专利名称：质粒dna定量检测用标准品的制备方法
技术领域：
本发明属于生化分析领域，涉及一种可溯源的质粒DNA定量方法，具体涉及质粒 DNA定量检测用标准品的制备方法。
背景技术：
质粒DNA是游离于染色体外的小型(l_200kb)的共价、闭合、环状的双链DNA分子， 能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。
质粒DNA定量在分子生物学领域有广泛的需求，如进行克隆文库构建时的酶切和 连接操作，以及对质粒DNA进行测序时，为了得到良好的后续实验结果，都需要对质粒DNA 的浓度进行准确测定。
现有的测定DNA的技术虽然有些可以用于测定质粒DNA，但都有不足。有的需要 的DNA样品量非常大，比如ICP-OES方法；有的成本较高，如digital PCR方法耗材太贵；有 的准确度达不到要求，例如PicoGreen荧光染料法对核酸进行定量时具有以下两个缺点 一是目前市售的试剂盒中DNA标准品的含量值均为厂家提供的一个参考值，一般是通过紫 外吸收(0D260)确定的，不同厂家不同批次数值都不同，也没有相关的不确定度信息和溯源 性。第二，由于PicoGreen对不同分子大小的DNA结合效率会有差异，如果依据定量的DNA 标准和所测定的DNA样本分子大小差异很大时，会导致对样本定量结果的偏差很大，而目 前商业化的试剂盒中均只有一个分子大小的DNA标准，即Lambda噬菌体DNA标准(48. 5K)。 有报道称以Lambda为标准，如果对分子量<23kb的DNA进行定量，测定结果会比真实结果 偏低。因此，如果对质粒DNA采用PicoGreen法定量，由于质粒DNA标准品的缺乏，现有的 商业化的试剂盒还无法满足要求。
因为目前没有含有准确量值的质粒DNA标准可用作PicoGreen法定量质粒的标 准。由于该量值直接关系到试剂盒定量方法的准确度高低，因此需要要研制质粒DNA标准 品O
而得到质粒DNA标准品必须选择准确度高，溯源途径清晰的DNA绝对定量方法。
利用液相色谱一同位素稀释质谱法(LC-1DMS)测定寡核苷酸的文献已有报道，是 通过酶解寡核苷酸，测定水解后的单核苷酸浓度来测算核酸的浓度。然而，与寡核苷酸不同 的是，单纯利用酶对基因组或质粒DNA进行完全水解非常困难。
本发明人曾经通过将超声波处理结合酶解实现对基因组DNA (Lambda DNA)的定 量(参见 Analytical bioanalytical chemistry, 2012,402,2079-2088.)。米用超声波 + 酶 解+LC/MS方法；超声波强度为7，使用了两种酶，实现了对大片段的基因组DNA定量测定。
但是，该文章公开的方法测定的对象是分子量较大的基因组DNA，并不是质粒 DNA。因为基因组DNA分子量更大，而且结构有差异，不象质粒DNA那样的环状，所以此方法 的超声波条件、酶解条件等并不适用于质粒DNA定量。
发明内容
本发明的目的是提供一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，该方法应准确度高，精密度好，相对扩展不确定度2. 3%。
本发明首次建立了质粒DNA超声波-同位素稀释质谱定量方法，达到了上述发明目的。
本发明的技术方案是
将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标， 用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量；
其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后，进行酶解，条件为
I)所述超声波处理条件如下强度5，时间25min，上样量为100 μ L，DNA浓度 10-50ng/yL，工作循环:10%，爆破/循环:200，温度4° C ；
2 )所述酶是磷酸二酯酶(SVP );
3)磷酸二酯酶的活性浓度为O. 02-0. 025U/l·! L，最佳活性浓度为O. 022U/μ L ；
4)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为IOOmin以上，最佳时间是120min。
酶解时用磷酸二酯酶工作缓冲液将质粒样品制成溶液，所述缓冲液的组成为
Tris-HCl (pH=8. 8)IOOmM,
NH4AcIOmM,
Mg (Ac) 22300mM
酶解质粒DNA样品体系见表1:
表I酶解质粒DNA样品体系组成
权利要求
1.一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA进行前处理，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱法分离单核苷酸并准确定量；其特征为，所述前处理是将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段，然后进行酶解。
2.权利要求1所述的方法，所述前处理条件为1)超声波处理米用声波聚焦超声波破碎仪处理，强度5，时间25min,上样量为 100 μ L，DNA 浓度10-50ng/yL，工作循环10%，爆破 / 循环200，温度4° C;2)所述酶是磷酸二酯酶；活性浓度为O.02-0. 025U/ μ L ；3)磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为IOOmin以上。
3.权利要求1所述的方法，酶解时使用磷酸二酯酶工作缓冲液，所述缓冲液的组成为 Tris-HCllOOmM, NH4AclOmM, Mg (Ac) 2300mM，其中 Tris-HCl 的 pH 为 8. 8。
4.权利要求1所述的方法，所述酶解质粒DNA样品体系组成为磷酸二酯酶5.0μ L，磷酸二酯酶工作缓冲液，超声处理的质粒DNA50 μ L，同位素标记核苷酸LdNMP混合液5. O μ L。
5.权利要求4所述的方法，所述同位素标记核苷酸混合液的制备方法是，加入13-C、 15 — N同位素的核苷酸,使溶液中同位素标记核苷酸含量与使质粒分子样品中dNMP含量的比值接近1:1。
6.权利要求1所述的方法，所述高效液相色谱分析中，色谱条件为流动相A:20mM醋酸铵，pH=3. 5 ;流动相B :乙腈。
7.权利要求1 6中任一所述的方法，磷酸二酯酶活性浓度为O.022υ/μ L。
8.权利要求1 6中任一所述的方法，磷酸二酯酶水解质粒DNA时间为120min。
全文摘要
本发明首次建立了一种质粒DNA定量检测用标准品的制备方法，将质粒DNA经超声波处理成为长度为200bp以下的片段后，进行酶解，然后以核苷酸标准品和同位素标记的核苷酸作为内标，用高效液相色谱-质谱分离单核苷酸并准确定量。本发明提供了超声波处理质粒DNA的优选条件和高效液相色谱法分离四种核苷酸的条件。本方法精密度好，准确度高采用核苷酸标准品，不依赖于DNA标准品，因此测量结果可溯源至核苷酸有证标准物质，从而保证测量结果的可靠和可溯源。由于用本方法可对质粒DNA进行绝对定量，可用于质粒DNA定量检测用标准品的制备。
文档编号G01N30/02GK103063783SQ20121054117
公开日2013年4月24日 申请日期2012年12月13日 优先权日2012年12月13日
发明者董莲华, 孟盈, 王晶, 傅博强, 高运华, 张玲 申请人:中国计量科学研究院