一种重组腺病毒及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种重组腺病毒及其制备和应用，该重组腺病毒同时包含免疫调节因子IL-10和变应原基因，二者融合表达，可作为口服疫苗，用于预防和治疗蛋白质变应原所致的过敏性疾病。
【专利说明】一种重组腺病毒及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体地涉及一种重组腺病毒，特别涉及共同表达IL-10与过敏原基因的重组腺病毒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]过敏性疾病如变应性鼻炎、过敏性哮喘、食物药物过敏等是困扰人们生活工作的常见健康问题，过敏性休克更是威胁生命的杀手。世界过敏组织(WAO)在世界首个过敏性疾病日公布了对30个国家进行的过敏性疾病流行病学调查结果:在这些国家的总人口中，22%患有IgE介导的过敏性疾病，包括过敏性鼻炎、哮喘、结膜炎、湿疹、食物过敏、药物过敏和过敏性休克等。据世界卫生组织(WHO)估计，全球约I亿5千万人患有哮喘，其中50%以上的成人及至少80%的儿童患者由过敏因素诱发，每年有18万余人死于哮喘。我国目前尚缺乏全国性的过敏性疾病的流行病学资料，但从各地区已报道的情况看，过敏性哮喘、过敏性鼻炎以及食物过敏等的发病率及患病率是明显上升的，过敏性疾病正在成为新世纪的流行病。
[0003]过敏性疾病的发生，主要是由于在遗传因素和环境因素的共同作用下，特应质个体的免疫系统对外来的无害抗原发生了反应，从而引起相应的临床症状，包括:过敏性鼻炎、过敏性哮喘、特应性皮炎、荨麻疹，以及表现为多个系统受累的严重过敏反应等。引起特异性过敏反应的物质，称为过敏 原。尘螨、霉菌、花粉、食物、动物皮屑或分泌物、昆虫、橡胶等是较为常见的过敏原来源，其中引起过敏反应的成分，多数为蛋白质。
[0004]目前对于过敏性疾病的预防，除了被动地避免接触过敏原，尚缺乏非常有效的主动干预措施。抗组胺药、白三烯受体拮抗剂及糖皮质激素等在治疗上均只能暂时抑制炎症介质及炎症细胞以控制过敏症状。针对过敏原的特异性免疫治疗(specificimmunotherapy，简称SIT)是目前唯一针对病因的长期有效的治疗手段。自1911年Noon等首次发表利用花粉过敏原提取液皮下注射进行脱敏治疗的研究，迄今SIT已有100余年历史。常规SIT方案为:在3-5年的治疗周期内，每周2次，由低浓度到高浓度向机体注射过敏原，达到治疗剂量后，维持该剂量持续治疗，直至达到理想效果；SIT目的是要逐步诱导机体免疫系统产生对特异过敏原的耐受，其核心步骤是诱导外周T细胞耐受的状态，而外周T细胞耐受的建立以过敏原特异的调节性T细胞(Treg细胞)产生为特征。
[0005]尽管目前SIT是唯一的针对过敏性疾病病因的治疗方法，但却存在如下不足:1)疗程长:通常在开始治疗后半年到I年左右时间开始起效，而总疗程需要3-5年，才可以达到比较理想的治疗效果；2)每周一到两次的注射，总共需要注射上百次；3)存在一定风险:治疗过程中可能会诱发严重反应；4)给药不便:传统的SIT为皮下注射，每次均需到医疗机构进行注射；5)目前用于SIT的过敏原主要来自于天然提取物，这些提取物由多种致敏和不致敏的化合物共同组成，成分复杂，难以标准化，且提取过程有引入新的致敏物质的风险。以舌下含服替代皮下注射的免疫治疗方法，给药方便，安全性及依从性较好，但其临床效果存在很大争议，2005年伯明翰大学医院Wilson等人总结分析了已发表的64个采用舌下免疫治疗的临床研究的结果，发现其有效性只有皮下注射的一半左右，而且疗程和给药频率与皮下注射相比并未减少。
[0006]近来，一种显著减少给药次数的短疗程方法受到关注，那就是淋巴结内直接注射过敏原。该方法在动物实验中取得了满意的效果，一项165名过敏原患者参与的临床试验也表明，两月内进行三次腹股沟淋巴结内过敏原注射，在减轻临床症状方面的效果与三年的标准SIT相当；然而对超声定位仪器、相关专业人员的依赖以及穿刺本身的风险性，使其仍然不能成为理想的免疫治疗手段。
【发明内容】
[0007]鉴于上述不足，本发明人提出了一种重组腺病毒:将IL-10基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体，形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型重组腺病毒。以该重组腺病毒为主要成分的口服过敏原疫苗通过一次给药，能有效的预防和治疗蛋白质过敏原所致的过敏。
[0008]依据本发明的第一方面，提供一种重组腺病毒，其将IL-10基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体，形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型重组腺病毒。
[0009]本发明的重组腺病毒中的过敏原基因为具有致敏活性的蛋白质过敏原基因，且所述过敏原在宿主细胞中作为重组蛋白质表达。
[0010]本发明涉及的过敏原包括在http://www.allergen, org/下可获得的所有主要蛋白质过敏原。根据本发明，优选的过敏原包括鸡蛋过敏原卵清蛋白(Ovalbumin,简称0VA),户尘螨过敏原Der pi,粉尘螨过敏原Der fl,桦树花粉过敏Bet vI,蒿属花粉过敏原Art vl和Art v3等。优选地,所涉及的蛋白质过敏原为卵清蛋白(Ovalbumin,简称OVA)。
