一种新型重组蛋白及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种能用于预防和治疗1型糖尿病的新型重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6×(IA2-P2)。通过基因操作，将1型糖尿病特异的一段抗原表位IA2-P2串联6段，在C端加His标签，再在N端加源于破伤风毒素的T辅助表位肽段以及源于胆固醇脂转移蛋白的B细胞表位肽段并融合到门冬酰胺酶的C端，形成一种新的重组蛋白和相应编码基因。该基因在大肠杆菌中高效表达，生成的重组蛋白能分泌到周质中并大部分保持有门冬酰胺酶活性，并能通过镍柱层析分离法快速制备。重组蛋白将6个抗原表位IA2-P2肽呈现到门冬酰胺酶表面，增强了抗原表位IA2-P2的免疫原性，动物实验结果显示：新型重组蛋白具有显著的降低STZ诱导的1型糖尿病雄性C57BL／6J小鼠空腹血糖的活性，具有防治1型糖尿病的作用。
【专利说明】一种新型重组蛋白及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA重组技术、蛋白分离纯化技术及医学相关领域。更具体地，本发明涉及重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的构建、表达及分离纯化。在医学领域中，本发明是一种重组蛋白，能用于预防和治疗I型糖尿病。
【背景技术】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰岛素相对或绝对不足为特征的代谢性疾病，胰岛素相对或绝对不足引发高血糖，进而导致三大营养物质代谢紊乱，最终影响患者正常生理功能并且引起并发症。全球糖尿病患者与日俱增，预计2030年将达到4.39亿。糖尿病带来的危害，几乎都来自它的并发症。例如动脉粥样硬化、糖尿病肾病、高血压、糖尿病眼病、糖尿病足等己成为导致糖尿病致死、致残的主要原因。
[0003]胰岛素绝对缺乏为I型糖尿病，胰岛素相对缺乏为2型糖尿病。I型糖尿病又名胰岛素依赖型糖尿病(Typeldiabetes mellitus,T1DM)是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种代谢异常综合征。由于机体自身反应性免疫应答攻击胰岛β细胞，使其遭破坏、功能缺失，从而导致胰岛素绝对缺乏所引起的糖尿病。由于β细胞具有产生胰岛素和调节血糖的功能，β细胞群的毁坏最终导致了血糖的失调和高糖血症的发生。TlDM是由T细胞介导的器官特异性自身免疫性疾病，自身免疫性疾病(autoimmune disease)是因机体免疫系统对自身成分发生免疫应答而导致的疾病状态。通过一定的免疫途径来诱导机体对致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效预防自身免疫性疾病的发生。
[0004]P277肽是HSP60的437~460位的一段特异性多肽，共24个氨基酸，也是能与效应T细胞反应的抗原决定簇，是在TlDM中发挥作用的特异片段。DiaPep277目前以进入III期临床研究。已有实验研究发现按照国外DiaPep277相同的皮下给药方式，用P277肽进行给药，能引起血管内皮细胞损伤，并诱发肌体产生抗体从而诱发严重的动脉粥样硬化；并将P277分成Pl肽段(437~450)和P2肽段(448~460)两部分，发现Pl多肽具有一定的促动脉粥样硬化作用，而P2多肽却没有。经过改构，选用胰岛细胞特异抗原-胰岛素相关蛋白(IA2)近膜区JM2的两个线形B表位:IA2的626~630位(626FEYQD630)和IA2的621 ~628 位(621Hgdttfey628)，即用 621Hgdttfeyqd630 替换 P277 的 347 ~446 位肽段，合成多肽IA2-P2。实验证明IA2-P2能有效的降低NOD小鼠糖尿病的发病率，增加小鼠的存活率。6X (IA2-P2)融合表达在HSP65后面的融合蛋白能对NOD小鼠产生治疗糖尿病的疗效，相对于单串的IA2-P2，六串可以起到加强免疫的效果。
[0005]门冬酰胺酶的抗癌作用早在1953年就被科学家发现，经过比较自然界中不同微生物产生的门冬酰胺酶之后，人们发现，由大肠杆菌(Escherichia coli)和菊欧文氏菌(Erwinia chrysanthemi)产生的酶具有最好的抗癌能力，除此之外，大肠杆菌产生的酶不仅效果好而且还容易做到大量生产，所以成为了目前门冬酰胺酶的主要来源。大肠杆菌内有两种L-门冬酰胺酶，一种是位于细胞质中的低亲和性L-门冬酰胺酶I (AnsA)，另一种是具有高亲和性的分泌表达的L-门冬酰胺酶II (AnsB) ,Michael等通过寡聚核苷酸引物从大肠杆菌野生菌株中克隆得到AnsB。AnsB单体没有催化天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨的活性，当单体聚合成四聚体、八聚体或者十二聚体形式时，才具有酶活性。
