一种启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种启动子及其应用。本发明提供的启动子，自上游至下游依次由片段甲、多克隆位点区和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列1所示，所述片段乙如序列表的序列2所示。含有所述DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种表达外源基因的方法，包括如下步骤：（1）将所述外源基因插入所述重组载体中的所述DNA分子的多克隆位点区，得到用于表达外源基因的重组质粒；（2）将步骤（1）得到的重组质粒导入植物或植物组织，从而在植物或植物组织中表达所述外源基因。本发明提供的可以有效启动外源基因的表达。本发明对于培育转基因植物具有重大的应用价值。
【专利说明】一种启动子及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种启动子及其应用。
【背景技术】
[0002]对于中国这样的人口大国而言，粮食安全是社会稳定和可持续发展不可或缺的保障。随着中国经济的高速发展，城镇化过程不可避免地不断蚕食耕地面积。土地是农业之本，在土地面积不断减少、人口不断增加、人们对粮食的需求水平不断提高的压力下，保障粮食安全的唯一出路，只能是通过对植物生命活动的持续深入的研究，进行更加有效的作物改良，提高单位面积产量。经验表明，利用杂种优势进行育种是一个行之有效的作物改良方法，不仅能有效地利用杂种优势提高产量，还能通过各种不同的组合筛选，实现综合性状 (包括品质和抗性)的快速组合，是大规模种业生产上行之有效的策略。
[0003]在生产上大规模利用杂种优势的前提是雄性不育系。在传统的杂种优势利用中， 人们利用自然变异筛选所获得的雄性不育系曾经成功地实现了大规模提高水稻产量的目标。可是，当杂种优势利用面对综合性状组合和种业的产业化运作时，缺乏具有自主知识产权的多元化雄性不育系就成为杂种优势利用的一个现实的、无法回避的严重技术制约。近年，通过对水稻的大规模突变体研究，人们发现了一批新的、可以造成雄性不育的基因，为创制多元化雄性不育系提供了新的选择。目前所报道的影响雄蕊发育的基因大多在减数分裂之后发挥作用，从植物器官形成和营养物质分配的角度而言，在雄蕊发育早期调控入手创制雄性不育系，将不仅能实现更加稳定的不育效果(彻底抑制雄蕊的形成)，而且还可以减少雄蕊早期发育过程(包括减数分裂)的消耗，让同样的光合产物进行更有效的利用。
[0004]在1990年代初，植物花器官特征决定基因(ABC基因)的发现，证明器官特征决定可以由少数基因控制。本发明的发明人在前期工作中也曾成功地利用ABC基因中的B类基因AP3的启动子特异性地改变雄蕊中乙烯信号组分的表达，实现抑制雄蕊早期发育、在拟南芥中实现雌花单性花的目的。迄今为止，尚未见在水稻雄蕊发育早期特异性表达的启动子的报道。显然，要有效地实现从雄蕊早期发育入手创制水稻的人工雄性不育系，进而实现拥有自主知识产权的多元化雄性不育系资源，掌握通过杂种优势利用而深化作物改良的主动权，当务之急就是要找到一批有效的、拥有自主知识产权的水稻雄蕊早期发育过程基因特异表达的调控元件，如启动子。
`[0005]基因表达的器官/组织/细胞特异启动子或调控元件(因为很多特异性调控元件并不在编码区上游，而在内含子中)的研究是分子生物学发展到1980年代时的一个研究热点。在植物中，欧洲科学家曾热衷于研究在根的各种组织中特异性表达启动子。随着对基因表达调控机制了解的不断深入和基因序列解析手段的发展，目前有关基因表达调控元件的分析也有了更加有效的方法。但由于分子生物学的发展的热点在启动子之后迅速转移到转录因子、染色质修饰、小RNA、大规模测序等新的热点，而植物分子生物学的研究在1990 年代之后也将重点转移到突变体的筛选和相关基因分离上，有关器官/组织/细胞特异启动子或调控元件的研究在近年并没有成为大家关注的焦点。虽然这种局面的形成有其合理性，因为没有有功能的基因，也无从了解其表达的调控元件。随着模式植物和重要作物基因组测序的完成，特别是人类ENCODE计划的完成，基因表达的时空特异性精细调控必将成为人们关注的下一个焦点。而且从应用的角度出发，要利用生物技术改变基因表达，实现特定的产业化需求，必然要通过调控元件来控制基因表达的时空特异性。因此器官/组织/细胞特异性基因表达的调控元件的分离克隆和应用，必然成为分子生物学和生物技术研究的下一个无法回避的技术挑战。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种启动子及其应用。
[0007]本发明提供了一种DNA分子，具有启动子的功能，命名为SPL5启动子，自上游至下游依次由片段甲、多克隆位点区和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列I所示，所述片段乙如序列表的序列2所示。所述DNA分子具体可如序列表的序列3所示。
