一种液泡质子焦磷酸酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种液泡膜质子焦磷酸酶及其编码基因与应用，涉及分子生物学和生物【技术领域】。本发明克隆小麦TAVP基因，并在拟南芥中进行功能鉴定，发掘小麦自身的抗旱抗盐基因，为得到良好的小麦新品系奠定基础。本发明对了解植物抗逆机制具有重大意义，还可为未来分子组装改良作物抗逆，提高作物产量提供理论指导。
【专利说明】一种液泡质子焦磷酸酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学和生物【技术领域】，尤其涉及的是一种液泡质子焦磷酸酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002]干旱是一个世界性问题。全世界有I / 3的耕地处于干旱半干旱状态，有40多个国家缺水。干旱严重影响植物生长及作物种植，给作物的产量造成很大的损失。此外，土壤的盐溃化也是影响农业生产和生态环境的严重问题。随着人口的增加和耕地面积的减少，如何利用大面积的干旱地区土地和盐碱地发展农业，培育出既抗旱又抗盐的作物，已经成为国际上和生物科学技术迫切需要解决的重大课题。
[0003]H+转运无机焦憐酸酶(H+-pyrophosphatase, H+-PPase)是一种区别于 H+-ATPase的H+转运酶，广泛存在于植物和少数藻类、原生动物、细菌以及原始细菌中。在液泡膜上，H+-PPase能够把无机焦磷酸水解产生的自由能和H+跨膜转运相耦联，在将PPi水解为2个Pi的同时，将细胞质中的H+经液泡膜进入液泡内，起质子泵的作用，与液泡膜H+-ATPase —起形成H+跨液泡膜电化学梯度，为各种溶质(如阳离子、阴离子、氨基酸和糖类等)分子跨液泡膜的次级主动运输提供驱动力。通过Na+在液泡中的区隔化，不仅使细胞避免离子毒害.还有助于细胞的渗透调节。另一方面，当Na+被区隔在液泡内时，植物为了维持细胞内的渗透平衡，在它们的细胞质和其它细胞器中就会积累大量的K和有机渗透调节物质，增强植株的保水性，同时，液泡膜H+-PPase表达的变化会影响与生长素分布有关的2种蛋白(三磷酸腺苷酶和生长素外流介体PIN1)的分布和数量。因此，液泡膜H+-PPase基因(vacuolar H+-pyrophosphatase, VP)作用的结果是生长素外流变得更为容易，从而促进根系发育和植株地上部分的生长。
[0004]1992年，Sarafian等构建拟南芥的cDNA文库，第1次筛选克隆出完整的H+-PPasecDNA 序列，命名为 AVPl (Arabidopsis vacuolar H+_pyrophosphatase gene)。此后，人们相继从大麦、甜菜、烟草、水稻、南瓜、绿豆、野大麦中克隆出H+-PPase的cDNA。
[0005]2001年，Gaxiola报道拟南芥液泡膜H+-PPase基因AVPl具有抗旱和抗盐的作用。接着，Park等将AVPl转入商业番茄中获得的了抗旱和耐盐的转基因番茄，为改善作物抗旱提供了新思路。转基因番茄拥有庞大的根系，因而具有较强的保水能力和抗旱能力。转液泡膜H+-PPase基因的植株生长素运输活跃，植物生长快，根系庞大。Guo等将来自盐地碱蓬的H+-PPase基因在拟南芥中过表达也提高了转基因拟南芥的耐旱性和耐盐性。Gao等从盐芥中克隆了 H+-PPase基因，将该基因分别在烟草和小麦中异源表达，获得的转基因植株耐旱耐盐能力都得到了明显增强。Li等将盐芥的液泡膜H+-PPase基因转入小麦增强了小麦的抗旱性。Li等将拟南芥AVPl基因进行异源转化，获得了抗盐抗旱的翦股颖。包爱科等将AVPl基因转入紫花苜蓿中，转基因植株表现出良好的抗逆性。
[0006]小麦是重要的粮食作物，也是世界主要的商品粮之一。我国是世界上小麦年产量唯一过亿吨的最大生产国，同时也是世界上小麦第一大进口国。但是，我国的小麦生产严重受到干旱、盐碱等环境胁迫的影响。解决环境胁迫对小麦生产的影响，培育优质抗旱抗盐小麦新品种是当务之急。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种液泡膜质子焦磷酸酶及其编码基因与应用。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种液泡膜质子焦磷酸酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质:
[0010](I)所述氨基酸残基序列为:
[0011 ] MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGY⑶YLIEEEEGLNDHNVWKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTT LEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDWEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNV⑶NV⑶IAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLlVGAMLPYffFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFm-；
[0012](2)将氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有液泡膜质子焦磷酸酶活性和/或植物抗旱\抗盐相关功能的蛋白质。
[0013]所述的液泡膜质子焦磷酸酶，一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014]所述的液泡膜质子焦磷酸酶的编码基因，是SEQ ID N0.2，其序列为:
[0015]ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG,或是与 SEQ IDN0.2序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
[0016]所述的液泡膜质子焦磷酸酶应用在培育提高抗逆性的植物中。
[0017]所述的液泡膜质子焦磷酸酶的编码基因的应用在培育提高抗逆性的植物中。
[0018]本发明的液泡膜质子焦磷酸酶及其编码基因可提高植物抗逆性水平，在植物抗逆育种中具有良好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1 为表达载体 pCambial380-35S-TAVP-GFP 的 T-DNA 区结构简图。
[0020]图2为转基因拟南芥TAVP基因表达分析。
[0021]图3为不同胁迫处理下转TAVP基因和野生型拟南芥萌发率统计。
[0022]图4为不同胁迫处理下转TAVP基因和野生型拟南芥绿苗率统计。
[0023]图5为不同胁迫处理下转TAVP基因和野生型拟南芥生长状况。
[0024]图6为转TAVP基因和野生型拟南芥幼苗脯氨酸含量分析。
[0025]图7为NaCl胁迫条件下转TAVP基因和野生型拟南芥生长状况。
[0026]图8为NaCl胁迫条件下转TAVP基因和野生型拟南芥脯氨酸含量分析。
[0027]图9为干旱胁迫下转TAVP基因和野生型拟南芥生长状况。
[0028]图10为干旱胁迫条件下转TAVP基因和野生型拟南芥脯氨酸含量分析。
[0029]图11为不同胁迫条件下转TAVP基因和野生型拟南芥电导率测定。
【具体实施方式】
[0030]以下结合具体实 施例，对本发明进行详细说明。
[0031]实施例1液泡膜质子焦磷酸酶(TAVP)的获得
[0032]一、用3' -RACE法获得液泡膜质子焦磷酸酶(TAVP) 3'未端序列[0033]根据已报道的大麦、玉米、水稻的液泡膜质子焦磷酸酶基因(VP)保守区设计引物:TAVP3RACE-S:5/ GCYGAYCTTGTYGGCAARGTT3'(兼并引物,其中，R 和 Y 是兼并碱基符号；R 表示 G 或 A ;Y 表示 T 或 C)和 TAVP3RACE-A:5/ GCAGTGGTAACAACGCAGAGT3'。
[0034]所用小麦抗逆品系为洛旱2号(来自河北省农业科学院抗旱经济作物所)。幼苗培养到两叶一心时期，20% PEG6000处理Ih取全植株，采用TRIZOL (赛百盛公司)法提取小麦总RNA。取I μ g总RNA，采用MMLV(promega公司)制备cDNA，整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行，反转录引物RACERT:AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTAC (T) 3(|。以获得的小麦的cDNA为模板，使用引物TAVP3RACE-S和TAVP3RACE-A进行PCR扩增。
[0035]PCR 反应条件为:98 °C 30sec 预变性，98 °C IOsec 变性，50 °C 30sec 复性，72°C lmin20sec 延伸，15 个循环。98°C IOsec 变性，55°C 30sec 复性，72°C lmin20sec 延伸，20个循环。72°C IOmin延伸。PCR反应体系为:去离子无菌水11.2 μ L，5XReactionBuffer4 μ L, IOmM dNTPsl.5 μ L, 5U / ul Tag 酶 0.3 μ L, cDNAl μ L, Sense Primerl μ L,Antisense Primerl μ L,总体系 20 μ L0
[0036]结果扩增得到约ISOObp的片段，将该产物进行测序，结果表明扩增得到小麦含有VP保守区域的3'端序列(SEQ ID N0.1)。
[0037]SEQ ID N0.1 序列为:
[0038]IgctgatcttgttggcaaagttI gaaaggaacattcctgaagatgacccaaggaacccagct
GTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGA
ATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACC`CACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAG
GCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGT
AATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCC
TGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCC
TACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGG
TTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACG
GCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGT
GACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGC
TGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGT
GCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGC
CATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTC
CGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCT
CCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCT
CTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCC
AACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCC
CCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCC
GTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGC
GTGCTGTTCAGGTACATCTAG
[0039]方框中是3' -RACE法获得的VP基因的保守区。
[0040]二、用5' -RACE法获得液泡膜质子焦磷酸酶基因5'未端序列[0041] 5' -RACE包含了有3个连续的酶反应步骤，即反转录、去磷酸化处理、去帽子反应。上述扩增操作均按照试剂盒推荐的条件进行。去磷酸化主要是利用碱性磷酸酶(如牛小肠碱性磷酸酶，CIP)处理，防止载体自身环化。CIP可以水解掉DNA5末端的磷酸。去帽子反应主要是应用TAP可以去掉mRNA的5帽子结构，使用T4RNA Ligase将5RACE Adaptor连接到mRNA的Y端后。
[0042]5' -RACE接头连接反转录反应的步骤如下所述:以cDNA为模板，使用上游外侧特异性引物 GSPI: TAVP-5-0UT (5 ' GCTTCTTCAGAGCAGGTTCA3 ')和 5 ' RACE 外侧弓 I 物(5' CATGGCTACATGCTGACAGCCTA3')进行第一轮 PCR，第一轮 PCR 产物较弱。将第一轮 PCR产物进行50倍稀释，再使用上游内侧引物GSP2:TAVP-5-1N (5' GCAMGAGCGTGGTGAGCAA3'
)和 5' RACE 内侧引物(5' CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG3/ )进行第二轮 PCR反应。扩增得出PCR片段大小为1053bP。
[0043]第一轮PCR的反应条件为98°C 30S预变性，98°C IOsee变性，55°C 30sec复性，72°C Imin 延伸，35 个循环。72°C IOmin 延伸。
[0044]第二轮PCR的反应条件为98°C 30S预变性，98°C IOsee变性，60°C 30sec复性，72°C Imin 延伸，35 个循环。72°C IOmin 延伸。
[0045]上述扩增其余操作均按照试剂盒推荐的条件进行。
[0046]PCR产物直接测序，测序结果如下。此结果用于后面的序列拼接分析。
[0047]CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATGATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGC
[0048]三、全长液泡膜质子焦磷酸酶基因(VP)的cDNA序列获得
[0049]通过分析所述步骤一和步骤二的PCR获得的3 '和5 '端TAVP序列，利用DNAMAN version5.2.2软件，拼连TAVP基因的全长cDNA，进行生物信息学分析，确定该基因的读码框。合成相应引物扩增出全长cDNA。引物序列如下所述:TAVPQC-S:5' CGGGATCCATGGCGATCCTCGGGGAG3' ；TAVPQC-A:5/ CCCAAGCTTCTAGATGTACCTGAACAGCACGC3' ο
[0050]以小麦cDNA 为模板，利用高保真 SuperStar High-Fidelity 酶(GenStar 公司),以VPQC-S和VPQC-A为引物，PCR扩增液泡膜质子焦磷酸酶基因的全长cDNA。[0051]扩增反应条件为预变性98°C 30S ；98°C 10S，68°C 30S，72°C lmin40S，35 个循环，最后 72°C IOmin0
[0052]PCR扩增得到的产物大小为2286bp (SEQ ID N0.2)。将PCR产物克隆到T-EASY载体(购自promega公司)进行测序。测序结果用primer5软件翻译成氨基酸序列。将该氨基酸序列在NCBI生物数据库进行同源性搜索，结果表明该序列与与大麦中VP基因的氨基酸序列同源性分别达86% (AB032839.1)和98% (D13472.2);与水稻中VP基因的氨基酸序列同源性分别达达 85% (D45384.1),92% (D45384.1),89% (AB126350.1)和 87%(AB126351.1);与小麦已知VP基因的氨基酸序列同源性分别达85% (EU255237.1)和98%(AY296911.1)。因此，我们初步推断克隆获得小麦VP基因编码一新的未曾报道过的液泡膜质子焦磷酸酶。将SEQ ID N0.2翻译成氨基酸序列进行分析，结果表明，自翻译成的该氨基酸序列的氨基端第248位至258位为液泡膜质子焦磷酸酶的保守区。因此，该蛋白可能具有水解焦磷酸的活性。[0053]SEQ ID N0.2 的序列为:
[0054]ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGT
ACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATC
GGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGA
GTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG
[0055]由SEQ ID N0.2翻译成的氨基酸序列为:
[0056]MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGYGDYLIEEEEGLNDHNVVVKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTTLEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDWEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNVGDNVGDIAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLIVGAMLPYWFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFRY1-
[0057]该氨基酸序列全长761个氨基酸，下划线部位为焦磷酸酶的保守区。
[0058]实施例2本发明的液泡膜质子焦磷酸酶及其编码基因的功能验证
[0059]一、液泡膜质子焦磷酸酶基因(TAVP)的表达载体构建
[0060]用PCR扩增pCambial380的35S启动子，所用的引物为5' -CCGAATTCCCCAACATGG`TGGAGC-3'和 5' -CG GGATCC GCGAAAGCTCGAGAGAG-3'，扩增出的35S启动子长度为0.8kb。将该片段用EcoR I和BamH I酶切后插入到pCambial380载体(购自Cambia)的EcoR I和BamH I酶切位点之间得到重组载体，将重组载体命名为pCambial380_35S。
[0061]将TAVP用BamH I和Hind III双酶切后，回收TAVP片段，将其以正向方式插入载体pCambial380-35S的BamH I和Hind III酶切位点之间，得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序鉴定，将鉴定表明正确的含有TAVP的重组表达载体命名为pCambial380-35S-TAVPo用Hind III和Bgl II切割已经构建的GFP-T载体(GFP扩增自常规载体PEGPF-N2，带Hind III和Bgl II酶切位点扩增后连接T载体得到)，将切下的GFP连接到 pCambial380-35S-TAVP 上，最终构建成 pCambial380-35S-TAVP_GFP 载体。载体的T-DNA结构图谱如图1所示。
