用于Marker I的制备质粒的构建方法及用途
【专利摘要】本发明构建了一种高效稳定的原核重组质粒。本发明将DNA?Marker的各大小不同的DNA片段连接到受体载体上，形成一个高效稳定的重组质粒。本发明大大降低了DNA?Marker的生产成本，提高了生产效率，且酶切产物条带均一、锐利，本发明生产出的DNA?Marker稳定性要远远高于现在使用PCR法得到的DNA?Marker，可长期保存于室温状态。不仅可以应用于一般生物实验室中的DNA电泳过程中的分子量指示，还可应用于临床检测。本发明对提高DNA?Marker的生产效率和质量具有重要的意义。
【专利说明】用于Marker I的制备质粒的构建方法及用途
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学与基因工程领域，涉及一种用于低成本快速生产高质量DNA Marker的质粒及其构建方法，同时涉及利用该质粒生产DNA Marker的方法与应用。
【背景技术】
[0002]基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术,是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外分子水平上对DNA进行切割、连接、转化等一系列操作的过程，构建杂种DNA分子。基因工程是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，诞生于20世纪70年代的一门崭新的生物科学技术。尽管该技术是一门年轻的技术，但其在生命科学、生物医学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
[0003]在DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的扩增、纯化、切割、连接等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA扩增和电泳。DNA扩增是指通过PCR (聚合酶链式反应)技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出不同大小的DNA片段。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在支持介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA扩增和电泳是基因工程中最基本的技术。
[0004]在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的长度)呈线性关系。因此，可以用一组分子量(长度)已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量的DNA片段混合物就成为DNA分子量标准，简称DNA Marker。DNA Marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现DNA Marker的原理非常简单,但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的 DNA Marker 产品。
[0005]在DNA Marker的制备上，目前主要有两种方法:酶切法和PCR法。
[0006]酶切法分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清洗的基因组DNA分子，用一种或几种限制性内切酶进行消化。从而产生一系列DNA片段组合。用该方法生产的最经典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker, Lambda卩遼菌体基因组DNA经过内切酶Hind III消化后，产生125bp至23130bp大小的8条条带。用这种方法生产DNAMarker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显而易见的:1、条带距离不均匀，由于来自天然的基因组，DNA分子上的酶切位点的位置也是天然的，是不可控的，因此DNA Marker中有的两个条带之间相距很远，不能清晰地指示该区域内的未知DNA分子量情况，有的两个条带之间距离很近，难以清晰地分开；2、基于同样的原因，条带的分子量未能是整数；3、条带亮度严重不均一，由于对应片段在基因组中的拷贝数不可控，分子量大的条带的亮度与分子量较小的条带的亮度相差很远，以Lambda DNA/Hind IIIMarker为例，最大的条带23130bp与最小的条带125bp在亮度上要相差上百倍，电泳过程中往往导致大条带为实现良好分离而小条带已经严重扩散导致亮度很低甚至不可见。
[0007]PCR法是根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了 DNA Marker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNA Marker。但其成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差，稳定性不高，不易长时期保存，且保存环境在-20度，不能保存在室温条件下，不便于使用。
[0008]为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA Marker0通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，稳定性高，可长期保存在室温状态，一旦质粒构建好，后续生产成本低。
[0009]酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA Marker (比如IOObp DNA Ladder,条带为IOObp, 200bp, 300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。
[0010]完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA Marker质量较好。
[0011]综上所述，在目前DNA Marker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式，虽然该方法简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性的生产，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。 酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流。
[0012]本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一'丨生。
[0013]通过检索，发现与本发明专利申请相关的如下专利公开文献:
[0014]1、一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途(CN102337284A)，本发明所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段,各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。本发明还提供了低成本快速制备DNA分子量标准的方法，用该方法生产的DNA Marker具有条带锐利，亮度均一或可随意控制，批次间重复性好等特点。