[0008]含有所述DNA分子的重组载体也属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在PCAMBIA2300载体的不同多克隆位点分别插入所述片段甲和所述DNA片段乙得到的重组质粒。所述重组载体具体可为将PCAMBIA2300载体SacI和SalI酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列3所示的双链DNA分子得到的重组质粒。
[0009]本发明还保护所述DNA分子在启动外源基因表达中的应用。所述外源基因具体可为序列表的序列4所述的GUS基因或序列表的序列5所不的SPL基因。
[0010]本发明还保护一种用于表达外源基因的重组质粒，是将所述外源基因插入所述重组载体中的所述DNA分子的多克隆位点区(如KpnI酶切位点)，得到用于表达外源基因的重组质粒。所述外源基因具体可为序列表的序列4所述的GUS基因或序列表的序列5所示的 SPL基因。
[0011 ] 本发明还保护所述“用于表达外源基因的重组质粒”在表达所述外源基因中的应用。所述外源基因具体可为序列表的序列4所述的GUS基因或序列表的序列5所示的SPL基因。
[0012]本发明还保护一种表达外源基因的方法，包括如下步骤:
[0013](1)将所述外源基因插入所述重组载体中的所述DNA分子的多克隆位点区(如 KpnI酶切位点)，得到用于表达外源基因的重组质粒；
[0014](2)将步骤(1)得到的重组质粒导入植物或植物组织，从而在植物或植物组织中表达所述外源基因。
[0015]所述植物为单子叶植物或双子叶植物，具体可为拟南芥。
[0016]所述外源基因具体可为序列表的序列4所述的GUS基因或序列表的序列5所示的 SPL基因。
[0017]只利用SPL基因起始密码子atg上游的序列作为启动子，转化拟南芥后并不能启动外源基因的表达。本发明提供的启动子包括SPL基因起始密码子atg上游的序列，还包括 SPL基因组序列除了第一个外显子外的全部基因组序列(基因内部的一些序列也是启动基因表达的必须组分)，将外源基因插入上述两个序列之间，可以有效启动外源基因的表达。 本发明对于培育转基因植物具有重大的应用价值。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1为实施例1的步骤I中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0019]图2为实施例1的步骤5中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0020]图3为SPL5启动子的结构示意图。
[0021 ]图4为实施例2的步骤一的I中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0022]图5为实施例2的步骤二的2中的部分T2代植株的PCR鉴定电泳图。
[0023]图6为实施例2中转基因植株的花器官进行⑶S染色后在显微镜下的照片。
[0024]图7为实施例2中对照植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片。
[0025]图8为转基因植株花的不同发育时期中，雄蕊部位GUS染色后的照片。
[0026]图9为实施例3的步骤一的I中的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。
[0027]图10为实施例3的步骤二的2中的部分T2代植株的PCR鉴定电泳图。
[0028]图11为实施例2中对各个株系植株的花器官进行亚历山大染色后的照片。
[0029]图12为转基因 植株花的不同发育时期中，雄蕊部位亚历山大染色后的照片。
【具体实施方式】
[0030]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0031]雄蕊早期发育的一个最主要事件就是生殖细胞发生，这一过程中的典型特征就是孢原细胞在特定位置上的诱导发生及围绕生殖细胞形成过程而产生的多层细胞分化。有关生殖细胞发生的机理研究，目前主要集中于对SPL基因的研究。SPL蛋白被预测为一种非典型的MADS类转录因子，spl突变体表现为大小孢子母细胞发生异常，在小孢子母细胞形成过程中，缺失了 SPL基因导致来源于L2层的孢原细胞第一次平周分裂以后形成的初级周缘细胞和初级造孢细胞不能进一步的分裂、分化形成壁细胞和小孢子母细胞。
[0032]Landsberg erecta 生态型拟南芥，英文名称为 Arabidopsis ecotype Landsberg erecta(Ler),购自 Arabidopsis Biological Resource Center, USA。哥伦比亚生态型拟南芥:购自 Arabidopsis Biological Resource Center, USA。spl_/_ 纯合突变体拟南芥(spl-/_纯合突变体拟南芥与Landsberg erecta生态型拟南芥的区别仅在于SPL基因发生了突变失活):购自TAIR拟南芥突变体库(http://www.arabidopsis.0rg/servlets/Search?type=general&search_action=d etail&method=l&show_ obsolete=F&name=spl&sub_type=gene&SEARCH_EXACT=4&SEARC H_C0NTAINS=1)。