[0011]更为优选地，IL - 10与蛋白质过敏原OVA基因进行融合表达，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0012]依据本发明的第二方面，提供一种重组腺病毒的制备方法:采用腺病毒载体系统，将IL-10基因及过敏原OVA基因分别克隆入同一腺病毒穿梭质粒的多克隆区，构建同时表达IL-10和OVA的重组穿梭质粒，将该重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化宿主细胞，经同源重组生成重组腺病毒质粒，再经包装细胞包装获得具有感染活力的腺病毒颗粒，并在包装细胞中进行扩增，收集并裂解包装细胞后，纯化得到重组腺病毒。
[0013]优选地，采用AdEasy腺病毒系统，将人IL-10基因及过敏原OVA基因依次分别克隆入同一穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆区,构建重组穿梭质粒pAdTrack-1L-10-0VA,将该重组穿梭质粒经限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒pAdEasy-Ι共转化大肠杆菌BJ5183，经同源重组生成重组腺病毒质粒，经限制性内切酶Pac I酶切，酶切产物纯化后借助脂质体转染包装细胞系293细胞，包装获得具有感染活力的重组腺病毒颗粒。将初次包装所获得的原代腺病毒颗粒，继续感染293细胞，进行病毒扩增，待293细胞完全病变后，将其收获裂解，纯化得到重组腺病毒。
[0014]更优选的，收获裂解的293细胞经氯化铯(CsCl)梯度离心纯化浓缩得到滴度在IO10Pfu/毫升左右的重组腺病毒。
[0015]依据本发明的第三方面，提供一种疫苗，其主要成分为上述重组腺病毒。
[0016]依据本发明的第四方面，提供一种组合物，其主要成分为上述的重组腺病毒。[0017]依据本发明的第五方面，提供一种上述疫苗或组合物在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。
[0018]优选地，所述过敏性疾病为尘螨、霉菌、花粉、动物皮毛、昆虫、食物等的过敏原所致的过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、荨麻疹、特应性皮炎、荨麻疹或严重过敏反应
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[0019]本发明的提供的重组腺病毒疫苗不仅可用于只对一种过敏原具有过敏反应的患者。依据本发明提供的方法生产的表达不同过敏原的重组腺病毒疫苗，可以组合使用，尤其适用于同时对多种蛋白类物质过敏的患者。
[0020]本发明首次在同一载体上同时表达免疫耐受诱导因子和过敏原基因用于预防和治疗过敏性疾病。实验证明本发明的重组腺病毒疫苗(优选口服)对于预防和治疗过敏性疾病有明显的效果。本发明为过敏性疾病的预防和治疗提供了一种方便、安全、有效的新方法，具有良好的应用前景。
[0021]本发明的优势在于:
[0022]1、疫苗安全性:以复制缺陷型重组腺病毒为载体疫苗，病毒不会复制，不会整合到基因组，不存在引发癌变的风险。
[0023]2、给药方式的简便性:口服给药，依从性高。
[0024]3、给药次数少:由于腺病毒能够在肠粘膜定植存活较长时间，相应地其携带的目的基因亦可稳定表达较长时间，并且由于其表达效率高，一次或少数几次给药(优选一次)即可达到长期的效果。
[0025]4、适用人群广:现有免疫治疗方法，尤其是皮下注射免疫治疗，只适用于年长儿童和成人，本发明的腺病毒口服疫苗有望用于婴幼儿，解决因多种重要营养物质如鸡蛋、牛奶等同时过敏需避食而带来的营养缺乏问题。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为穿梭质粒的结构示意图，穿梭质粒pAdTrack-CMV多克隆区域前方携带高效启动子-CMV，可直接启动多克隆区域目的基因的表达。pAdTrack-CMV携带有卡那霉素抗性基因(箭头kan)，便于后续使用含卡那霉素的培养基进行筛选。pAdTrack-CMV含有两段与腺病毒骨架质粒同源的序列(位于Pme I酶切位点的两侧，见示意图下方区域)，经限制性内切酶Pme I酶切线性化后，在重组酶存在的情况下，可与腺病毒骨架质粒发生同源重组。
[0027]图2为腺病毒骨架质粒的结构示意图，腺病毒骨架质粒pAdeasy-Ι，携带腺病毒全基因组除El区和E3区基因以外的序列，其中El区基因与腺病毒复制密切相关，所以通过穿梭质粒和骨架质粒同源重组获得的腺病毒载体由于El区基因缺失，为复制缺陷型的，使用安全性高。腺病毒包装细胞人胚肾293细胞可以提供El基因表达产物，因此腺病毒载体转染293细胞后可在其内包装成为成熟的具有感染活力的腺病毒颗粒，并且再次感染293细胞后，可在293细胞内复制以达到扩增的目的。