[0062]pCambial380-35S-TAVP-GFP的T-DNA结构图谱如图1所示，该载体中含有的植物表达载体抗性选择标记为抗潮霉素基因(Hygromycin)抗性，TAVP基因由35S启动子驱动。图1中，RB(right border) LB(left border)分别代表T-DNA区的右边界和左边界；Hyg(R)是编码潮霉素磷酸转移酶的基因，能使受体细胞获得对潮霉素抗性；CaMV35s是来源于花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)的启动子,在双子叶植物中具有很强的活性；Nos来源于根癌农杆菌终止子；TAVP为实施例1所述获得的小麦液泡膜质子焦磷酸酶基因的cDNA。
[0063]二、液泡膜质子焦磷酸酶的编码基因(VP)的转基因拟南芥植株获得
[0064]VP基因及其编码蛋白在单子叶植物(水稻、大麦、玉米)抗逆中具有良好的应用前景。本例以转化受体拟南芥作为示例，通过农杆菌介导的转化方法，将带有pCambial380-35S-TAVP-GFP载体的农杆菌导入拟南芥中，经过筛选，获得转pCambial380-35S-TAVP-GFP 植株，通过鉴定该转 pCambial380-35S-TAVP_GFP 植株的抗逆性能即可确定本发明的液泡膜质子焦磷酸酶及其编码基因的提高植物抗逆性的功能。转pCambial380-35S-TAVP-GFP植株具体获得过程如下:
[0065]1、含有 pCambial380-35S-TAVP_GFP 的农杆菌的获得
[0066]将pCambial380-35S-TAVP_GFP转化农杆菌菌株GV3101，将得到的重组菌进行PCR(以质粒为模板)及酶切鉴定，将鉴定正确的含有pCambial380-35S-TAVP-GFPP的重组工程菌命名为 GV-pCambial380-35S-TAVP-GFP。
[0067]2、拟南芥的培养
[0068]将Columbia型拟南芥的种子放入EP管中春化3-5天。用75%的乙醇消毒Imin,3%的NaClO消毒5min,最后无菌水洗漆种子3_5次后铺种。播种后的拟南芥放入光照培养箱中培养，温度day / night21°C / 18°C，光周期为16h光照/ 8h黑暗，相对湿度70%。
[0069]2-4片真叶时移栽(播种10-12天)。移栽前先对营养土进行湿热灭菌。移栽后，用塑料罩来保湿。拟南芥小苗长出6片叶子后就可以移去塑料罩。
[0070]3、农杆菌转化
[0071]移栽后的拟南芥大约2周后开始进入花期，待主薹抽薹至10-15cm时可作为农杆菌转化的材料。活化农杆菌，扩培至菌液密度为0D_值1.0左右，5000g离心20min收集菌体。用转化介质悬浮菌体至密度0D_为0.8左右。
[0072]去掉拟南芥主薹和侧薹上的角果、花蕾后将拟南芥整个植株完全浸泡在转化介质中，5min后取出植株侧卧在干净的托盘中，用黑色塑料袋覆盖避光恢复培养。24h后弃去塑料袋，将拟南芥扶正，正常培养。2-3周之后，少浇水，加速其衰老，收获种子。
[0073]4、转pCambial380-35S_TAVP植株的鉴定与纯合体的获得
[0074]潮霉素(hygromycin)为链霉菌产生的氨基糖苷类抗生素,抗潮霉素基因表达产物是一个蛋白激酶，通过磷酸化潮霉素B使其丧失活性，由于在真核和原核生物中潮霉素筛选假阳性率低，重复性好，现在通过潮霉素B对转基因生物进行筛选已经在实验室被广泛选用。本实施例所构建的表达载体pCambial380-35S-TAVP-GFP的选择标记为抗潮霉素基因，不仅有利于选择培养时进行筛选，而且可以赋予转基因植株抗潮霉素B特性。因此转pCambial380-35S-TAVP-GFP植株能表现出对潮霉素B的抗性。本实施例用潮霉素对转pCambial380-35S-TAVP-GFP植株进行鉴定，获得阳性植株。具体方法如下所述:
[0075]农杆菌转化后当代植株队代)所收获的种子即为T1代。将其铺于含有25-30 μ g/mL潮霉素抗性的MS平板中，置于光照周期为8h黑暗、16h光照的光照培养箱中(20_22°C )培养。由于农杆菌所转的植物表达载体中具有潮霉素的抗性，因而只有基因转化成功的幼苗才会在含有潮霉素抗性的平板中生长。未转入基因的幼苗在含有潮霉素的MS平板上表现为种子萌发长出两片子叶后不能再继续长出真叶，主根很短且无侧根，子叶一般不展开并随即渐渐枯黄、变白直至死亡。而真正的转入基因幼苗在含有潮霉素抗性的MS平板中生长完全正常。待阳性的转基因幼苗生长IOd左右后将其移栽入营养土中继续培养，单株收获种子(此为T2代)。继续将收获的种子分别铺于含有潮霉素的MS平板中，此时的T2代植株发生潮霉素抗性的性状分离，我们选取抗性与不抗的性状分离比为3:1的植株进行移栽，共需要选择至少10株左右满足此比例的株系，每个平板(株系)移栽20棵幼苗，待成熟后分别单株收获其种子(T3代)。将单株收获的种子每个株系挑10株种子继续铺于含有潮霉素抗性的MS培养基中，无性状分离的即为纯合体(T3代植株)，此编号的种子及其后代即可用于后续生理实验。