[0033]pCAMBIA2300 载体:CAMBIA 公司。pCambial305.1 载体:CAMBIA 公司。农杆菌 GV3101:购自北京天为时代科技有限公司。
[0034]⑶S染色液(pH7.0):溶剂为200mM PBS缓冲液，含IOOmM亚铁氰化钾、IOOmM铁氰化钾、0.5mM EDTA (pH8.0) U0mg/ml X-Gluc、0.1% (体积比)吐温 20。
[0035]亚历山大染色液的制备方法:取10ml A液、5ml B液、5g苯酹、5ml C液、0.5mlD液、 2mL冰醋酸、25mL甘油、50mL H2O混合，使用时用水稀释至50倍体积汸液:95%乙醇水溶液； B液:向A液中加入孔雀绿，至其终浓度为lg/100mL ；C液:lg/100mL的酸性品红水溶液；D液:lg/100mL的橙黄G染料水溶液。
[0036]实施例1、重组质粒的构建
[0037]1、以Landsberg erecta生态型拟南芥的基因组DNA为模板，米用spl5_s和 spl5-a组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0038]spl5-s:5， -CGAGCTC AACACGAAGTCACAAAACCC-3，；
[0039]spl5-a:5’ -TTCCTAGGTACC TGATGATGATCTTCTTCTCGGA-3’。
[0040]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图1 (泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp ;泳道 1-4 为 PCR 扩增产物，约为3.7kb)。
[0041]2、用限制性内切酶SacI和KpnI双酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0042]3、用限制性内切酶SacI和KpnI双酶切pCAMBIA2300载体，回收约8.74kb的载体骨架。
[0043]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒PSPL5。根据测序结果，对重组质粒PSPL5进行结构描述如下:在pCAMBIA2300载体的SacI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列I所示的DNA分子(SPL启动子)。
[0044]5、以Landsberg erecta生态型拟南芥的基因组DNA为模板，米用spl3’ _s和 spl3’ -a组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0045]spl3’ -S:5’ -TGCGTCGAC GTTTGTTTGTTTTTTA-3 ；
[0046]spl3，-a:5，-TGCGTCGAC ACGAGAACGTGCTGAG-3，。
[0047]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图2 (泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp ;泳道 1-4 为 PCR 扩增产物，约为2kb)。
[0048]6、用限制性内切酶SalI酶切步骤5的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0049]7、用限制性内切酶SalI酶切重组质粒pSPL5，回收约12.47kb的载体骨架。
[0050]8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pSPL。根据测序结果，对重组质粒PSPL进行结构描述如下:在pCAMBIA2300载体的SacI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列I所示的DNA分子(SPL启动子)，SalI酶切位点插入了序列表的序列2所示的DNA分子(SPL基因除第一个外显子外的包括3’ UTR区的所有基因组序列)。 从另一个方面，对重组质粒PSPL进行结构描述如下:将pCAMBIA2300载体的SacI和SalI 酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3所示的双链DNA分子(即SPL5启动子；序列表的序列3中，自5’末端第3737位-3763位核苷酸为多克隆位点区域)。SPL5启动子的结构示意图见图3。
