTCTGCACAACCGCTTCACGCAGAAGAGCCTCTCC(SEQ ID NO138)JSS85 GGAGAGGCTCTTCTGCGTGAAGCGGTTGTGCAGAGCCTC(SEQ ID NO139)JSS86 GATTCAAAAAACAGCCTCTATCTGCAAATGAACAACTTG(SEQ ID NO140)JSS87 CAGATAGAGGCTGTTTTTTGAATCATCTCTGGAGATGG(SEQID NO141)LC-MV Leader GAGACCCAAGCTTGGTACC(SEQ ID NO142)LC reverseCTGACTTTAACTCCTAACATG(SEQ ID NO143)JSS88 AATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACAATCACTTGCAGGGCCAGCTC(SEQ ID NO144)JSS90 CAAGTGATTGTGACCTTTTCCCCTGGAGATGCAGACATGATTGCTGGAGACTGGGAG(SEQ ID NO145)LChuF1ACTTATACCGGTCAGATCGTTCTCACCCAGTCTCCAGCAATC(SEQ ID NO146)LChuF2ACCAGCAGAAGCCAGGATCCCAGCCCAAACCCTGGATTTCTG(SEQ ID NO147)LChuF3CAGCGCAATGGAGGCTGAAGATGCTGCC(SEQ ID NO148)LChuR1TTGGGCTGGGATCCTGGCTTCTGCTGG(SEQ ID NO149)LChuR2CTTCAGCCTCCATTGCGCTGATTGTGAGAGAGTAAG(SEQ ID NO150)LChuR3ATTACCTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTTATTTCCAGGTTGGTCCCCCCTCCGAAC(SEO ID NO151)LChuR4ATTACCTTCGAAAAGTGTACTTACGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAAC(SEQ ID NO152)实施例5-人源化抗-LTA抗体的表征A.重组体人源化c96-110抗体变体的瞬时产量为了分析抗-LTA抗体的人源化形式的特征，采用Superfect(Qiagen)，依制造商的指示，在6孔组织培养孔中将质粒pJRS334、391、392、393与394(参见图10)转染至COS细胞中。质粒pJRS334编码c96-110抗体，质粒pJRS391-4编码c96-110的人源化变体。2天后，分析上清液中嵌合抗体的产量。然后分析这些抗体，确定所表现的抗体结合金黄色葡萄球菌(S.aureus)LTA抗原的能力。
抗体产量分析法在来自96孔微滴定板的8孔长条板中进行(MaxisorpF8；Nunc，Inc.)，孔中涂覆了1∶500稀释的山羊抗人类Fc(Pierce)。分析板上覆盖压力敏感式薄膜，于4℃下温育一夜。然后用洗涤溶液(咪唑/NaCl/0.4％Tween-20)洗涤分析板一次。再将100微升瞬时转染的COS细胞的培养物上清液稀释液加至复制孔中，于室温下在分析板旋转器上温育60分钟。以洗涤溶液洗涤分析板7次。在样本/缀合物稀释液中以1∶4000稀释山羊抗-人类IgG H+L-HRP(Zymed)缀合物，取100微升各稀释液加至各样本中，然后于室温下在分析板旋转器上温育60分钟。依上述洗涤样本后，于室温下与100μL/孔ABTS显色底物(BioFx)温育1分钟。添加100μL/孔Quench缓冲液(BioFx)终止反应，使用自动化微量滴定板ELISA读数仪测量405nm下的吸光度(参见表8与图11的结果)。此分析法证实，用这些质粒构建体转染COS细胞能得到产生同时包含人类IgG与κ区的分子的细胞。与采用人类单克隆IgG1(浓度0.5μg/mL至0.04μg/mL)的标准曲线系列稀释液进行比较，估测各细胞上清液中的大致抗体浓度。
表8.COS细胞中的抗体产量(O.D.450nm)稀释度 pJRS391 pJRS392 pJRS393 pJRS394 pJRS3341∶11.011.091.14 12 1.051∶20.560.650.75 0.880.681∶40.360.440.52 0.570.411∶80.170.340.33 0.360.271∶16 0.130.190.23 0.260.18B.以人源化变体分析抗体与LTA的结合性取来自瞬时转染的COS细胞的含抗体培养物上清液，分析所表达的抗体与金黄色葡萄球菌LTA结合的能力。该活性分析法在来自96孔微滴定板(Maxisorp F8；Nunc，Inc.)的8孔长条板中使用PBS进行，孔中涂覆1μg/mL金黄色葡萄球菌LTA(Sigma)。覆盖分析板，于4℃下培养一夜。然后以PBS洗涤分析板一次。然后添加100微升培养物上清液稀释液至双份孔中，于室温下在分析板旋转器上培养60分钟。以洗涤溶液洗涤分析板7次。以样本/缀合物稀释液按1∶4000稀释山羊抗-人类IgGH+L-HRP(Zymed)共轭物，取100微升稀释液加至各样本中，然后于室温下在分析板旋转器上培养60分钟。依上述洗涤样本后，于室温下在分析板旋转器上与100μL/孔ABTS显色底物(BioFx)培养10-15分钟。添加100μL/孔Quench缓冲液(BioFx)终止反应，使用自动化微量滴定板ELISA读数机测量405nm下的吸光度(参见表9与图1中的结果)。此分析法证实经这些质粒构建体转染细胞得到了可产生可比水平的人源化A110抗体的细胞。
表9.抗体结合性分析法(O.D.450nm)