[0028]图3为重组腺病毒构建及包装的流程示意图，穿梭质粒中的目的基因为IL-10(hIL-ΙΟ或mIL-10)基因去除终止密码子后，与OVA基因融合构成。具体过程如下:IL_10基因及过敏原OVA基因依次分别克隆入同一穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆区，构建重组穿梭质粒pAdTrack-1L-lO-OVA，将该重组穿梭质粒经经限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，经同源重组生成重组腺病毒质粒，经限制性内切酶Pac I酶切，酶切产物纯化后借助脂质体转染包装细胞系293细胞，包装获得具有感染活力的重组腺病毒颗粒。该腺病毒颗粒仅能在提供腺病毒El基因产物的宿主细胞(如293细胞)内复制扩增。
[0029]图4为穿梭质粒pAdTrack-CMV经限制性内切酶Sal I和Xho I双酶切后，线性化产物的琼脂糖电泳示意图。泳道从左到右依次为:1为经双酶切线性化的pAdTrack-CMV ；2为 ADNA/Hind III Marke r。
[0030]图5为PCR鉴定重组穿梭质粒阳性克隆pAdTrack-hIL-ΙΟ的琼脂糖电泳示意图。泳道从左到右依次为:1为阳性克隆I的PCR产物I ;2为阳性克隆2的PCR产物；3为D2000DNA Marker0
[0031]图6为OVA基因的PCR扩增产物的琼脂糖电泳示意图。泳道从左到右，I为OVA基因的 PCR 产物；2 为 D2000DNA Marker。
[0032]图7为重组腺病毒质粒pAd-hIL-10-0VA的琼脂糖电泳示意图。泳道从左到右，I为λ DNA/Hind III Marker ；2为阳性克隆I提取质粒；3为阳性克隆2提取质粒。
[0033]图8为重组腺病毒质粒pAd-hIL-10-0VA经Pac I酶切后，酶切产物的琼脂糖电泳示意图。泳道从左到右:l_Pac I酶切后的pAd-hIL-10-0VA，2-未酶切的pAd-hIL-10-0VA，3-λDNA/Hind III Marker。
[0034]图9-1至图9-8为重组腺病毒在293细胞内包装成熟的过程示意图。经限制性内切酶Pac I线性化后的重组腺病毒质粒pAd-hIL-10-0VA在借助脂质体转染293细胞，图9-1:转染后17小时(光镜，20X)，细胞形态无明显改变；图9-2:转染后17小时(荧光显微镜，20X)，可见到少许荧光；图9-3:转染后40小时(荧光显微镜，20X)，荧光明显增多；图9-4:转染后4天(荧光显微镜，20X),荧光进一步增多，部分细胞变大变圆，有融合现象；图9-5:转染后5天(荧光显微镜，20X)，大部分细胞表达荧光，出现大量合胞体；图9-6:转染后6天(荧光显微镜，20X)，所有细胞均表达绿色荧光；图9-7:转染后7天(荧光显微镜，20X)，细胞变圆，聚集，大部分脱离瓶底；图9-8:病毒收获前(光镜，40X)，293细胞出现典型的病变效应。
[0035]图10为ELISA法检测重组腺病毒AchhIL-1O-OVA和对照腺病毒感染的293细胞以及未感染病毒的293细胞培养液上清中hIL-10蛋白表达水平的示意图。从左到右依次为:no Ad (未感染病毒，空白对照)，Ad-contool (不含目的基因的腺病毒，阴性对照)，Ad-1L-1O-OVA (含融合基因hIL-10/0VA的重组腺病毒)
[0036]图11为免疫印记法检测重组腺病毒Ad-hIL-10-0VA和对照腺病毒感染的293细胞的培养液上清中OVA蛋白表达的示意图。从左到右依次为:Ad-contiOl (不含目的基因的腺病毒，做阴性对照)，Ad-1L-1O-OVA (含hIL-10/0VA融合基因的腺病毒)
[0037]图12为该疫苗对过敏反应的预防作用研究中小鼠气道敏感性检测示意图。no Ad:未使用腺病毒疫苗，作空白对照；Ad-COntix)l:使用不含目的基因的腺病毒，作阴性对照；Ad-1L-1O-OVA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重组腺病毒。
[0038]图13为该疫苗对过敏反应的预防作用研究中小鼠血清OVA特异性IgE检测示意图。no Ad:未使用腺病毒疫苗,作空白对照；Ad-control:使用不含目的基因的空腺病毒，作阴性对照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重组腺病毒。[0039]图14为该疫苗对过敏反应的治疗作用研究中小鼠气道敏感性检测示意图。noAd:未使用腺病毒疫苗，作空白对照；Ad-COntix)l:使用不含目的基因的空腺病毒，作阴性对照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重组腺病毒。
[0040]图15为该疫苗对过敏反应的治疗作用研究中小鼠支气管淋巴结T细胞经OVA刺激后分泌IL-4水平示意图。no Ad:未使用腺病毒疫苗，作空白对照；Ad-control:使用不含目的基因的腺病毒，作阴性对照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重组腺病毒。
[0041]图16为该疫苗对过敏反应的治疗作用研究中小鼠支气管肺泡灌洗液细胞组成分析示意图。no Ad:未使用腺病毒疫苗,作空白对照；Ad-control:使用不含目的基因的腺病毒，作阴性对照；Ad-1L-10-0VA:使用含mIL-10/0VA融合基因的重组腺病毒。
【具体实施方式】
[0042]下列实施例以鸡蛋过敏原-卵清蛋白(OVA)为例说明本发明的原理，但不限制本发明。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照通用的常规技术，或参照有关制造厂商建议的要求。