[0051]实施例2、启动子的功能验证(启动⑶S基因表达)
[0052]一、重组质粒的构建
[0053]1、以pCambial305.1载体为模板，米用gus_s和gus_a组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0054]gus-s:5’ -CCGGGTACC ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3’ ；
[0055]gus-a:5， -accgGGTACC TCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3，。
[0056]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图4 (泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp ;泳道 1-5 为 PCR 扩增产物，约为1.8kb)。
[0057]2、用限制性内切酶KpnI酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0058]3、用限制性内切酶KpnI酶切重组质粒pSPL，回收约14.5kb的载体骨架。
[0059]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒PSPL:⑶S。根据测序结果,对重组质粒PSPL:GUS进行结构描述如下:在重组质粒pSPL的KpnI酶切位点正向插入了序列表的序列4所不的GUS基因。
[0060]二、转基因植物的获得
[0061]1、将重组质粒PSPLAUS导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0062]2、利用步骤I得到的重组农杆菌，通过花浸泡法将重组质粒PSPL:⑶S导入哥伦比亚生态型拟南芥，得到T1代种子。T1代种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上， 筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株(T2代植株)。
[0063]提取T2代植株的叶片的基因组DNA，用gus_F和gus_R组成的引物对基因组DNA 进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。部分T2代植株的PCR鉴定电泳图见图5。图5中:M为DL2000PLUS DNA marker ;1_4为PCR鉴定为阳性的植株;5_6为阴性对照(哥伦比亚生态型拟南芥)。
[0064]gus-F:5， -ATGTTACGTCCTGTAGAAAC-3，；
[0065]gus-R: 5，-TCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3，。
[0066]三、对照植物植株的获得
`[0067]在重组质粒pSPL5的KpnI酶切位点正向插入序列表的序列4所示的⑶S基因，得到对照质粒。用对照质粒代替重组质粒PSPLAUS进行步骤二，得到对照植株。
[0068]四、转基因植物的鉴定
[0069]取T2代转基因植株、T2代对照植株或哥伦比亚生态型拟南芥的成熟花器官进行 GUS染色分析。具体如下:将植株的花在GUS染色液中37°C浸泡12小时，然后用70%乙醇水溶液脱色2-3次，然后在显微镜下观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。转基因植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片见图6 (图中数字表示花药和花粉处于发育的I期、2期、3期、4期、5期、6期、7期或8期)，可以观察到蓝色。对照植株和哥伦比亚生态型拟南芥的花器官均未观察到蓝色。对照植株的花器官进行GUS染色后在显微镜下的照片见图7。转基因植株花的不同发育时期中，雄蕊部位的GUS基因的特异性表达模式见图8 (A、B、C、D、E依次为拟南芥花发育的I期、2期、3期、4期和5期)，2期至5期均可观察到蓝色。结果表明，本发明提供的启动子可以启动GUS基因表达。
[0070]实施例3、启动子的功能验证(启动SPL基因表达)
[0071]一、重组质粒的构建
[0072]1、以Landsberg erecta生态型拟南芥的基因组DNA为模板,米用Spl_s和Spl_a 组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0073]Spl-s:5， -CCGGGTACC ATGGCGACTTCTCTCTTCT-3，；
[0074]Spl-a:5，-CCGGGTACC TTAAAGCTTCAAGGACAA-3，。