C.采用表面胞质基因组共振(SPR)分析法测定c96-110的亲合常数随后采用表面胞质基因组共振分析法测定这些抗体，以分析它们对金黄色葡萄球菌LTA抗原的结合能力。由表10中所示结果可见，pJRS391所产生的人源化A110抗体对LTA的结合能力与其亲代抗体A110(或c96-110)相当。因此，人源化形式对LTA的表观结合亲合性一定类似其亲代。
C-1囊泡制备与固定依Kalb等人的Biochemica et Biophysica Acta(1992)1103，307-316所说明的方法制备含脂磷壁酸质(LTA)的囊泡。简言之，将含磷脂酰乙醇胺亚麻酰-棕榈酰(PE-L-P，SIGMA，St.Louis，MO)的氯仿溶液在真空下蒸发至干。添加BIAcore洗脱剂(HBS)与来自金黄色葡萄球菌的LTA(SIGMA，St.Louis MO)，制成含0.2mM PE-L-P的HBS溶液与含1％LTA的PE-L-P溶液。激烈涡旋混合后，使溶液通过聚碳酸酯滤纸(孔径0.1μm，Nucleopore Corning)8次。立即将此溶液注射至BIAcore HPA芯片(BIAcore Inc.Pisctaway，NJ)上，直到得到约1400RU平台。囊泡会自发融合至HPA芯片表面上。
C-2.SPR分析法于加装了已涂覆PE-L-P/1％LTA的HPA芯片的BIAcore仪器(BIAcoreInc.，Piscataway，NJ)上测定结合动力学。在表面上注入不同浓度的c96-110。由于芯片表面无法再生，因此每个表面仅注射一次。以BIA分析软体2.0(BIAcore Inc.，Piscataway，NJ)，采用1至2种结合模式测定结合及解离速率。
表10.c96-110对不同浓度LTA的表观亲合常数

