双链siRNA分子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了双链siRNA分子及其应用，其中，该双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成：正义链：5′-GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3′(SEQ?ID?NO：1)，反义链：5′-UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3′(SEQ?ID?NO：2)。该双链siRNA分子能够针对性地对survivin基因的转录后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，进而能够用于抗肿瘤药物的制备。
【专利说明】双链SiRNA分子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药【技术领域】，具体涉及双链SiRNA分子及其应用，更具体地，本发明涉及两种双链siRNA分子、质粒及其在制备抗肿瘤药物中的应用、Survivin基因沉默试剂盒以及药物。
【背景技术】
[0002]肿瘤的治疗是长期困扰医学界的世界性难题，尽管各种的治疗方法不断出现，但目前还没有真正有效的根治方法。因此这也迫使科研工作者不断寻找新的技术和方法，试图抑制肿瘤增殖和转移，进而从根本上攻克癌症。
【发明内容】
[0003]本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
[0004]肿瘤的治疗是长期困扰医学界的世界性难题，尽管各种的治疗方法不断出现，但目前还没有真正有效的根治方法，因此这也迫使科研工作者不断寻找新的技术和方法，试图从根本上攻克癌症。
[0005]RNA干扰技术是近几年发展起来的被认为是研究功能基因组最有力工具之一。这种新兴的生物技术为肿瘤分子水平的基因治疗提供了新的技术和方法。RNA干扰，是由双链 RNA(double stranded RNA, dsRNA)介导的转录后的基因沉默(post-transcriptionalgene silencing, PTGS)现象。通过在多种生物细胞内导入外源或内源的dsRNA可以使内源性mRNA发生特异性降解，从而引起相应基因转录的阻抑。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。
`[0006]survivin是1997年耶鲁大学Aitieric.DC等人在人类基因组库中首先筛选分离出来的IAP (凋亡抑制蛋白)家族的一个成员。它定位于17q25，全长15KB，含4个外显子和3个内含子，基因编码产物为由142个氨基酸组成的蛋白，分子量16.2KD，具有抑制细胞凋亡和调节细胞有丝分裂的双重功能，是联系细胞周期和细胞凋亡界面的重要因子。该基因几乎在所有种类的肿瘤组织中特异性地表达，而正常组织几乎没有表达；该基因在肿瘤细胞中高表达后，不但促进肿瘤细胞抗凋亡、促进肿瘤细胞有丝分裂，还参与血管形成和放化疗耐受:等多种功能，
[0007]进而，发明人认为，应用RNA干扰技术，以小分子RNA作为靶向药物，有针对性地对survivin基因的转录后表达进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，多层次，多途径对肿瘤进行抑制，这可能成为了一种新的肿瘤治疗策略。而且survivin基因选择性地表达在几乎所有种类的肿瘤组织中，而正常组织几乎不表达，则可使这种基因治疗对正常组织和细胞的毒副作用降到最低，应用RNAi特异地抑制survivin等肿瘤相关基因的表达有望成为一种新的肿瘤基因治疗方式。
[0008]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于公开一种高效的针对survivin基因的广谱小分子干扰RNA(siRNA)。因而,根据本发明的一个方面，本发明还提出了一种双链siRNA分子。根据本发明的实施例，该双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成:
[0009]正义链:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3' (SEQ ID NO:1)，
[0010]反义链:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3' (SEQ ID NO:2)。
[0011]根据本发明的另一方面，本发明还提出了一种双链siRNA分子。根据本发明的实施例，该双链siRNA分子由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成:
[0012]正义链:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAX-3'，
[0013]反义链:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCX-3'，
[0014]其中X代表tt、TT或UU，t代表脱氧胸腺嘧啶。即X代表两个脱氧胸腺嘧啶、两个T或两个U。在本发明的一个优选的实施方式中，上述序列中3'端的“X”为tt，即两个脱氧胸腺嘧啶。
[0015]需要说明的是，该双链siRNA分子的主干序列即为SEQ ID NO:1和2所示的核苷酸序列，即前面所述的正 义链和反义链分别具有SEQ ID NO:1和2所示核苷酸序列的双链siRNA分子。
[0016]体外实验证明,本发明的两种双链siRNA分子的反义链能够特异性地与survivin基因的mRNA结合，降解其mRNA，从而能够干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成。进一步，本发明的双链siRNA分子能够用于抗肿瘤药物的制备，从而利用制备获得的抗肿瘤药物对患者进行给药后，能够有效实现Survivin基因沉默，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤增殖及转移，以及降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，达到治疗肿瘤的目的。
[0017]为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它们表不的意思和范围相同。
[0018]其中，根据本发明的实施例，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。
[0019]根据本发明的实施例,本发明的siRNA分子来源于针对survivin基因开放阅读框的功能保守区，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于survivin开放阅读框区段，长度可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位点的命中率。