[0075]PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图见图9 (泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为 5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、300bp、200bp ;泳道 1-5 为 PCR扩增产物，约为1.lkb)o
[0076]2、用限制性内切酶KpnI酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0077]3、用限制性内切酶KpnI酶切重组质粒pSPL，回收约14.5kb的载体骨架。
[0078]4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒PSPL: SPL。根据测序结果,对重组质粒PSPL:SPL进行结构描述如下:在重组质粒pSPL的KpnI酶切位点正向插入了序列表的序列5所示的SPL基因。
[0079]二、转基因植物的获得
[0080]1、将重组质粒PSPL:SPL导入农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。
[0081]2、利用步骤I得到的重组农杆菌，通过花浸泡法将重组质粒PSPL:SPL导入 spl-/-纯合突变体拟南芥，得到T1代种子。T1代种子播种于含50mg/L卡那霉素的MS培养基平板上，筛选抗性植株，将抗性植株移栽到土中，收获T2代种子并将其培育为植株(T2代植株)。
[0082]提取T2代植株的叶片的基因组DNA，用Kan-F和Kan-R组成的引物对基因组DNA 进行PCR鉴定(目的带约为795bp )，PCR鉴定为阳性的植株即转基因植株。部分T2代植株的 PCR鉴定电泳图见图10。图10中:M为DL2000PLUS DNA marker ；1为阴性对照(spl-/-纯合突变体拟南芥);2-6为PCR鉴定为阳性的植株。
[0083]Kan-F:5，-GAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3，；
[0084]Kan-R: 5’ -ATGGGGATTGAACAAGATGGA-3 ’。
[0085]三、对照植株的获得
[0086]在重组质粒pSPL5的KpnI酶切位点正向插入序列表的序列4所示的⑶S基因，得到对照质粒。用对照质粒代替重组质粒PSPLAUS进行步骤二，得到对照植株。
[0087]四、转基因植物的鉴定
[0088]取1~2代转基因植株(# 1、# 15、# 16代表3个转基因株系)、T2代对照植株、 spl-/-纯合突变体拟南芥或Landsberg erecta生态型拟南芥的成熟花器官,在亚历山大染色液室温浸泡2-4小时，然后在体视镜下观察。
[0089]结果见图11。Landsberg erecta生态型拟南芥具有正常的亚历山大染色花粉,而 spl-/-纯合突变体拟南芥的花粉不能被亚历山大染色(说明其花粉不可育)，转基因植株具有正常的亚历山大染色花粉，对照植株的花粉不能被亚历山大染色。转基因植株花的不同发育时期中，雄蕊部位的亚历山大染色结果见图12 (A、B、C、D、E依次为拟南芥花发育的I 期、2期、3期、4期和5期)，2期至5期均可观察到被亚历山大染色的花粉。结果表明，本发明提供的启动子可以启动SPL基因表达，从而成功恢复spl-/-纯合突变体拟南芥花粉的不育表型从而获得可育的花粉。
【权利要求】
1.一种DNA分子，自上游至下游依次由片段甲、多克隆位点区和片段乙组成；所述片段甲如序列表的序列I所示，所述片段乙如序列表的序列2所示。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子如序列表的序列3所示。
3.含有权利要求1或2所述DNA分子的重组载体。
4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于:所述重组载体为在pCAMBIA2300载体的不同多克隆位点分别插入所述片段甲和所述DNA片段乙得到的重组质粒。
5.权利要求1或2所述DNA分子在启动外源基因表达中的应用。
6.一种用于表达外源基因的重组质粒，是将所述外源基因插入权利要求3或4所述重组载体中的权利要求1或2所述DNA分子的多克隆位点区，得到用于表达外源基因的重组质粒。
7.权利要求6所述重组质粒在表达所述外源基因中的应用。
8.一种表达外源基因的方法，包括如下步骤:(1)将所述外源基因 插入权利要求3或4所述重组载体中的权利要求1或2所述DNA 分子的多克隆位点区，得到用于表达外源基因的重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒导入植物或植物组织，从而在植物或植物组织中表达所述外源基因。
【文档编号】C12N15/113GK103602680SQ201310545442
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】王东辉, 白书农, 赵峰, 许智宏 申请人:北京大学