实施例6.采用本发明FR最佳匹配法人源化的抗-TAC抗体的电脑比较为了比较各种方法，将文献中已公开并进行的人源化法得到的特异性抗体与采用最佳匹配FR进行人源化得到的特异性抗体进行比较。当过去进行最初的人源化工作时，Kabat数据库不如进行此insilico比较时来得详尽。数据库的扩充增加了可参与进行最佳匹配法的构架的数量。为了校正因扩充数据库而造成的偏差，进行修正的最佳匹配搜索法，并给出了结果。
此实施例中，对抗-TAC抗体进行比较。In silico人源化展示在表11与12。各表第一行中，报导了起始的鼠抗体序列，第二行为原始人源化抗体序列(Queen等人的PNAS8610029-10033(1989))，其中对于轻链可变区而言最佳匹配的构架为035921，对于重链可变区而言是035918。各表中第三行显示此比较时所确定的优选最佳匹配构架。最后一行显示使用FR最佳匹配法时优选的序列。
进行此比较时，FR最佳匹配法的好处可由检查所需氨基酸取代总数、需要改变的游标残基数量及总体同源性分数体现。通过尽量减少氨基酸取代数量，可降低真正人源化法所涉及的时间、成本与劳力。通过鉴定出其中保留游标残基作为优选氨基酸的FRs，可尽量降低对CDRs构象的有害影响，这可将对抗体结合亲合性的影响降至最低。与其他基于构架的方法相比较可见，FR最佳匹配法中的轻链与重链构架具有更好的总体同源性分数(也即同源性％)。
对于抗-TAC抗体，原始人源化法主要基于选择035921与035918分别作为轻链与重链的最佳匹配构架。此人源化需要取代轻链构架内86个氨基酸中的28个(其中5个为游标残基)及重链构架内87个氨基酸中的29个(其中5个为游标残基)。采用已扩充的Kabat数据库时，CEA4-8A(004752)构架与轻链最佳匹配，A10(045903)抗体与重链最佳匹配(采用放松的标准，其假设轻链与重链可变区构架不必来自同一抗体)。此结果比原始的人源化抗-TAC更匹配，所需的总取代数更少(30对57)，游标区残基的变化更少(4对10)，并且同源性更好。但FR最佳匹配法产生更优异的结果，其仅需要取代23个氨基酸，其中只有3个为游标残基。鼠抗-TAC与原始的人源化抗-TAC之间的总体同源性为74.3％。使用扩充的数据库可将总体同源性提高至86.5％，但当采用FR最佳匹配法时，则提高至89.6％。
抗-TAC轻链的人源化方法的比较aa变化游标 同源性％Hu Anti-TAC 28/1065 73.6％CEA4-8A(004752) 24/1063 77.4％最佳匹配FR 18/1062 83％抗-TAC重链的人源化方法的比较Aa变化游标同源性％Hu Anti-TAC 29/1165 75％A10(045903) 6/116 1 94.8％最佳匹配FR 5/116 1 95.7％抗-TAC可变区的人源化方法的总体比较
Aa变化游标同源性％Hu Anti-TAC57/222 10 74.3％A10(045903)30/222 4 86.5％FR最佳匹配 23/222 3 89.6％表11.包括FR最佳匹配法方法(SEQ ID NO156)与人源化的抗-TAC轻链(huAnti-TAC)(SEQ ID NO154)、muAnti-TAC(SEQ ID NO153)和CEA4-8A(SEQ ID NO155)的比较表11A

表11B

表12.包括FR最佳匹配法的方法(SEQ ID NO160)与人源化的抗-TAC重链(huAnti-TAC)(SEQ ID NO158)、muAnti-TAC(SEQ ID NO157)和A10(045903)(SEQ ID NO159)的比较表12A

表12B

实施例7.本发明的FR最佳匹配法与Mc3抗体的in silico人源化的比较与上述实施例中一样，在本实施例中以in silico方式重新检查第二种人源化抗体，以比较此抗体所采用的人源化法与FR最佳匹配法的人源化法。为了校正因扩充数据库而造成的偏差，进行修正的最佳匹配搜索法，并给出了结果。
此实例中，以Mc3抗体进行比较。In silico人源化结果示于表13与14中。各表中第一行显示起始的鼠抗体序列，第二行为原始人源化抗体序列(美国专利No.5,639,641)。各表中第三行显示此比较时所确定的优选最佳匹配构架。最后一行显示使用最佳匹配FR法所优选的序列。
Mc3抗体的原始人源化法公开于美国专利No.5,639,641中。此人源化方法需要取代轻链构架内107个氨基酸中的16个残基(其中没有任何一个是游标残基)及重链构架内117个氨基酸中的14个残基(其中没有任何一个是游标残基)。使用扩充的Kabat数据库，VL克隆47(024300)构架与轻链可变区最佳匹配，A10(045903)抗体与重链可变区最佳匹配(采用放松的标准，其假设该轻链与重链可变区构架不必来自同一抗体)。即使使用这些构架，其所产生的in silico，人源化，抗体仍不如原始的人源化抗体。其原因为原始人源化Mc3的原始方法建议进行其他额外变化所致。来自in silico人源化法的最佳匹配构架将需要取代35个氨基酸，而原始的人源化法仅需改变30个氨基酸。这两种人源化法均不需改变游标区残基。但本发明的FR最佳匹配法却产生更好的结果，其仅需要取代26个氨基酸，且不改变游标残基。鼠Mc3与in silico人源化实例之间的总体同源性为82.2％，而原始人源化Mc3则为85％。本发明FR最佳匹配法的总体同源性最佳，达89.7％。
Mc3轻链人源化方法的比较aa变化游标同源性％huMc3(037000) 16/107 0 85％构架(024300)19/107 0 82.2％最佳匹配FR 15/117 0 87.2％Mc3重链人源化方法的比较aa变化游标同源性％huMc3(037000)14/117 0 88％构架(045903) 16/117 0 86.3％最佳匹配FR 15/117 0 87.2％Mc3可变区人源化方法的总体比较aa变化游标 同源性％huMc3(037000)30/224 0 86.6％构架(045903) 35/224 0 84.4％最佳匹配FR 26/224 0 88.4％
表13.人源化Mc3轻链(HuMc3-LC)(SEQ ID NO162)和使用Immunogen’s模板的Mc3-LC(SEQ ID NO161)与构架最适合匹配(SEQ ID NO103)及FR最适合匹配法(SEQ ID NO164)的比较表13A