[0020]根据本发明的实施例，siRNA的制备可采用多种方法进行，比如:化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法为研究者提供了可选择的空间，从而能够更好地获得基因沉默效率。
[0021]根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种质粒。根据本发明的实施例，所述质粒包含前面所述的任意一种双链siRNA分子的脱氧核糖核酸序列。由此，利用该质粒转染动物细胞，能够使该动物细胞的Survivin基因沉默，进而诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有效治疗肿瘤。进一步，该质粒能够有效用于抗肿瘤药物的制备，从而利用制备获得的抗肿瘤药物对患者进行给药后，能够有效实现Survivin基因沉默，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有效治疗肿瘤。
[0022]根据本发明的又一方面，本发明还提出了一种Survivin基因沉默试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包含前面所述的任意一种双链siRNA分子，或者质粒。发明人发现，利用本发明的试剂盒能够有效将肿瘤患者的细胞进行Survivin基因沉默，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有效治疗肿瘤。
[0023]此外，根据本发明的实施例，本发明的SiRNA分子能够作为抗肿瘤药物的有效成分。其中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌及骨肉瘤。
[0024]因而，根据本发明的又一方面，本发明还提出了前面所述的任意一种双链SiRNA分子、或者质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0025]根据本发明的实施例，所述肿瘤为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病、皮肤鳞癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一种。
[0026]进而，根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种抗肿瘤药物。根据本发明的实施例，该抗肿瘤药物包含前面所述的任意一种双链siRNA分子，或者质粒。发明人惊奇地发现，利用该抗肿瘤药物能够诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿瘤血管的生成，从而能够有效治疗肿瘤。
[0027]根据本发明的实施例，本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地保持siRNA分子的活性即可。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。
[0028]根据本发明的实施例，所述药物还包含药学可接受的辅助剂。具体地，上述药物剂型中可以包含任何药学可 接受的辅助剂，只要其适合于相应的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性即可。
[0029]根据本发明的实施例，所述肿瘤为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病、皮肤鳞癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一种。
[0030]此外，根据本发明的另一些实施例，出于应用目的，还可以将本发明的SiRNA分子、表达该siRNA分子的DNA表达框、或者包含该siRNA分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。同样能够达到诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖和转移，进而治疗肿瘤的目的。
[0031]本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中:
[0033]图1显示了根据本发明一个实施例,化学合成的siRNA对survivin基因沉默效果的检测结果，其中，
[0034]图1a显示了 siRNA对癌细胞MGC-803的survivin基因沉默效果的检测结果，
[0035]图1b显示了 siRNA对癌细胞Hep G2的survivin基因沉默效果的检测结果，
[0036]图1c显示了 siRNA对癌细胞A549的survivin基因沉默效果的检测结果，
[0037]图1d显示了 siRNA对癌细胞SMMC-7721的survivin基因沉默效果的检测结果；
[0038]图2显示了根据本发明一个实施例，本发明的siRNA分子对癌细胞MGC-803、HepG2和SMMC-7721的survivin蛋白质表达的影响的Westernblot检测结果,其中，[0039]图2a显示了 siRNA对癌细胞MGC-803的survivin蛋白质表达的影响的Westernblot检测结果，
[0040]图2b显示了 siRNA对癌细胞Hep G2的survivin蛋白质表达的影响的Westernblot检测结果，
[0041]图2c显示了 siRNA对癌细胞SMMC-7721的survivin蛋白质表达的影响的Westernblot检测结果。
【具体实施方式】
[0042]下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0043]实施例1:化学合成的siRNA对survivin基因沉默效果的检测实验
[0044]1.主要仪器、试剂和材料.[0045]1.1仪器:核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司);实时定量PCR仪(Bio-Rad)；细胞培养箱(Thermo)等。
[0046]1.2 材料和试剂=RFect siRNA 转染试剂(BIO-TRAN)，DMEM 培养基(Gibco)，TurboCapture mRNA 试剂盒 (QIAGEN), SensiMix? one-step 试剂盒(Quantace)等。其他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。
[0047]1-3PCR 引物:
[0048]survivin 正向引物:5' -cagtgtttcttctgcttcaagg-3'，
[0049]survivin 反向引物:5' -CTTTTTATGTTCCTCTATGGGGTC-3'，
[0050]GAPDH 正向引物；5' -CATCAGCAATGCCTCCTGCAC-3'，
[0051]GAPDH 反向引物:5' -TGAGTCCTTCCACGATACCAAAGTT-3'。
[0052]2.化学合成法制备siRNA