[0076]5、转pCambial380-35S-TAVP_GFP拟南芥植株基因表达的鉴定
[0077]I)挑选6个纯合体株系和野生型拟南芥，正常培养。以叶片为材料采用TRIZOL法各自提取总RNA，取2 μ g总RNA，采用MMLV (promega)制备cDNA，整个操作均按照试剂盒推荐的条件进行。以获得的野生型拟南芥和转pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代纯合体植株的cDNA为模板，进行半定量PCR扩增。
[0078]2)根据已报道的拟南芥actin序列设计内参引物，正向引物(ACTIN-S:5' AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC3')，反向引物(ACTIN-A:5' GGACAACGGAATCTCTCAGC3')，PCR反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s ;30个循环；72°C 延伸 5min。
[0079]3)将PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳得到430bp的片段即为拟南芥actin的片段。调节cDNA模板浓度，使野生型拟南芥和转pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代植株扩增片段亮度一致。
[0080]4)根据步骤3)确定的野生型拟南芥和转pCambial380-35S-TAVP_GFPT3代植株cDNA模板浓度，进行TAVP基因的PCR扩增。
[0081]根据我们克隆测序得到的TAVP序列设计内参引物，正向引物(BDL-S:5' GAGCCACAGAATCCGTGAGA3')，反向引物(BDL-A: 5' CACCAGCCAGAACACCAGA3' )，PCR 反应程序为:94°C预变性5min` ;94°C变性30s ;55°C退火30s ;72°C延伸30s ；28个循环；72°C延伸5min。
[0082]将PCR反应产物进行凝胶电泳检测，电泳得到461bp的片段即为TAVP基因。电泳图结果如图2所示，图中1-6为转pCambial380-35S-TAVP-GFPT3代植株(分别为株系9、14、15、16、20、24)，结果表明TAVP基因在拟南芥中得到了表达。
[0083]6、转 pCambial380-35S_TAVP 植株功能验证实验
[0084]I)萌发实验与绿苗率统计
[0085]将野生型和5所述经过表达鉴定的6个纯合体株系的种子，消毒后播种于含有不同胁迫物质(甘露醇300mM、NaCl 125mM、NaCl 150mM、NaCl 175mM)的MS培养基上，每皿不少于50粒种子，3个重复。4天后统计萌发率，6天后统计绿苗率。结果如下图3、图4、图5所示。
[0086]由图3、图4可以看出，野生型拟南芥在胁迫状况下其萌发率与绿苗率均低于转基因拟南芥，由图5可以看出，相同胁迫状况下，野生型的生长状态明显不如转基因株系。
[0087]2)幼苗脯氨酸含量测定
[0088]用培养基中添加甘露醇模拟干旱胁迫，添加NaCl模拟盐胁迫。在I XMS琼脂糖固体培养基上培养T3代转基因拟南芥植株Tp9、Τρ14、Τρ15和野生型拟南芥。7d后转移到含有300mM甘露醇和125mM NaCl、150mM NaCl、175mM NaCl的I XMS琼脂糖固体培养基上，同样条件下继续培养8d。以水杨酸结合法测定转基因拟南芥幼苗脯氨酸含量。结果如下图6所示。[0089]由图6可以看出，无论在干旱胁迫还是在NaCl胁迫下，转基因拟南芥的脯氨酸含量均高于野生型。随着NaCl浓度的升高，野生型和转基因拟南芥的脯氨酸的含量均呈增高的趋势，而在相同胁迫条件下，转基因株系的脯氨酸含量高于野生型，说明转基因植株具有更强的抗逆能力。
[0090]3)成苗脯氨酸含量测定
[0091]分别将MS培养基上培养IOd的转基因植株(Tp9、Tpl4、Tpl5、Tpl6、Tp20和Τρ24)以及野生型幼苗移植到装有定量营养土的营养钵中，每个株系3钵，每钵移植4株，在室温下缓苗7d，分组进行胁迫处理。对盐胁迫处理组用300mmOl PNaCl水溶液浇灌营养土，温室中继续培养至第12天，测定脯氨酸含量；对干旱处理组的控水措施是停止浇水培养14d，然后测定脯氨酸含量。