[0006]门冬酰胺酶作为有效表位载体有许多优点:(I)门冬酰胺酶活力测定的灵敏度高，如果呈现构象化表位的酶依然具有活力，这相当于构象化多肽己被酶标记，并且不影响多肽与抗体的结合活性。(2)门冬酰胺酶由四个相同亚基构成，因此一个酶分子上呈现有四个环状多肽，能方便地设计“夹心法”等酶联免疫测定方法。(3)在门冬酰胺酶PAGE电泳时还发现该酶有形成多聚分子的倾向，能形成二聚体、三聚体和四聚体蛋白，这种颗粒化倾向有利于增强免疫原性。该酶在临床应用中已经显示有很强的免疫原性，能用于发展疫苗。
(4)门冬酰胺酶是血中半衰期较长的药物。若肌肉注射也能缓慢吸收。有足够时间供抗原充分发挥免疫刺激作用。(5)门冬酰胺酶也有一个二硫键，能分泌到细胞周质腔(periplasm)折叠，在周质腔氧化环境中二硫键容易自发形成。(6)将抗原多肽通过T细胞表位肽段与门冬酰胺酶C端融合，在细菌中高效表达并分泌到细胞周质腔中，这种基因工程菌在周质腔中含大量表面呈现有抗原多肽的重组门冬酰胺酶，能够直接用于发展活菌苗或灭活菌苗。
(7)门冬酰胺酶己经在临床上用于治疗白血病和淋巴瘤，其安全性已经得到验证，用该酶作为呈现载体，开发用于人体的药物，将是较为安全的。
【发明内容】
[0007]发明目的:
[0008]本发明的一个目的是提供一种具有降血糖作用的新型重组蛋白。
[0009]本发明的另一个目的是提供生产该重组蛋白的方法。
[0010]本发明的再一个目的 是提供该重组蛋白的用途。
[0011]在本发明的第一方面，提供了一种具有降血糖作用的新型重组蛋白，它是通过基因操作，将I型糖尿病特异的一段抗原表位IA2-P2串联6段，在C端加His标签，再在N端加源于破伤风毒素的T辅助表位肽段以及源于胆固醇脂转移蛋白的B细胞表位肽段并融合到门冬酰胺酶的C端，其形成的融合基因置于pET-28a载体T7启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2) -His。TTP可诱发机体产生较强的免疫应答；CETPC可诱导机体产生抗CETP抗体。
[0012]在本发明的第二方面，提供了一种具有降血糖作用的新型重组蛋白的制备方法。其特征在于，该方法包含步骤:
[0013](a)在适合表达的条件下，培养权利要求4，5所述的质粒载体及其工程菌。
[0014](b)从培养物中分离、纯化出SEQ NO:1所示氨基酸序列的新型重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)。
[0015]在一优选例中，本发明的方法中，所述的步骤(b)包括:
[0016]通过溶菌、离心、镍柱亲和层析等方法分离出蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)，透析除盐并冻干。
[0017]在本发明的第三方面，通过连续5天低剂量STZ腹腔注射雄性C57BL / 6J小鼠(5周龄)造模，分别于6周龄、9周龄、12周龄用纯化的重组蛋白鼻粘膜免疫造模小鼠，每月测定小鼠体内血糖水平的变化。【专利附图】
【附图说明】
[0018]图1 重组质粒 pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2_P2)-His 构建原理示意图
[0019]图2AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His 基因测序图
[0020]图312 % SDS-PAGE电泳检测重组菌经乳糖诱导表达融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)结果
[0021]图412 % SDS-PAGE电泳检测重组菌经镍柱亲和层析纯化融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)结果
[0022]图5多次鼻粘膜免疫AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)对I型糖尿病模型小鼠血糖的影响
【具体实施方式】
[0023]以下通过附图及实施例对本发明作进一步说明。
[0024]本说明书中所提到的材料中:
[0025](I)宿主菌和质粒