[0043]实施例1:hIL_10基因插入穿梭质粒,构建重组穿梭质粒pAdTrack-hIL-10
[0044]1、PCR 扩增 hIL-10 基因
[0045](1)健康人外周血单个核细胞分离
[0046]取健康人外周静脉血10毫升，肝素钠抗凝，加入等体积0.9%氯化钠稀释抗凝后的血液。然后取10毫升4°C避光保存的淋巴细胞分离液加入一无菌离心管管底，并将其升温至室温。用巴斯德吸管吸取20毫升稀释后的血液样品，沿管壁缓慢铺到淋巴细胞分离液上面，尽量避免打乱液层界面。水平转子在室温条件下，以2000转/分的转速离心，20分钟。离心结束后，可见离心管中液体分为三层，管底是红细胞，中间层是分离液，最上层是血浆。血浆层与分离液之间一薄层较致密的白膜，含单个核细胞(包括淋巴细胞和单核细胞)，将吸管直接插入到单个核细胞层并吸取该层，放入另一无菌试管中。在放有吸出的单个核细胞的试管中，加入约10毫升0.9%的氯化钠溶液，轻轻洗涤细胞，以250g离心力在室温条件下离心10分钟,弃上清,重复洗涤1-2次，除去血小板和抗凝物质。最后用RPMI1640培养基将单个核细胞稀释备用。上述操作步骤均需在无菌条件下进行。
[0047](2)外周血单个核细胞刺激活化
[0048]将上述分离获得的单个核细胞转移到培养瓶中放入细胞培养箱中培养4小时后向培养基中加入脂多糖(LPS)进行刺激培养。培养箱内温度37.50C，二氧化碳浓度5%。
[0049](3)外周血活化单个核细胞总RNA提取
[0050]将经过LPS刺激活化后的外周血单个核细胞，转移到离心管中，以350g离心力在室温条件下离心5分钟，弃去上清，加入0.9%氯化钠10毫升轻轻洗涤细胞，以350g离心力在室温条件下离心5分钟，弃尽上清。加入I毫升Trizol，混匀，室温静置5分钟。加入
0.2毫升氯仿,振荡15秒,静置2分钟。4°C尚心，12000gX 15分钟,取上清。加入0.5毫升异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10分钟。
[0051]4°C离心，12000gX10分钟，弃上清。加入I毫升75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4°C，7500gX5分钟，弃上清。晾干，加入适量的DEPC水溶解。紫外分光光度仪测量0D260/0D280=1.9，纯度可，可继续用于下一步合成cDNA。注意:本步骤以及下一步cDNA合成步骤所使用的离心管、枪头均经过0.1%的DEPC溶液过夜浸泡后，高压灭菌处理，目的是尽量去除RNA酶，避免提取过程中RNA降解。
[0052](4 )逆转录获取cDNA
[0053]在一 EP管中加入新提的RNA约5微升(约I微克)，oligo (T) I微升(约0.5微克)，70°C孵育5分钟后置冰上；然后将上述混合物转移至逆转录反应管(赛百盛Easy-go?RT PreMix试剂盒提供，其内含RNA和引物之外的cDNA合成所需的所有成分)，涡旋混匀，短暂离心；接着在42°C条件下，反应60分钟；最后在94°C条件下反应5分钟。
[0054](5)卩0?扩增1111^-10基因
[0055]根据GENBANK 提供的 hIL-10 基因 mRNA 序列(GENEBANK 号:NM_000572)，去除终止密码子，设计合成扩增引物，其中上游引物包含限制性内切酶Sal I的酶切位点和下游引物包含限制性内切酶Xho I的酶切位点(酶切位点以下划线标示)。
[0056]扩增引物如下:
[0057]h游引物:5’ -AGAGTCGACATGCACAGCTCAGCAC-3’ (SEQ ID N0.6)
[0058]下游引物:5’-GCCGCTCGAGGTTTCGTATCTTCAT-3’ (SEQ ID N0.7)
[0059]PCR反应体系:dNTP4微升，上游引物I微升，下游引物I微升，cDNA2微升，DNA聚合酶I微升，DNA聚合酶缓冲液5微升，去离子水36微升，总体积50微升。反应条件为:首先95°C预变性5分钟；然后进行热循环，热循环条件:95°C变性30秒，67°C退火30秒，72°C延伸I分钟，计35个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，送DNA测序，测序结果证实，扩增得到的DNA序列为hIL-10基因的编码片段如SEQ ID N0.1所示。
[0060]2.hIL-10基因PCR产物纯化
[0061]将PCR产物50微升与无水乙醇100微升充分混匀，在4°C条件下以12000转/分的转速离心15分钟；去除上清，加入70%酒精洗涤沉淀，在4°C条件下以12000转/分的转速离心15分钟；去除上清，加入70%酒精重复洗涤I次；去除上清，吸尽附壁水珠，加入25微升灭菌超纯水溶解沉淀。
[0062]3.限制性内切酶Sal I和Xho I双酶切PCR产物和穿梭质粒pAdTrack — CMV
[0063]酶切反应体系分别如下:(1)纯化后PCR产物25微升，酶切缓冲液5微升，SalI 1.5 微升，Xho I1.5 微升，ddH2017 微升，总体积 50 微升；(2) pAdTrack — CMV25 微升，酶切缓冲液5微升，Sal I 1.5微升，Xho I1.5微升，ddH2017微升，总体积50微升。