表13B

表14.人源化Mc3重链(HuMc3-HC)(SEQ ID NO166)和使用Immunogen模板的Mc3-HC(SEQ ID NO165)与构架最佳匹配(SEQ ID NO167)和FR最佳匹配法(SEQ NO NO168)的比较表14A

表14B

实施例8.抗-TF抗体人源化的in silico比较构架相对于FR最佳匹配法使用来自上述实施例1的抗体进行人源化方法的另一种比较。将由采用整个构架的方法得到的最佳匹配结果抗-TF抗体所使用的FR最佳匹配法的结果比较。同样地，与原始人源化相比更近地于电脑上进行这一比较，所得最佳匹配结果并不一定会与实施例1的结果相同，因为Kabat数据库会扩充，可提供具有更好适配性的FR。尽管如此，其结论仍是FR最佳匹配法具有优于构架最佳匹配法的优点。
当进行搜索来鉴定最佳匹配构架时，其结果示于表15与16中。表中第一行显示原始鼠单克隆抗体序列，第二行为实施例1中人源化抗-TF抗体的原始FR最佳匹配序列，第三行显示最佳匹配构架的序列，第四行为更近期使用FR最佳匹配法所确定的最佳匹配序列。抗-FT抗体轻链的最佳匹配构架(表15)为scF11(041950)，其需要取代13个氨基酸，其中改变1个游标区残基，同源性为87.9％。抗-TF抗体轻链最近更新的最佳匹配FR为FR1是041950，FR2是019308，FR3是038233，FR4是036038，其需要取代10个氨基酸，其中改变0个游标区残基，同源性为90.7％。抗-TF抗体重链的最佳匹配构架(表16)为A10(045903)，其需要取代20个氨基酸，改变1个游标区残基，同源性为82.9％。抗-TF抗体重链的最佳匹配FR为FR1是000042，FR2是023960，FR3是045903，FR4是047722，其需要取代15个氨基酸，改变0个游标区残基，同源性为87.2％。FR最佳匹配法总体需要取代25个氨基酸，不需改变游标区残基，同源性为88.8％，与之相比，构架最佳匹配法则需要取代33个氨基酸，改变2个游标区残基，同源性为85.3％。
抗-TF可变区的人源化方法的总体比较aa变化游标％同源性实施例1 30/224 0 86.6构架 33/224 2 85.3FR最佳匹配法 25/224 0 88.8
表15.人源化抗TF轻链(CH36-LC)(SEQ ID NO72)和人类-LC(SEQ ID NO79)与使用构架最佳匹配法(SEQ ID NO169)和FR最佳匹配法(SEQ ID NO170)的比较表15A

表15B

表16.人源化抗TF重链(CH36-HC)(SEQ ID NO83)和人类-HC(SEQ ID NO91)与使用构架最佳匹配法(SEQ ID NO171)和FR最佳匹配法(SEQ ID NO172)的比较表16A