[0026]宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌种，基因工程研究相关的实验室一般都有保存。pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6XP277载体为本实验室构建并保存。含有质粒PGH-6X (IA2-P2)-His的Tg I甘油菌由上海希皮吉公司提供。
[0027](2)酶和试剂
[0028]分子克隆工具酶为Fermentas公司；质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒均为上海生工生物工程有限公司；Ni Sepharose?6Fast Flow为GE公司；链脲佐菌素(STZ)为Sigma公司；血糖试纸及血糖仪均购自台湾博士珑。
[0029](3)培养基
[0030]LB 培养基，配方见参考文献 Sambrook J, FristshE F, Maniatis T.MolecularCloning ；A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
[0031]本说明书所提及的方法中质粒提取、PCR反应、内切酶酶切、DNA片段的回收、连接和转化大肠杆菌，这些都是基因工程研究领域的常规操作方法，具体参见Samtoook J，FristshE F, Maniatis T.Molecular Cloning ；A Laboratory Manual2nd ed.NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989, pp.16-340。
[0032]实施例1:AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His 基因的克隆
[0033]用上海生工试剂盒，抽提质粒pGH_6X (IA2-P2)_His。质粒用Hind III和Nhe I酶切，经I %琼脂糖凝胶电泳后用上海生工试剂盒回收目的基因6 X (IA2-P2)。
[0034]载体pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6XP277 同样经过试剂盒抽提、Hind III 和 NheI酶切以及试剂盒回收后，与目的基因6X (IA2-P2)用T4DNA连接酶4°C过夜连接，转化至E.coli BL21感受态细胞后涂布到含50 μ g / ml卡那霉素的LB固体培养基上，37°C培养过夜。
[0035]挑取单菌落，过夜培养后试剂盒抽提质粒pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)-His，用HindIII和Nhe I酶切，经I %琼脂糖凝胶电泳初筛阳性克隆。
[0036]将阳性克隆送至生工生物测序公司进行测序，测序结果经软件比对，验证了基因克隆的正确性(参见图2)。[0037]实施例2:AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His基因在大肠杆菌中的表达及培养
[0038]重组表达菌以I %接种量在液体LB培养基中37°C振荡过夜后，按1%的接种量转接于新鲜的液体LB培养基中，培养3h后加入终浓度为5mmol / L乳糖诱导表达，8h后收集菌体，留样进行SDS-PAGE分析(参见图3)。融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)在诱导后5h达到稳定的最大表达量，相对分子质量与理论值一致，并在胞内主要以可溶形式表达，经检测具有门冬酰胺酶活性。
[0039]实施例3:重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)的分离纯化
[0040]挑选高表达量菌株，接种于LB培养中，37°C过夜培养；过夜培养液转接入新鲜的液体LB培养基中，37°C扩大培养，选取最优发酵条件获得发酵菌体。8000r / min离心15min,用30ml Binding buffer重悬菌体。用超声破碎法裂解细胞，时间15min。12000r /min离心15min,收集上清。
[0041]菌体裂解液的上清液用0.45 μ m滤膜过滤确保澄清，用镍亲和层析柱纯化，同时样品及Binding buffer中加适量NaCl。相关操作过程参照GE公司提供的操作指南进行。具体过程如下:转移树脂到柱子，待完全沉淀后，用双蒸水洗涤镍亲和层析柱，并防止下一步Ni2+沉淀；用dd H20洗漆，除尽基质中的空气；10X柱体积的Binding buffer平衡一上样一IOX柱体积的Binding buffer洗漆，收集流出液一Elution buffer洗脱一得到重组蛋白 AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)(参见图 4)。