[0064]酶切反应条件:37°C，2小时。反应结束后，琼脂糖凝胶电泳鉴定穿梭质粒pAdTrack 一 CMV的双酶切线性化效果，结果见附图4。
[0065]4.酶切产物纯化(根据上海华舜胶回收试剂盒提供的直接纯化步骤进行)
[0066]向双酶切产物中加入3倍体积SI液(试剂盒提供)和I倍体积的异丙醇，混匀后加入离心柱中；室温条件下以9200转/分的转速离心15秒；弃收集管中废液，加入500微升70%酒精，室温条件下以9200转/分的转速离心15秒；弃收集管中废液，加入500微升70%酒精，静置I分钟，室温条件下以9200转/分的转速离心15秒；空柱室温条件下以9200转/分的转速离心I分钟；将吸附柱放入一干净EP管，向吸附柱的膜中央滴加20微升灭菌超纯水，室温条件下以9200转/分的转速离心I分钟。EP管中收集液体即为纯化后的酶切产物。注:hIL-10基因的PCR产物和穿梭质粒pAdTrack — CMV的双酶切产物的纯化步骤相同，均如上所述。
[0067]5.酶切产物连接
[0068]纯化后的酶切产物在DNA连接酶作用下，16°C过夜连接。
[0069]6.DH5 α感受态制备
[0070]从培养DH5 α的LB细菌培养平板上挑取单克隆菌落，加入已盛25毫升LB液体培养基的250毫升的烧瓶中，37°C条件下，摇床振摇4小时，速度300转/分；待LB培养基变得明显浑浊，将烧瓶从摇床取出，放入冰盒，冰浴30分钟；冰浴结束后将菌液转入50毫升塑料离心管，4°C条件下以3900转/分的转速离心30分钟；
[0071]离心结束后，弃去上清，加入5毫升冰预冷的氯化钙，吹打重悬菌体；重悬后的菌液再次放入冰盒中冰浴30分钟；冰浴结束后，将菌液在4°C条件下，以3900转/分的转速离心30分钟；离心结束后，弃去上清，加入I毫升冰预冷的氯化钙，吹打重悬菌体；重悬后的菌液以50微升/管分装，取三管放入4°C冰箱备用，余下_70°C保存。
[0072]7.连接产物转化
[0073]将上一步制备的感受态DH5 α放入冰盒中冰浴10分钟；然后加入5微升连接产物，混匀后放入冰盒中冰浴 30分钟；冰浴结束后，立即放入42°C的水浴箱中，热激90秒；而后再冰浴2分钟；冰浴结束后加入200微升37°C预热的LB液体培养基，放入摇床，37°C条件下振摇45分钟，速度180转/分；振摇结束后，将菌液平铺至含50微克/毫升的卡那霉素的LB固体培养基平板(卡那抗性平板)上，放入37°C细菌培养箱，过夜培养。
[0074]8.重组阳性质粒初筛(酹/氯仿一步法抽提质粒后琼脂糖凝胶电泳)
[0075]次晨观察LB固体培养基平板，散在分布少量菌落。以无菌牙签从平板上挑取数个单克隆菌落，加入装有25毫升LB液体培养基的烧瓶，放入摇床，37°C条件下，以250转/分的振摇速度，过夜培养；次日取500微升菌液装入EP管，室温条件下，以12000转/分的速度离心I分钟；去尽上清，加入70微升等体积混合的酚/氯仿，吹打震荡，重悬菌体；室温条件下12000转/分的速度离心10分钟；取上清以I %琼脂糖凝胶电泳筛选可能阳性质粒。
[0076]9.质粒提取(按照omega质粒小抽试剂盒说明进行操作)
[0077]根据上一步初筛结果，挑选2份可能含阳性重组质粒的菌液分别装入1.5毫升的EP管，按照试剂盒说明书提取质粒。
[0078]10.PCR鉴定提取的重组穿梭质粒pAdTrack-hIL-ΙΟ
[0079]以提取的质粒I和2为模板，采用之前以外周血cDNA为模板扩增hIL_10基因的引物和反应条件进行PCR，反应产物经琼脂糖电泳鉴定，结果如附图5。
[0080]实施例2:0VA某闵插入穿檢质粒，构律重纟目穿檢质粒DAdTrack-hIL-10-0VA[0081 ] 1、PCR 扩增 OVA 基因
[0082]首先用TRIzoI试剂法提取鸡输卵管上皮细胞的总RNA，以Oligo dT (寡聚T)为引物反转录合成cDNA，根据OVA基因序列(GenBank登录号AY223553.1)，利用PrimerPremier5软件设计引物，其中包括上游Xho I和下游Xba I酶切位点(下划线标示)，引物序列由上海生工合成。
[0083]扩增引物如下:
[0084]上游引物:5’TACCTCGAGATGGGCTCCATCGGTG3’ (SEQ ID N0.8)[0085]下游引物:5’GCGCTCTAGATTAAGGGGAAACACA3’ (SEQ ID N0.9)
[0086]首先95°C预变性5分钟；随后进行热循环，反应条件为:95°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸I分钟，计35个循环；最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，I %琼脂糖凝胶电泳观察产物生成情况，结果见附图6。
[0087]2、OVA的PCR产物经无水乙醇纯化 [0088]将OVA的PCR产物50微升与无水乙醇100微升充分混匀，在4°C条件下以12000转/分的转速离心15分钟；去除上清，加入70%酒精洗涤沉淀，在4°C条件下以12000转/分的转速离心15分钟；去除上清，加入70%酒精重复洗涤I次；去除上清，吸尽附壁水珠，加入25微升灭菌超纯水溶解沉淀。
[0089]3、OVA 的 PCR 产物和 pAdTrack — hIL-ΙΟ 双酶切