表16B

实施例9.抗-LTA抗体人源化的in silico比较构架最佳匹配法相对于FR最佳匹配法使用来自上述实施例3的抗体进行人源化方法的另一种比较。将采用完整构架方法得到的最佳匹配结果与抗LTA抗体(A110)所使用的FR最佳匹配汉的结果比较。如实施例8所示，与原始人源化相比更为近期地in silico比较，所得的最佳匹配结果并不一定会与实施例3的结果相同，因为Kabat数据库会扩充，提供匹配性更好的FR。此例中，在早期的人源化法和最近的in silico比较得到的最佳匹配FR均相同。然而，其结果同样支持FR最佳匹配方法具有优于构架最佳匹配法的优点这一结论。
当进行搜索来鉴定最佳匹配构架时，其结果示于表17与18中。表中第一行显示原始鼠单克隆抗体序列，第二行为实施例4的人源化抗-LTA抗体的原始FR最佳匹配序列，此结果与最近进行的FR最佳匹配搜索法的结果相同，第三行显示最近确定的最佳匹配构架的序列。抗-LTA抗体轻链可变区的最佳匹配构架(表17)为036047，其需要在107个氨基酸中取代13个氨基酸，改变2个游标区残基，同源性为87.9％。抗-LTA抗体轻链的最佳匹配FR为FR1是036047，FR2是037658，FR3是036047，FR4是004763，其需要取代9个氨基酸，改变0个游标区残基，同源性为91.6％。抗-LTA抗体重链可变区的最佳匹配构架(表18)为028897，其需要在123个氨基酸中取代15个氨基酸，改变4个氨基酸游标区残基，同源性为87.8％。抗-LTA抗体重链的最佳匹配FR为FR1是000468，FR2是000565，FR3是000628，FR4是031571，其需要取代9个氨基酸，改变2个游标区残基，同源性为92.7％。FR最佳匹配法总体需要取代18个氨基酸，改变2个游标区残基，同源性为92.2％，相比之下，构架最佳匹配法则需要取代28个氨基酸，改变6个游标区残基，同源性为87.8％。
表17.人源化抗-LTA轻链(A110-LC)(SEQ ID NO109)和(人类-LC)(SEQ ID NO127)与使用构架最佳匹配法(SEQ ID NO173)的比较表17A

表17B

表18.人源化抗LTA重链(A110-HC)(SEQ ID NO118)和(人类-HC)(SEQ ID NO123)与使用构架最佳匹配法(SEQ ID NO174)的比较表18A