[0042]实施例4 =STZ诱导I型糖尿病TlDM模型
[0043]选用5周龄雄性C57BL / 6J小鼠，随机分组，用0.1M pH4.4柠檬酸盐缓冲液配置STZ (浓度为4mg / ml)，按40mg / kg剂量腹腔注射，每日I次，连续注射5次。第一次造模前禁食12h，之后造模前禁食4h。
[0044]实施例5:AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)重组蛋白的降血糖作用
[0045]将实施例4得到的造模成功的TlDM模型小鼠随机分为3组，分别为PBS鼻粘膜免疫对照组、AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)鼻粘膜免疫实验组和HSP65-6 X (IA2-P2)鼻粘膜免疫实验组，每组各 10 只。AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)和 HSP65-6X (IA2-P2)都用 PBS溶解并配置成浓度为5 μ g/μ I的蛋白溶液。分别鼻粘膜免疫对应的蛋白20μ I /只(PBS对照组20 μl PBS /只)。以后每隔3周加强免疫一次，共进行2次加强免疫。造模前和造模后各测一次血糖、体重，此后一个月检测一次血糖、体重。测定血糖前禁食8h，断尾采血。
[0046]结果显示，与PBS鼻粘膜免疫对照组相比，AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)鼻粘膜免疫实验组能显著降低STZ诱导的TlDM模型鼠的血糖浓度(P〈0.05)，也优于以HSP65呈递的HSP65-6X (IA2-P2)鼻粘膜免疫实验组(参见图5)。
[0047]除上述事实外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换性的技术方案，均落于本发明要求的保护范围。
【权利要求】
1.一种新型重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)，其特征在于它包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的新型重组蛋白，其特征在于它包含SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
3.一种载体，其特征在于:它含权利要求2所述的核苷酸序列及权利要求1所述的重组方法:通过基因操作，将I型糖尿病特异的一段抗原表位IA2-P2串联6段，在C端加His标签，再在N端加源于破伤风毒素的T辅助表位肽段以及源于胆固醇脂转移蛋白的B细胞表位肽段并融合到门冬酰胺酶的C端，其形成的融合基因置于pET-28a载体T7启动子的下游。这个重组的融合表达质粒称pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2) -His，表达产物具有门冬酰胺酶活性。
4.一种基因工程菌，其特征在于含有权利要求3所述的载体。
5.一种新型重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的制备方法，其特征在于该方法包含步骤: (I)在适合的表达条件下，培养权利要求4所述的宿主菌。 (II)通过溶菌、镍柱亲和层析方法，分离出AnsB-TTP-CETPC-6X(IA2-P2)重组蛋白，形成权利要求1所示的AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的新型重组蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X(IA2-P2)的门冬酰胺酶活性，且具有显著的降低STZ诱导的I型糖尿病模型雄性C57BL / 6J小鼠空腹血糖的活性，有望用于治疗I型糖尿病。
7.根据权利要求1所述得到的新型重组蛋白，其特征在于可与药物活性成分组合制成药物组合物。
8.根据权利要求7所述所述的药物活性成分物质为胰岛素、双胍类、磺脲类；其中双胍类包括苯乙双胍、丁二胍、二甲双胍；磺脲类药物包括列苯脲、米克胰、格列齐特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖适平、美吡达、糖肾平。
【文档编号】C12R1/19GK103554270SQ201310545262
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月7日 优先权日:2013年11月7日
【发明者】李泰明, 张若洋, 韩萌萌, 李苹苹, 王岐信, 焦琳方, 王全逸, 刘俊, 伍欣晔 申请人:中国药科大学