[0092]由图7看出，NaCl胁迫12天后，野生型拟南芥生长状态明显差于转基因株系，个别植株出现死亡。而转基因株系相对生长快速，植株较野生型更壮。脯氨酸含量分析结果(图8)显示转基因株系含有更高的脯氨酸含量，其抗盐性优于野生型拟南芥。
[0093]由图9看出，干旱胁迫14天后，野生型拟南芥干枯，叶片发黄，有死亡植株出现。而转基因株系虽然出现叶片边缘发黄，但是均存活且生长状况较佳。脯氨酸含量分析结果(图10)显示转基因株系含有更高的脯氨酸含量，其抗旱性优于野生型拟南芥。
[0094]4)成苗电导率测定
[0095]分别将MS培养基上培养IOd的转基因植株(Tp9、Tpl4、Tpl5、Tpl6、Tp20和Τρ24)以及野生型幼苗移植到装有定量营养土的营养钵中，每个株系3钵，每钵移植4株，在室温下缓苗7d，分组进行胁迫处理。对盐胁迫处理组用300mmOl PNaCl水溶液浇灌营养土，温室中继续培养至第12天，测定电导率；对干旱处理组的控水措施是停止浇水培养14d，然后测定电导率。`
[0096]由图11可知，胁迫条件下无论野生型还是转基因拟南芥的电导率均增大，说明其细胞膜遭受不同程度的破坏。而在相同胁迫条件下，野生型电导率高于转基因株系，其细胞膜破坏程度更高，说明转基因拟南芥具有优于野生型的抗逆性。
[0097]应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种液泡膜质子焦磷酸酶，其特征是，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质: (1)所述氨基酸残基序列为:
MAILGELGTEILIPVCGVVGIVFAIAQWFIVSKVKVTPGAAAAGGSKNGYGDYLIEEEEGLNDHNVVVKCAEIQTAISEGATSFLFTMYQYVGMFMVVFAAVIFVFLGSIEGFSTKGQPCTYSTGTCKPALYTALFSTASFLLGAITSLVSGFLGMKIATYANARTTLEARKGVGKAFITAFRSGAVMGFLLSSSGLVVLYITINVFKMYYGDDffEGLFESITGYGLGGSSMALFGRVGGGIYTKAADVGADLVGKVERNIPEDDPRNPAVIADNVGDNVGDIAGMGSDLFGSYAESSCAALVVASISSFGINHDFTAMCYPLLVSSVGIIVCLLTTLFATDFFEIKAASEIEPALKKQLIISTALMTIGVAVISWLALPAKFTIFNFGAQKDVSNWGLFFCVAVGLWAGLIIGFVTEYYTSNAYSPVQDVADSCRTGAATNVIFGLALGYKSVIIPIFAIAVSIYVSFSIAAMYGIAMAALGMLSTMATGLAIDAYGPISDNAGGIAEMAGMSHRIRERTDALDAAGNTTAAIGKGFAIGSAALVSLALFGAFVSRAGVKVVDVLSPKVFIGLIVGAMLPYWFSAMTMKSVGSAALKMVEEVRRQFNTIPGLMEGTAKPDYATCVKISTDASIKEMIPPGALVMLTPLIVGTLFGVETLSGVLAGALVSGVQIAISASNTGGAWDNAKKYIEAGNSEHARSLGPKGSDCHKAAVI⑶TI⑶PLKDTSGPSLNILIKLMAVESLVFAPFFATYGGVLFRY1-: (2)将氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有液泡膜质子焦磷酸酶活性和/或植物抗旱\抗盐相关功能的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的液泡膜质子焦磷酸酶，其特征是，一个或数几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
3.根据权利要求1所 述的液泡膜质子焦磷酸酶的编码基因，其特征是，该编码基因是SEQ ID N0.2，其序列为:
ATGGCGATCCTCGGGGAGCTCGGCACCGAGATCCTCATCCCCGTCTGCGGGGTCGTCGGCATCGTCTTCGCCATCGCGCAGTGGTTCATCGTCTCCAAGGTCAAGGTCACCCCCGGCGCCGCCGCCGCCGGCGGCTCCAAGAACGGCTACGGCGACTACCTCATCGAGGAGGAGGAGGGCCTCAACGACCACAACGTCGTCGTCAAGTGCGCCGAGATCCAGACCGCCATCTCAGAAGGAGCAACATCATTCCTTTTCACCATGTACCAGTATGTTGGTATGTTCATGGTCGTCTTTGCTGCGGTTATCTTCGTCTTCCTTGGGTCAATTGAGGGATTCAGCACAAAGGGCCAGCCCTGCACCTACAGCACGGGCACCTGCAAGCCAGCTCTCTACACCGCCCTCTTCAGCACTGCATCTTTCTTGCTTGGAGCCATCACATCTTTGGTGTCTGGTTTCCTTGGGATGAAGATCGCCACATACGCCAATGCTAGGACGACCCTGGAGGCAAGGAAGGGTGTTGGGAAGGCATTTATCACTGCTTTCCGCTCTGGTGCAGTCATGGGCTTCTTGTTGTCATCAAGTGGGCTTGTGGTTCTTTACATCACCATCAACGTGTTCAAGATGTACTACGGTGATGACTGGGAAGGTCTTTTTGAGTCCATCACTGGTTATGGTCTTGGTGGGTCTTCCATGGCTCTATTCGGAAGAGTTGGTGGAGGTATCTACACCAAGGCTGCTGACGTGGGTGCTGATCTTGTTGGCAAAGTTGAAAGGAACATTCCTGAAGATGACCCAAGGAACCCAGCTGTGATTGCTGACAATGTCGGTGACAATGTTGGTGATATTGCTGGAATGGGATCAGATCTCTTTGGTTCATACGCAGAATCTTCCTGTGCTGCTCTTGTTGTTGCTTCTATCTCATCTTTTGGAATCAACCATGATTTCACTGCGATGTGCTACCCACTGCTCGTGAGCTCTGTCGGCATCATTGTTTGCTTGCTCACCACGCTCTTTGCAACTGATTTCTTCGAGATCAAGGCTGCAAGCGAAATTGAACCTGCTCTGAAGAAGCAGCTCATCATCTCCACTGCTTTAATGACCATCGGTGTTGCGGTAATCAGCTGGTTGGCTCTTCCAGCTAAGTTCACCATCTTCAACTTCGGTGCTCAGAAGGACGTGTCCAACTGGGGCCTGTTCTTCTGCGTGGCAGTTGGTCTGTGGGCTGGTCTGATTATTGGGTTTGTGACCGAGTACTACACTAGCAATGCCTACAGCCCTGTGCAAGATGTTGCCGATTCCTGCAGAACTGGTGCTGCCACCAACGTCATCTTCGGTCTTGCCCTGGGTTACAAGTCCGTCATCATCCCAATTTTCGCTATTGCTGTCAGCATCTACGTCAGCTTCTCTATTGCTGCGATGTACGGCATTGCAATGGCTGCTCTTGGCATGCTTAGCACAATGGCAACTGGTCTTGCGATCGATGCTTATGGTCCCATTAGTGACAATGCTGGTGGAATTGCTGAGATGGCTGGCATGAGCCACAGAATCCGTGAGAGGACTGATGCTCTTGATGCTGCTGGCAACACAACCGCTGCTATTGGAAAGGGTTTCGCCATTGGATCAGCTGCTCTTGTGTCCCTGGCACTTTTCGGTGCTTTTGTCAGCAGAGCCGGCGTGAAGGTCGTCGATGTCCTATCTCCCAAGGTGTTCATTGGCCTGATTGTTGGAGCCATGCTTCCGTACTGGTTCTCTGCCATGACCATGAAGAGTGTTGGAAGTGCTGCTCTCAAGATGGTTGAGGAGGTCCGCAGGCAGTTCAACACCATCCCCGGACTGATGGAGGGAACTGCCAAGCCCGACTATGCCACCTGTGTCAAGATCTCCACTGATGCTTCCATCAAGGAGATGATCCCTCCGGGTGCTTTGGTCATGCTCACCCCCCTCATTGTCGGAACCCTCTTCGGCGTGGAAACCCTGTCTGGTGTTCTGGCTGGTGCCCTTGTTTCTGGAGTGCAGATCGCCATCTCTGCTTCCAACACCGGCGGTGCATGGGACAACGCAAAGAAGTACATTGAGGCTGGCAACAGCGAGCACGCGAGGTCCCTTGGCCCCAAGGGTTCAGACTGCCACAAGGCGGCCGTGATCGGCGACACCATCGGAGACCCCCTCAAGGACACCTCAGGCCCGTCGCTCAACATCCTCATCAAGCTCATGGCCGTCGAGTCCCTCGTGTTTGCGCCCTTCTTTGCCACGTACGGAGGCGTGCTGTTCAGGTACATCTAG,或是与 SEQ ID N0.2序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4.根据权利要求1-2任一所述的液泡膜质子焦磷酸酶的应用，其特征是，应用在培育提高抗逆性的植物中。
5.根据权利要求3所述的液泡膜质子焦磷酸酶的编码基因的应用，其特征是，应用在培育提高抗逆性的植物中。
【文档编号】C12N15/55GK103602644SQ201310544893
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】朱昀, 李朝炜, 刘颖, 魏景芳, 李冬杰 申请人:朱昀