表18B

本发明已参考优选的实施方案进行了详细说明。然而，可以理解，本领域普通技术人员在参考其公开内容后可以在本发明的精神与范围内进行修饰与改良。
序列表(1)一般资料(i)申请人(ii)发明名称免疫系统分子的人源化方法(iii)序列数26(iv)联系地址(A)地址(B)街名(C)市名(D)州名(E)国名(F)邮政编码(v)电脑读取形式(A)介质类型软盘(B)电脑IBM兼容型(C)操作系统DOS(D)软体Fast SEQ 1.5版(vi)最新申请信息(A)申请号(B)申请日(C)分类(vii)在先申请信息(A)申请号(B)申请日(viii)律师/代理人资料(A)姓名(B)注册编号(C)参考/档案编号(ix)通讯资料
(A)电话(B)传真(C)电报(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO1GACATTCAGA TGACCCAGTC TCCTGCCTCC CAGTCTGCAT CTCTGGGAGA AAGTGTCACC 60ATCACATGCC TGGCAAGTCA GACCATTGAT ACATGGTTAG CATGGTATCA GCAGAAACCA 120GGGAAATCTC CTCAGCTCCT GATTTATGCT GCCACCAACT TGGCAGATGG GGTCCCATCA 180AGGTTCAGTG GCAGTGGATC TGGCACAAAA TTTTCTTTCA AGATCAGCAG CCTACAGGCT 240GAAGATTTTG TAAATTATTA CTGTCAACAA GTTTACAGTT CTCCATTCAC GTTCGGTGCT 300GGGACCAAGC TGGAGCTGAA A321(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度107个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端
(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO2Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Gln Ser Ala Ser Leu Gly15 10 15Glu Ser Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp Thr Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Lys Phe Ser Phe Lys Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Phe Val Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe85 90 95Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys100 105(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度351个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO3GAGATCCAGC TGCAGCAGTC TGGACCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCTTC AGTGCAGGTA 60TCCTGCAAGA CTTCTGGTTA CTCATTCACT GACTACAACG TGTACTGGGT GAGGCAGAGC 120CATGGAAAGA GCCTTGAGTG GATTGGATAT ATTGATCCTT ACAATGGTAT TACTATCTAC 180GACCAGAACT TCAAGGGCAA GGCCACATTG ACTGTTGACA AGTCTTCCAC CACAGCCTTC 240ATGCATCTCA ACAGCCTGAC ATCTGACGAC TCTGCAGTTT ATTTCTGTGC AAGAGATGTG 300ACTACGGCCC TTGACTTCTG GGGCCAAGGC ACCACTCTCA CAGTCTCCTC A 351(2)SEQ ID NO4的资料(i)序列特征(A)长度117个氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO4Glu Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Gln Val Ser Cys Lys Thr Xaa Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr20 25 30Asn Val Tyr Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu TrpIle3540 45Gly Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe50 55 60Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Phe65 70 75 80Met His Leu Asn Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr100 105 110Leu Thr Val Ser Ser115(2)SEQ ID NO5的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO5
Leu Ala Ser Gln Thr Ile Asp15(2)SEQ ID NO6的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO6Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp1 5(2)SEQ ID NO7的资料(i)序列特征(A)长度9个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO7
Gln Gln Val Tyr Ser Ser Pro Phe Thr1 5(2)SEQ ID NO8的资料(i)序列特征(A)长度6个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO8Thr Asp Tyr Asn Val Tyr1 5(2)SEQ ID NO9的资料(i)序列特征(A)长度17个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO9Tyr Ile Asp Pro Tyr Asn Gly Ile Thr Ile Tyr Asp Gln Asn Phe Lys1 5 10 15Gly