[0090]酶切体系分别如下:(1)PCR产物25微升，酶切缓冲液5微升，Xba I1.5微升，Xho
I1.5微升，去离子水17微升，去离子水17微升，总体积50微升；(2)pAdTrack — hIL-1025微升，酶切缓冲液5微升，Xba I 1.5微升，Xho I1.5微升，去离子水17微升，总体积50微升。
[0091]4、酶切产物纯化
[0092]步骤同实施例1中所述酶切产物纯化方法。
[0093]5、连接
[0094]纯化后的酶切产物在DNA连接酶作用下，16°C过夜连接。
[0095]6、DH5a感受态制备
[0096]步骤同实施例1中所述DH5 α感受态制备方法。
[0097]7、转化
[0098]步骤同实施例1中所述转化方法。
[0099]8、重组阳性质粒初筛(酹/氯仿一步法抽提质粒后琼脂糖凝胶电泳)
[0100]步骤同实施例1中所述重组质粒初筛方法。
[0101]9、阳性重组质粒提取
[0102]按照上一步初筛结果，选择最有可能阳性的两份含质粒的菌液，利用Omega质粒小抽试剂盒进行质粒提取。0.8%琼脂糖凝胶电泳观察提取质粒，结果见附图7。
[0103]10、测序鉴定
[0104]提取阳性重组质粒送DNA测序鉴定，结果显示多克隆区域插入序列为hIL-ΙΟ和OVA的融合表达序列，如SEQ ID N0.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。经鉴定后的重组穿梭质粒命名为pAdTrack-hIL-10-0VA。
[0105]实施例3:重组腺病毒质粒的构建(细菌内同源重组法)
[0106]将线性化的重组穿梭质粒pAdTrack-hIL-10-0VA (卡那霉素抗性)与腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι (氨节青霉素抗性)共转化BJ5183菌进行同源重组,含卡那霉素培养基进行筛选，琼脂糖电泳酶切鉴定和PCR鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pAd-hIL-10-0VA。
[0107]1、BJ5183转化用感受态的制备
[0108]步骤同上述DH5 α感受态制备方法，不同的是培养基中含30微克/毫升链霉素，以抑制其他细菌生长。
[0109]2、同源重组[0110]以Omega质粒小抽试剂盒提取pAdTrack-hlL-lO-OVA质粒，经限制性内切酶PmeI进行酶切使其线性化；将酶切产物用上海华舜胶回收试剂盒进行纯化；纯化后的酶切产物(约500纳克)和与pAdEasy-Ι质粒(约100纳克)同时加入50微升感受态BJ5183细菌中混匀，氯化钙法进行转化，具体操作与前面DH5ci所述转化步骤相同。转化结束后，菌液涂于含50微克/毫升卡那霉素和30微克/毫升链霉素的LB细菌培养基平板，置37°C孵箱内，过夜培养。
[0111]3.重组腺病毒质粒的提取和鉴定
[0112]由于腺病毒骨架质粒pAdEasy-Ι只具有氨苄青霉素(amp)抗性，所以只有含有重组成功的腺病毒质粒(从穿梭质粒获得卡那霉素抗性)的细菌方能在含有卡那霉素的筛选培养基上生长；用无菌牙签挑取平板上的阳性克隆于含有50微克/毫升卡那霉素的LB中振摇过夜，Omega质粒小抽试剂盒提取质粒，以Pac I进行酶切。
[0113]酶切产物经琼脂糖凝胶电泳，结果如附图8所示，表明重组腺病毒质粒pAd-hIL-10-0VA 构建成功。
[0114]4.将pAd-hIL-10-0VA质粒转入大肠杆菌DH5 α
[0115]由于重组腺病毒质粒在BJ5183菌中拷贝数较低，故需转入质粒拷贝数较高的DH5a细菌中。转化步骤与前面所述DH5 α转化相同。
[0116]实施例4.腺病毒包装及收获
[0117]1、293细胞培养
[0118]293细胞常规培养于含10%的胎牛血清，IOOu/毫升青霉素，IOOu/毫升的链霉素的RPMI1640培养液中，培养条件为37.5°C，CO2浓度为5%，根据细胞生长情况，每2 — 3天用0.25%的胰酶消化后进行传代培养。
[0119]2、在293细胞内生成腺病毒
[0120]将pAd-hIL-10_0VA4微克用Pac I酶切使之线性化，用胶回收试剂盒纯化，应用Invitrogen公司的Lipofectamine?2000转染试剂转染293细胞。在293细胞内包装成为成熟的腺病毒颗粒(Ad-h IL-10-0VA )。
[0121](I)转染293细胞转染
[0122]将293细胞接种于25毫升培养瓶中，于5 % CO2孵箱中，无抗生素培养至约有60%的细胞汇合；以Pac I酶切pAdV-hIL-10-0VA质粒，胶回收试剂盒纯化；将10微升Lipofectamine2000和4微克Pac I酶切线性化的质粒分别用500微升无血清RPMI1640培养基稀释，混匀，室温孵育5分钟，接着将稀释后的LipofectamineTM2000与质粒轻轻混匀，于室温孵育20分钟后加入293细胞培养瓶内，轻轻晃动培养瓶使其分布均匀，随后将培养瓶放回细胞培养箱内继续培养5个小时；然后吸出含LipOfectamineTM2000与腺病毒质粒混合物的培养基，加入3毫升新的RPMII1640 (含10%FBS)培养基，继续培养。
[0123](2)腺病毒生成的观察`