[0015]2、AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA Marker的制备方法(CN102146370A)，其技术方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆转化，验证条带在DGGE胶片上的位置，制作AMF群落多样性巢式PCR-DGGE Marker，使用NS31-GC和GloI为引物进行PCR扩增，结合序列分析结果并命名使用。本发明在AMF群落结构的Nested ? PCR-DGGE研究中有重要的应用价值。可缩短实验时间，尤其适用实验样品量大的实验过程。依照本发明可以开发出一系列研究AMF群落的DNA Marker,使得巢式PCR-DGGE技术在AMF分子群落研究中更加适用、快捷、准确。
[0016]通过对比，本发明专利申请与上述的专利公开文献存在本质的不同。
【发明内容】
[0017]本发明的目的在于提供一种可以用于生产低成本高质量DNA Marker的重组质粒。利用这种酶切质粒的方法制备DNA Marker具有成本低，速度快，产物条带均一、锐利，条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示。本发明也同时提供了该DNA Marker的质粒的构建方法。
[0018]本发明根据准备生产的DNA Marker的条带组成一个大片段，与特定载体相连后，便得重组质粒可以分别用单一的酶释放组成DNA Marker中的各片段，对载体中各片段的拷贝数设计使得酶切后得到的各条带的量基本一致。然后，将构建好的质粒扩增后，用完全酶切的方法制备DNA Marker。
[0019]本发明的优点和有益效果为:
[0020]1、本发明DNA Marker制备方法方法稳定性高，可以保证批次之间重复性的生产，从而实现大规模生产；本方法生产过程简单，前期载体构建好后，后期Marker生产成本很低，生产量可大可小，存放非常方便。
[0021]2、本发明DNA Marker制备方法根据现有的DL2000设计出所需要的DNA Marker的片段并加以改动，另外又在其基础上加上了一条3000bp的条带，使得此DNA Marker更具有实用价值。
`[0022]3、本发明DNA Marker制备方法所获得的DNA Marker产物使用时具有条带均一、锐利、条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示，而且可长期存放于室温条件下，便于使用。
[0023]4、本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一'丨生。
[0024]本发明提供了一个DNA Marker制备的质粒,所述质粒符合下列要求:
[0025]含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段(为DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)，且质粒中每两个相邻的所述酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
[0026]目标DNA Marker的片段大小可以根据需求设计。
[0027]所述单酶切位点可以是II型限制性内切酶酶切位点。所述的酶切位点应该是任意片段内不存在多余的识别位点而且不与载体构建过程中的酶相冲突的II型限制性内切酶酶切位点，且应该选择酶切效果好的酶切位点。且这些单酶切位点仅存在于各DNAMarker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部。由于单一的酶释放即能得到组成目标DNA Marker的各片段，因此，质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的碱基数均与目标DNA Marker中某一 DNA片段的碱基数相等。满足上述设计要求的质粒能用单一的酶释放得到组成目标DNA Marker的各片段。
[0028]根据Marker I设计出所需要的DNA Marker的片段。为了构建出这样的质粒,我们在原有的受体质粒上连接上含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，先在体外将设计好的各DNA Marker片段连接成为一条单独的长链DNA片段，再将其与载体相连，随后进行转化。得到所需要的重组质粒。
[0029]本发明进一步公开了符合上述设计要求的用于DNA Marker制备的质粒的制备方法。
[0030]本发明是在体外先进行连接反应，将设计好的带有单酶切位点的DNA Marker的片段进行连接，随后进行PCR反应，得到一整条片段连接到受体载体中。
[0031]从图2可以看出，该质粒共有11个条带，受体质粒本身是一个大小为3015bp的质粒，采用受体质粒上不存在的酶切位点进行构建，最终使用EcoR 1、Xho 1、Hind II1、BamHI进行酶切。
[0032]该质粒的制备方法具体包括如下的步骤:
[0033](I)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求:含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)。
[0034](2)各DNA Marker片段两端含有不同的酶切位点，且后一片断的5’端所带酶切位点与前一片断3’端所带酶`切位点相同，第一个片段和最后一个片段分别在5’端和3’端带有两种酶切位点，第2、4、7、8片段的3’端带有两种酶切位点，相应的后一片断的5’端带有与前一片段3’端相同的酶切位点，其余均只带有一个酶切位点，且各片段两端的酶切位点在各片段上不存在。
[0035](3)将这些DNA Marker片段先进行PCR反应，得到单一的目的条带，回收后进行酶切反应，将这些片段进行连接，随后进行PCR反应，最终得到一条1225bp的片段。
[0036](4)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，且该骨架载体上不带有EcoR I酶切位点，随后将1225bp片段连接进入骨架载体，构建得到一个重组质粒。
[0037]步骤I中目标质粒的设计还可进一步满足之前所述的各种要求。
[0038]步骤2中，各DNA Marker片段两端所含的酶切位点各不相同，且同一片段的两端酶切位点也不可相同。后一个片段的5’端的酶切位点与前一片段3’端带有的酶切位点相同。各片段中间不能带有外加的各酶切位点。
[0039]步骤3中，各片段通过PCR及回收后，进行酶切反应，将前一片段的3’端和后一片段的5’端分别进行酶切，回收后进行连接反应，随后用前一片段的上游引物和后一片段的下游引物以连接产物为模板进行PCR，同理，将所有片段连接为一条长为1225bp的片段。
[0040]步骤4中，所述高拷贝数质粒是指可以存在于细菌体内的，其复制与细菌基因组DNA的复制不关联的，在单个细菌体内可以达到300个拷贝数以上的质粒。
[0041]本发明还提供了一种DNA Marker的制备方法，包括下列步骤:
[0042]A.构建前述用于制备DNA Marker的质粒或者直接采用构建好的用于制备DNAMarker的质粒；[0043]B.将步骤A所述质粒转入合适的宿主菌后扩增质粒；