(2)SEQ ID NO10的资料(i)序列特征(A)长度8个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型肽(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型N-末端(vi)原始来源(xi)序列说明SEQ ID NO10Asp Val Thr Thr Ala Leu Asp Phe1 5(2)SEQ ID NO11的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO11CTGGCAAGTC AGACCATTGA T 21
(2)SEQ ID NO12的资料(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO12GCTGCCACCA ACTTGGCAGA T21(2)SEQ ID NO13的资料(i)序列特征(A)长度28个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO13CAACAAGTTT ACAGTTCTCC ATTCACGT28
(2)SEQ ID NO14的资料(i)序列特征(A)长度18个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO14ACTGACTACA ACGTGTAC18(2)SEQ ID NO15的资料(i)序列特征(A)长度51个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO15TATATTGATC CTTACAATGG TATTACTATC TACGACCAGA ACTTCAAGGG C 51
(2)SEQ ID N016的资料(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO16GATGTGACTA CGGCCCTTGA CTTC24(2)SEQ ID NO17的资料(i)序列特征(A)长度23个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO17GCACCTCCAGATGTTAACTG CTC 23(2)SEQ ID NO18的资料
(i)序列特征(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO18GAARTAVCCC TTGACCAGGC 20(2)SEQ ID NO19的资料(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO19GGAGGCGGCG GTTCTGACAT TGTGMTGWCM CARTC35(2)SEQ ID NO20的资料(i)序列特征
(A)长度45个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO20ATTTCAGGCC CAGCCGGCCA TGGCCGARGT YCARCTKCAR CARYC 45(2)SEQ ID NO21的资料(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO21CCCGGGCCAC CATGKCCCCW RCTCAGYTYC TKG 33(2)SEQ ID NO22的资料
(i)序列特征(A)长度35个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO22CCCGGGCCAC CATGGRATGS AGCTGKGTMA TSCTC35(2)SEQ ID NO23的资料(i)序列特征(A)长度52个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型cDNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO23ATATACTCGC GACAGCTACA GGTGTCCACT CCGAGATCCA GCTGCAGCAG TC 52(2)SEQ ID NO24的资料(i)序列特征
(A)长度31个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO24GACCTGAATT CTAAGGAGAC TGTGAGAGTG G31(2)SEQ ID NO25的资料(i)序列特征(A)长度29个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO25TTAATTGATA TCCAGATGAC CCAGTCTCC 29(2)SEQ ID NO26的资料(i)序列特征(A)长度45个碱基对
(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑学线性(ii)分子类型DNA(iii)假说否(iv)反义否(v)片段类型(vi)原始来源(xi)序列描述SEQ ID NO26TAATCGTTCG AAAAGTGTAC TTACGTTTCA GCTCCAGCTT GGTCC 4权利要求
1.一种制备人源化抗体可变(V)区或其片段的方法，该方法包括a)将非人类抗体可变(V)区的构架区(FR)的氨基酸序列与人类抗体构架氨基酸序列或其片段的序列集合库进行比较，b)自集合库中选择出与该非人类FR具有最大氨基酸序列同一性的人类FR序列，c)对非人类FR的DNA进行诱变，以编码具有与步骤b)所选择出的人类FR实质上相同的氨基酸序列的人源化FR(huFR)，d)对非人类V区中的各FR重复步骤a)至c)，以制备许多DNA序列，其中各DNA序列编码一种人源化FR，e)在至少编码该非人抗体的V区的第一载体内，用来自步骤d)的各huFR DNA序列取代该载体所编码的相应非人类FR；其中该取代作用将各huFRs可操纵性连接至其相应的互补性决定区(CDR)处；和f)在有助于制备人源化抗体V区或其片段的条件下在宿主细胞中表达该第一载体。
2.权利要求1的方法，其中所述V区或片段来自非人类抗体轻链。
3.权利要求2的方法，其中步骤a)中轻链V区的构架区(FR)是FR1。
4.权利要求3的方法，其中非人类抗体轻链的FR1与所选择的人类FR之间的序列同一性至少约为70％。