[0053]根据survivin基因的核苷酸序列设计小分子干扰RNA(s_siRNA_l),具体序列如下:
[0054]正义链:5'-GCAUCUCUACAUUCAAGAAdTdT-3' (SEQ ID NO:3)，
[0055]反义链:5'-UUCUUGAAUGUAGAGAUGCdTdT-3' (SEQ ID NO:4)，
[0056]其中，“dT”表示脱氧胸腺嘧啶。
[0057]将该序列在人类EST数据库中比对，确定没有与它相同的其它基因序列。
[0058]3.沉默效率验证
[0059]3.1细胞培养:癌细胞MGC-803和H印G2在含10% FBS的DMEM培养基中，37°C、
5% CO2培养箱培养。
[0060]A549 和 SMMC-7721 在含 10% FBS 的 RPM1-1640 培养基中，37°C、5% CO2 培养箱培养。
[0061]3.2细胞铺板并转染:将细胞按IXlO4 /孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照RNAiMAX?的说明书转染，实验分为未转染组、阴性对照组和实验组(12.5nM、25nM、50nM)，其中阴性对照组siRNA为通用对照RNA,与survivin基因的序列无同源性,浓度为50nM /孔。同时分别转染 MGC-803、Hep G2、A549 和 SMMC-7721 细胞。[0062]3.3实时定量PCR检测survivin基因mRNA水平:用mRNA提取纯化试剂盒TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA,操作按试剂盒说明书进行,用80 μ L无RNA酶水/孔溶解RNA，取4 μ LRNA为模板进行实时定量PCR反应。
[0063]用基因特异性引物检测样本中survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25 μ L反应体系:4 μ L模板RNA，12.5 μ L2X SensiMix one-step，I μ L5'正向引物(6 μ Μ)，0.5 μ L50X SYBR Green I，用无RNA酶水补足体系至25 μ L。反应条件:40°C反转录30min，95°C预变性7分，95°C变性20秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，循环45次。
[0064]3.4结果分析:以GAPDH内参，用实时定量PCR2-A Δ。'法确定survivin mRNA表达量，并作出柱状图，结果见图1。如图1各图所示，纵坐标表示survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示五个处理实验组，其中“未转染”为未经任何处理的细胞样品，NC-siRNA为浓度为50nM的阴性对照，其他三组为本发明siRNA转染实验组，浓度分别为
12.5nM、25nM、50nM。如图1所示，a、b、C、d各图分别显示了 siRNA在癌细胞MGC-803、H印G2、A549和SMMC-7721里沉默survivin基因的效果，即转染前后survivin的mRNA表达水平的变化，结果显示本发明的siRNA靶标survivin基因的沉默效果明显。
[0065]实施例2:survivn基因沉默对肿瘤细胞的抑制情况
[0066]按照以下步骤，利用MTT法检测实施例1中制备的siRNA分子s-siRNA_l对肿瘤细胞的抑制情况:
[0067]细胞的生长情况通过MTT法进行检测。将细胞按I X IO4 /孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5% CO2培养箱细胞培养24小时，在无双抗含10% FBS的DMEM培养基中，转染按照RNAiMAX?的说明书转染。接着37°C下孵育48h后，每孔加30μ--tΤ(5π^ / mL)，37°C下继续孵育4h。吸取含有MTT的培养基，加入200 μ L 二甲基亚矾(DMSO)溶解甲攒晶体。然后，于492nm处测定其吸光度值。
[0068]小分子干扰RNA(s-siRNA-l)在25nM至IOOnM浓度，作用48小时后，MTT法检测的对肿瘤细胞的抑制率情况，结果见表1。
[0069]表ls-siRNA-Ι作用于肿瘤细胞48小时的抑制率
[0070]
【权利要求】
1.一种双链SiRNA分子，其特征在于，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成: 正义链:5' -GCAUCUCUACAUUCAAGAA-3' (SEQ ID NO:1)， 反义链:5' -UUCUUGAAUGUAGAGAUGC-3' (SEQ ID NO:2)。
2.一种双链SiRNA分子，其特征在于，由具有下述核苷酸序列的正义链和反义链组成: 正义链:5' -GCAUCUCUACAUUCAAGAAX-3'， 反义链:5, -UUCUUGAAUGUAGAGAUGCX-3,， 其中X为tt、TT或UU，t代表脱氧胸腺嘧啶。
3.根据权利要求2所述的双链SiRNA分子，其特征在于，所述正义链和反义链序列中3'端的X为tt。
4.一种质粒,其特征在于,所述质粒包含权利要求1-3任一项所述的双链siRNA分子的脱氧核糖核酸序列。
5.一种Survivin基因沉默试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求权利要求1-3任一项所述的双链siRNA分子，或者权利要求4所述的质粒。
6.权利要求1-3任一项所述的siRNA分子、或者权利要求4所述的质粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利要求6所述`的应用，其特征在于，所述肿瘤为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病、皮肤鳞癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一种。
8.一种抗肿瘤药物，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的双链siRNA分子,或者权利要求4所述的质粒。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述药物还包含药学可接受的辅助剂。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于，所述肿瘤为选自肝癌、肺癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病、皮肤鳞癌、胃癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、骨肉瘤和黑色素瘤中的至少一种。
【文档编号】C12N15/113GK103695420SQ201310545856
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】王天有, 余波, 唐锁勤, 张晓敏, 张棪, 曲奎尧 申请人:首都儿科研究所, 杭州普施康生物科技有限公司, 中国人民解放军总医院