[0124]由于重组腺病毒在细胞内可以表达绿色荧光蛋白(GFP)，因此可以通过在荧光显微镜下观测荧光来观察腺病毒生成情况。于转染17小时后，即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光。随后数天内，荧光逐渐增多，细胞变圆，融合，形成典型病变效应，过程示意图见附图9。
[0125](3)腺病毒收集[0126]腺病毒质粒转染293细胞后第7天，293细胞出现明显病变效应，大部分细胞漂浮，聚集呈葡萄串样改变，轻轻晃动培养瓶使剩余贴壁细胞从培养瓶壁分离；将细胞和培养基一并转移入离心管中，以800转/分的转速在室温条件下离心5分钟，沉淀细胞，将上层培养基转入另一离心管，管底保留约2毫升培养基重悬细胞，盛于EP管中。
[0127]3)将细胞悬液放一 80°C冷冻，再将其投入37°C水浴快速震荡融化。
[0128]4)重复3次步骤3)。
[0129]5) 12000转/分离心I分钟，沉淀细胞碎片，上清即为病毒悬液，0.22ul微孔滤膜过滤除菌，贮存于_20°C。收获的重组腺病毒命名为Ad-hIL-10-0VA。
[0130](4)腺病毒扩增与纯化
[0131]I)将293细胞进行传代，100毫升培养瓶培养，至80_90%融合时进行感染。
[0132]2)感染前弃去培养基，加入2毫升新鲜培养基，然后分别加入收获病毒原液的
0.5ml,前后左右晃动培养瓶,使病毒均匀分布。
[0133]3) 37°C，5%C02孵育2小时，每隔15分钟，以十字方向晃动培养瓶。
[0134]4) 2小时后补足培养基，继续培养。
[0135]5)感染10小时后在荧光显微镜下观察GFP表达情况，并捕获成像存图。
[0136]6)待全部细胞表达绿色荧光，2 / 3细胞漂浮后，将细胞收获。
[0137]7)病毒收集与实施例4中(3)腺病毒收集步骤相同。
[0138]8)收集好的病毒溶液通过氯化铯梯度离心纯化浓缩。
[0139](5)病毒滴度的测定(TCID50法)
[0140]I)将293细胞按IX IO4细胞/孔接种96孔板中，待24h后感染病毒。
[0141]2)取纯化浓缩后的病毒原液用RPMI1640培养基1:1000稀释后，再用RPMI1640(含2% FBS)对病毒稀释液作不同比例稀释(I:103~1:101°),每种浓度做10个复孔。
[0142]3)按每孔200微升加病毒稀释液至293细胞培养板中，放置37°C，培养24h。
[0143]4)荧光显微镜下计数各种稀释度GFP阳性孔。
[0144]5)按下列公式计算重组腺病毒AchhIL-1O-OVA的滴度:T = 101+d (s_°_5)
[0145]d:稀释度的常用对数;s:阳性率的和，从第I个10倍稀释度开始。虽然一些低稀释度在测定中省略了(如1:10和1:102)，但在计算时仍应以阳性比率为I来算。
[0146]结果:d=Log10 = 1 ;s = l + l + l + l + l + l + l+0.6+0.2 + 0 = 7.8。 重组腺病毒 Ad-hIL-10-0VA (1:1000 稀释后)的滴度 T=IO1+1 α8-°.5)=108.3 换算做Pfu=IO8-3-°.7=?θ7.6=4X IO7/ 毫升。重组腺病毒原液滴度=1000X4Χ IO7/ 毫升=4X 101Qpfu/毫升。
[0147]实施例5 MLzlO及OVA表汰鉴定
[0148]收集感染重组腺病毒Ad-hIL-10-0VA和对照病毒的293细胞及未感染病毒的293细胞的培养液上清，ELISA法检测其中hIL_10的表达量，结果感染重组腺病毒的293细胞培养液上清中hIL-10的含量显著升高，见附图10 ;免疫印记法检测重组腺病毒Ad-hIL-10-0VA和对照病毒的293细胞的培养液上清中过敏原蛋白OVA的表达情况，以针对OVA的单克隆抗体在感染重组腺病毒的培养基上清中检测到大小约45kD的蛋白条带，结果见附图11。
[0149]实施例6:重组腺病毒Ad-mlL-lO-OVA的构津和包装[0150]提取经脂多糖刺激培养的小鼠脾细胞的总RNA，反转录生成cDNA。根据根据GENBANK提供的mIL-10基因mRNA序列(GENBANK:M37897.1),去除终止密码子，设计合成扩增引物，其中包括上游Sal I和下游Xho I酶切位点(下划线标示)。
[0151]扩增引物如下:
[0152]h游引物:5’ ATAGCGTCGACATGCCTGGCTCAGC3’ (SEQ ID N0.10)
[0153]下游引物:5’GGTCTCGAGGCTTTTCATTTTGATCA3’ (SEQ ID N0.11)
[0154]PCR产物送测序，证实扩增产物为mIL-10的表达框序列，如SEQ ID N0.4所示。经过BLAST比对，小鼠的IL-10 (mIL-10)的编码框序列与人IL-10 (hIL-ΙΟ)的编码框序列一致性达到82%。
[0155]将mIL-10的PCR产物经Sal I和Xho I双酶切后，与重组穿梭质粒pAdTrack-hIL-10-0VA经Sal I和Xho I双酶切去除hIL_10基因后得到的产物连接，得到重组穿梭质粒pAdTrack-mlL-lO-OVA，其余腺病毒质粒重组、病毒包装等步骤同Ad-h IL-10-OVA,从而得到重组腺病毒Ad-mIL-10-0VA。以下动物实验中所使用的重组腺病毒均指 Ad-mIL-10-0VA。
[0156]实施例7.对照病毒Ad-control的构建和包装