[0044]C.分离质粒，采用EcoR I酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切质粒获得一个3000bp片段和一个1225bp片段。
[0045]D.使用琼脂糖凝胶层析柱将3000bp片段与1225bp片段分离开，收集1225bp片段。
[0046]E.分离出的片段采用Xho 1、Hind II1、BamH I酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切1225bp片段,从而得到DNA Marker各条带。
[0047]所述的宿主菌可以是大肠杆菌。
[0048]所述完全酶切法制备DNA Marker是指用一个或多个限制性内切酶对质粒DNA过量消化，使得质粒上的每一个该酶的识别位点均被切开，释放相应大小的片段。
[0049]当采用实施例例举的序列为SEQ ID N0.1的质粒制备DNA Marker时，可将其转入大肠杆菌复制，并分别采用EcoR I, Xho 1、Hind III和BamH I对质粒进行完全酶切获得DNA Marker。
【专利附图】
【附图说明】
[0050]图1是pCN1225酶切后DNA Marker组成片段大小与拷贝数的关系示意图
[0051]图2是用于制备DNA Marker的质粒DNA及其中的片段大小与拷贝数关系示意图
[0052]图3是pCN1225外加各片段之间相连的示意图
[0053]图4是实施例中所述DNA Ma`rker琼脂糖凝胶电泳效果图
【具体实施方式】
[0054]下面对本发明的实施例作详细说明:本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，旨在进一步举例说明本发明，但不用来限制本发明所要保护的范围。
[0055]下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆:实验指南中vv所述的条件，或按照制造商所建议的条件。
[0056]实施例
[0057]构建一种高效稳定重组质粒
[0058]本实施例讲述一种用于制备DNA Marker的质粒的构建,该质粒包含了 Marker I中所含有的6个条带和一条3000bp的条带,利用琼脂糖凝胶层析柱将3000bp的条带去除后，得到 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp、IOObp。
[0059]如未特别注明，本实施例中所用的生化试剂以及PCR或核酸提取与纯化试剂盒等均来自沙船(天津)生物科技发展有限公司；所有引物合成均由北京博迈德科技发展有限公司合成；所有限制性内切酶均采用宝生物工程(大连)有限公司。
[0060]如未特别注明，本实施例中所用的各DNA片段PCR反应体系为:
[0061]
【权利要求】
1.用于DNAMarker制备的质粒,所述质粒含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且同一质粒中各DNA Marker片段之间含有不同的酶切位点。
2.如权利要求1所述用于DNAMarker制备的质粒，其特征在于，所述酶切位点为II型限制性内切酶酶切位点，所述酶切位点选白Xho 1、BamH 1、Hind III或EcoR I等酶切位点。
3.如权利要求1-2任一所述用于DNAMarker制备的质粒,其特征在于,所述酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相同的所述酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
4.如权利要求3所述用于DNAMarker制备的质粒,其特征在于,各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同。
5.如权利要求1所述用于DNAMarker制备的质粒,其特征在于,所述质粒的DNA序列为 SEQ ID N0.1。
6.一种用于DNA Marker制备的质粒的制备方法,包括下列步骤: (1)根据目标DNAMarker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求:含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有不同的酶切位点； (2)制备组成DNAMarker的各个条带的DNA Marker前体片段，在每个DNA Marker片段两端加上一个或两个所述酶 切位点，后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同； (3)将DNAMarker片段依次进行连接后采用第一片段的上游引物利最后一个片段的下游引物进行PCR，从而得到所需要的大片段； (4)在质粒构建中，外源片段的两端各自带有一个骨架载体中不含有的所述酶切位占.(5)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，将体外连接好的片段与骨架载体进行连接，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)为:分别以步骤(2)获得的各DNA Marker前体片段为起点，反复利用PCR的方式获得含有各DNA Marker前体片段的片段，直至各DNA Marker前体片段连成一条大片段，然后将此片段连接入步骤(5)的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述各片段两端酶切位点选自II型限制性内切酶酶切位点。所述酶切位点选白Xho KBamH 1.Hind III或EcoR I等酶切位点。
9.如权利要求6-8任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)设计的目标质粒中，所述酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
10.如权利要求9所述用于DNAMarker制备的质粒,其特征在于,各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同
11.如权利要求1所述用于DNAMarker制备的质粒,其特征在于,所述质粒的DNA序列为 SEQ ID N0.1。
12.—种DNA Marker的制备方法,包括下列步骤: A.采用权利要求6-12任一权利要求所述制备方法构建用于制备DNAMarker的质粒；或者直接采用权利要求1-6任一权利要求所述用于DNA Marker制备的质粒； B.将步骤A所述质粒转入合适的宿主菌后扩增质粒； C.分离质粒并采用所述酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切获得DNAMarker所需片段，并将各种完全酶切产物按照一定比例进行混合，最终获得DNA Marker。
13.如权利要求12所述一种DNAMarker的制备方法，其特征在于，所述的宿主菌为大肠杆菌，步骤A所述质粒为序列为SEQ ID N0.1的质粒，步骤B所述宿主菌为大肠杆菌，步骤C所述限制性内切酶为=BamH 1、Xho I, Hind III和EcoR I。
【文档编号】C12N15/66GK103667325SQ201210316669
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2012年8月31日
【发明者】刘忱, 高洁, 张京 申请人:沙船（天津）生物科技发展有限公司