5.权利要求4的方法，其中步骤d)还包括将非人类轻链V区的第二个构架区(FR2)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
6.权利要求5的方法，其中步骤d)还包括将非人类轻链V区的第三个构架区(FR3)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
7.权利要求6的方法，其中步骤d)还包括将非人类轻链V区的第四个构架区(FR4)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
8.权利要求7的方法，其中人源化轻链V区包括依次共价连接的huFR1-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4；或其片段。
9.权利要求2至8的方法，其中抗体轻链V区的非人类与人类FR中，各FR中的游标区氨基酸残基是相同的。
10.权利要求2的方法，其中第一个载体还包括与人源化轻链V区共价连接的人类轻链恒定区或其片段。
11.权利要求10的方法，其中人类轻链恒定区是Cκ、Cγ或其片段。11a.权利要求11的方法，其中人源化轻链片段的氨基酸长度为约95至约235个氨基酸之间。
12.权利要求1的方法，其中V区或片段衍生自非人类抗体重链。
13.权利要求12的方法，其中步骤a)中重链V区的构架区(FR)为FR1。
14.权利要求13的方法，其中FR1与所选择的人类构架FR之间的序列同一性至少约70％。
15.权利要求14的方法，其中步骤d)还包括将非人类重链V区的第二个构架区(FR2)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
16.权利要求15的方法，其中步骤d)还包括将非人类重链V区的第三个构架区(FR3)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
17.权利要求16的方法，其中步骤d)还包括将非人类重链V区的第四个构架区(FR4)与该序列集合库进行比较，并选择序列同一性至少约70％的人类FR。
18.权利要求17的方法，其中人源化轻链V区包括依次共价连接的huFR1-CDR1-huFR2-CDR2-huFR3-CDR3-huFR4；或其片段。
19.权利要求12至18的方法，其中抗体重链V区的非人类与人类FR中，各FR中的游标区氨基酸残基是相同的。
20.权利要求12的方法，其中第一载体中还包含与人源化重链V区共价连接的人类重链恒定区或其片段。
21.权利要求20的方法，其中所述人类重链恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型之一。
22.权利要求1的方法，其中人类氨基酸序列集合库包含完全测序的人类抗体。
23.权利要求22的方法，其中序列集合库还包含部份测序的人类抗体的氨基酸序列。
24.权利要求20的方法，其中人源化重链片段的氨基酸长度为约95至约540个氨基酸之间。
25.一种制备人源化抗体或其片段的方法，其中该方法包括a)将非人类抗体轻链可变(V)区构架(1-FR)的氨基酸序列与人类抗体轻链氨基酸序列集合库或其片段进行比较，b)自集合库中选择与1-FR具有最高氨基酸序列同一性的人类FR序列，c)使1-FR的DNA突变，以编码与步骤b)中所选择的人类FR具有实质上相同的氨基酸序列的轻链人源化FR(L-huFR)，d)对轻链V区中各FR重复步骤a)至c)，产生许多DNA序列，其中各DNA序列编码L-huFR，e)用来自步骤d)的各L-huFR DNA序列取代至少编码该非人类抗体轻链V区的第一载体中所编码的相应1-FRs；其中该取代作用可操纵性连接各L-huFRs与其相应的互补性决定区(CDR)，f)将非人类抗体重链可变(V)区构架区(h-FR)的氨基酸序列与人类抗体重链氨基酸序列或其片段的集合库进行比较，g)自集合库中选择与h-FR具有最高氨基酸序列同一性的人类FR序列，h)使h-FR的DNA突变，以编码具有与步骤g)中所选择的人类FR实质上相同的氨基酸序列的人源化重链FR(H-huFR)，i)对非人类重链V区中的各h-FR重复步骤f)至h)，产生许多DNA序列，其中各DNA序列编码H-huFR，j)用来自步骤i)的各H-huFR DNA序列取代至少编码该非人类抗体重链V区的第二载体中的相应h-FRs；其中该取代作用可操纵性连接各H-huFRs与相应的重链CDR，及k)在同一宿主细胞中，在有助于产生人源化轻链和重链并制备人源化抗体或其片段的条件下表达该第一和第二载体。
26.权利要求25的方法，其中编码人源化轻链与重链或其片段的DNA包含在单一载体中，并在相同宿主中共表达。
27.权利要求25和26的方法，其中宿主为哺乳动物、植物、鸟类或微生物。
28.权利要求25的方法，其中第一载体还包含与人源化轻链V区共价连接的人类轻链恒定区或其片段。
29.权利要求28的方法，其中轻链恒定区是Cκ、Cγ或其片段。
30.权利要求25的方法，其中第二载体还包含与人源化重链V区共价连接的人类重链恒定区或其片段。
31.权利要求30的方法，其中人类重链恒定区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型之一。
32.权利要求25或26的方法，其中该方法还包括从宿主细胞中纯化该人源化抗体，得到实质上纯的抗体制剂。
33.权利要求32的方法，其中该实质上纯化的人源化抗体可特异性结合抗原，其结合亲合力不低于亲代非人类抗体的约十分之一。
34.权利要求33的方法，其中该亲代非人类抗体是嵌合的。
35.权利要求32的方法，其中该抗体特异性识别并结合脂磷壁酸质。
36.权利要求32的方法，其中该抗体特异性识别并结合人类组织因子。
37.权利要求32的方法，其中该人源化抗体被用作治疗产品，以治疗人类或动物疾病。
38.权利要求32的方法，其中该人源化抗体被用作诊断性产品。
39.权利要求25的方法，其中该方法还包括从人源化V区制备人源化单链抗体(sc-Fv)。
40.权利要求25、26或32的方法，其中该人源化抗体的片段是F(ab′)2、Fab′或Fab之一。
全文摘要
本发明公开了一种制造免疫系统分子，尤其是人源化抗体及其片段的方法。一种典型的方法优化各抗体构架区之间的相似性，以协助鉴定适合制造该分子的人类构架区。这样避免了较大抗体构架、超变区或两者之间之比较。还公开了经该方法人源化的抗体。本发明的用途很广，包括用于生产具有合适结合亲合性及尽量降低了的人类免疫原性的人源化单克隆抗体。
文档编号C07K16/18GK1688338SQ03823306
公开日2005年10月26日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年8月29日
发明者H·C·翁, J·R·斯丁森, L·A·莫斯奎拉 申请人:苏诺尔分子公司