[0157]直接应用pAdTrack — CMV与pAdEasy-Ι在细菌BJ5183内同源重组获得不含目的基因的对照病毒质粒。Pac I线性化后转入293细胞，包装得到不含目的基因的对照腺病毒Ad—controlο
[0158]实施例8:腺病毒载体疫苗对过敏反应的预防作用
[0159]选6-10周龄的雌性BALB/c小鼠，第O天和17天时，实验组小鼠通过导管灌服5X108pfu重组腺病毒过敏原疫苗(Ad-1L-lO-OVA)，阴性对照组灌服对照腺病毒载体(Ad-control),空白对照组给予磷酸盐缓冲液PBS(no Ad)。第24天和34天时以0VA50微克混以氢氧化铝腹腔注射致敏，在第38，49，50和51天时以50微克OVA溶于50微升PBS中滴鼻激发，第52天时测定气道敏感性(以乙酰甲胆碱刺激后气道阻力的增加程度来表示，气道阻力增加越多，表明气道敏感性越高)，随后采血测定过敏原特异的IgE。结果发现，提前灌服腺病毒过敏原疫苗的小鼠与使用对照腺病毒及未使用腺病毒的小鼠相比，气道敏感性显著减低(见附图12)，血清OVA-特异性的IgE水平也明显下降(见附图13)，表明以腺病毒为载体的重组过敏原疫苗能有效预防过敏。
[0160]实施例9:腺病毒疫苗对过敏反应的治疗作用
[0161 ] 选6-10周龄的雌性BALB/c小鼠，第O天时通过腹膜内注射50微克卵白蛋白(0VA)与氢氧化铝的混合物致敏，第8和9天时，将50微克OVA溶于50ulPBS滴鼻。第10天和第25天实验组(Ad-1L-1O-OVA)和阴性对照组(Ad-control)分别灌服I X 109pfu重组腺病毒载体及对照载体，空白对照组(no Ad)给予PBS。第39天再以50微克OVA溶于50ulPBS滴鼻激发，第40天时测定气道敏感性(以乙酰甲胆碱刺激后气道阻力的增加程度来表示，气道阻力增加越多，表明气道敏感性越高)，之后处死动物，分离支气管淋巴结T细胞进行体外培养，测定其在OVA (100ug/ml)刺激后分泌IL-4的水平，生理盐水灌洗支气管肺组织后检测灌洗液中的各类细胞数。结果发现，OVA致敏后灌服腺病毒过敏原疫苗的小鼠，与使用对照腺病毒及未使用腺病毒的小鼠相比，气道敏感性明显降低(见附图14)，支气管淋巴结T细胞经OVA刺激后分泌IL-4水平显著下降(见附图15)，支气管肺泡灌洗液中嗜酸性细胞的比例也减低(见附图16)。提示以腺病毒为载体的重组过敏原疫苗对已经建立的过敏反应有显著改善作用，可用于过敏性疾 病的治疗。
【权利要求】
1.一种重组腺病毒，其特征在于:将IL-1O基因与过敏原基因共同包装到腺病毒载体，形成具有感染活力但不致病的复制缺陷型腺病毒载体。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于:所述过敏原基因为具有致敏活性的蛋白质过敏原基因，且所述过敏原基因在宿主细胞中作为重组蛋白质表达。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于:过敏原基因为卵清蛋白(OVA)基因。
4.根据权利要求1-3所述的重组腺病毒，其特征在于:IL-10基因与过敏原OVA基因进行融合表达，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
5.权利要求1-3任一项所述重组腺病毒的制备方法:米用腺病毒载体系统，将IL-10基因及过敏原OVA基因分别克隆入同一腺病毒穿梭质粒的多克隆区，构建同时表达IL-10和OVA的重组穿梭质粒，将该重组穿梭质粒与腺病毒骨架质粒共转化宿主细胞，经同源重组生成重组腺病毒质粒，再经包装细胞包装获得具有感染活力的腺病毒颗粒，并在包装细胞中进行扩增，收集并裂解包装细胞后，纯化得到重组腺病毒载体。
6.权利要求5所述重组腺病毒的制备方法:采用AdEasy腺病毒系统，将人IL-10基因及过敏原OVA基因依次分别克隆入同一穿梭质粒pAdTrack-CMV的多克隆区，构建重组穿梭质粒pAdTrack-1L-lO-OVA，将该重组穿梭质粒经经限制性内切酶Pme I线性化后与骨架质SpAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183，经同源重组生成重组腺病毒质粒，经限制性内切酶Pac I酶切，酶切产物纯化后借助脂质体转染包装细胞系293细胞，包装获得具有感染活力的重组腺病毒颗粒。将初次包装所获得的原代腺病毒颗粒，继续感染293细胞，进行病毒扩增，待293细胞完全病变后，将其收获裂解，最后纯化得到重组腺病毒载体。
7.一种疫苗，其特征在于:主要成分为权利要求1 一 4任一项所述的重组腺病毒。
8.一种组合物，其特征在于:主要成分为权利要求1 一 4任一项所述的重组腺病毒。
9.权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒或权利要求7所述的疫苗或权利要求8所述的组合物在制备治疗过敏性疾病药物中的应用。
10.权利要求9所述的应用，所述过敏性疾病为尘螨、霉菌、花粉、动物皮毛、昆虫、食物或橡胶等中的蛋白质变应原所致的过敏性鼻炎、过敏性哮喘、过敏性结膜炎、荨麻疹、特应性皮炎、荨麻疹或严重过敏反应等。
【文档编号】C12N15/861GK103571873SQ201310545529
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年12月3日 优先权日:2013年12月3日
【发明者】马仕坤, 赵婧文 申请人:马仕坤