专利名称：：一种乙肝病毒双表达质粒及构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙肝病毒双表达质粒疫苗及构建方法和应用，具体是一种乙肝病毒前C-C(PreC-C)基因和前S-S(preS_S)基因双表达质粒及构建方法和应用，属于HBVDNA疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。
背景技术：
：慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦点在于如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目的。选择合适的目的基因和载体体外连接构建重组质粒，是研究治疗型HBVDNA疫苗的关键基础步骤。对所选目的基因的要求是能够诱导机体产生较强的针对HBV抗原的特异性细胞免疫反应。HBV的基因组是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒DNA聚合酶及X蛋白。目前学者们公认，S基因和C基因是HBVDNA疫苗常用的备选基因，它们都具有强免疫原性，但以往的疫苗都选用单一基因。因此，提供一种乙肝病毒双表达质粒基因疫苗就成为该
技术领域：
急需要解决的技术问题。
发明内容本发明的目的之一在于提供一种乙肝病毒双表达质粒基因疫苗，具体的说是以乙肝病毒前C-C基因、前S-S基因和自身复制调控元件增强子为目的基因构建的重组HBVDNA双表达质粒(VCS)。为实现上述目的，本发明采取以下技术方案一种乙肝病毒双表达质粒，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II，以及含调控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身复制调控元件增强子I。本发明的目的之二在于提供一种上述乙肝病毒双表达质粒的构建方法。本发明的上述目的是通过以下两种技术方案实现的一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下首先以血清中的HBVDNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子11/前C-C基因和增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VES，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VEC中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VES中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。一种优选技术方案，其特征在于所述的单引物二次PCR法为点突变的单引物二次PCR法，是改良的实现环状质粒点突变的方法，该方法的特征为将PCR分为两步，先加入正向单引物扩增，引物只能与一条反向模板链结合，生成正向的环状变异互补链，退火后，引物仍然只能与反向模板链结合，PCR扩增效率不高，但能够得到少量确切的变异链；第二轮PCR中，加入反向单引物，此引物可能与正向变异链结合，也可能与正向原模板链、正向引物结合，但由于引物序列与正向变异链完全互补，正向引物又在第一轮PCR中消耗一部分，故引物与正向变异链结合机率较高；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。一种优选技术方案，其特征在于所述的单引物二次PCR法突变VES包括首先合成1对引入插入突变的引物，并插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位点，VR-正向和VR-反向；进行第一轮PCR:以VES质粒为模板，加入正向引物VR-正向，PCR扩增；再进行第二轮PCR以第一轮PCR反应产物为模板，加入反向引物VR-反向，PCR扩增；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。一种优选技术方案，其特征在于所述的PCR扩增VEC，为含NheI酶切位点的VR2012-PF为正向引物、含AgeI酶切位点的VR2012-PR为反向引物。一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下首先以血清中的HBVDNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子11/前C-C基因和增强子I/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VEC，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VES中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VEC中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。本发明构建重组乙肝病毒前S-S基因疫苗VES后，在其完整的调控表达单元下游引入突变，插入AgeI和NheI酶切位点；同时构建重组乙肝病毒前C-C基因疫苗VEC，并高保真PCR扩增VEC的完整调控表达单元，利用AgeI和NheI插入到VES质粒中，从而构建成前C-C基因和前S-S基因的双表达质粒，可以同时分别表达两种抗原。本发明的目的之三在于提供上述乙肝病毒双表达质粒基因疫苗在预防和治疗乙型肝炎中的应用。本发明构建的含乙肝病毒前C-C基因和增强子II、前S-S基因和增强子I的重组HBVDNA疫苗(VCS)，载体选用质粒VR1012，为美国FDA已批准用于人体基因治疗的真核细胞表达载体，我国FDA近期也批准其作为HIVDNA疫苗载体用于人体，其具有多克隆位点、CMV启动子、卡那霉素抗性基因等。研究表明HBeAg与HBcAg在T细胞识别水平上有高度交叉反应性，HBeAg的胞内前体与HBcAg同源性更强，既可以通过MHCI类抗原路径被⑶8+CTL细胞识别，也可少量分泌通过MHC11类抗原路径被⑶4+T细胞识别，从而可诱导较HBcAg更强的HBV特异性细胞免疫。有益效果为了克服传统环状诱变法引物互相结合问题，将传统环状诱变法的一次PCR改良为两次，即先加入正向单引物扩增，引物只能与一条反向模板链结合，生成正向的环状变异互补链，第二轮PCR中，加入反向单引物，此引物可能与正向变异链结合，也可能与正向原模板链、正向引物结合，但由于引物序列与正向变异链完全互补，正向引物又在第一轮PCR中消耗一部分，故引物与正向变异链结合几率较高。虽然单引物二次PCR法扩增效率理论上偏低，但通过转化细菌及克隆筛选后能得到变异成功的质粒，变异成功率明显提高，为质粒点突变提供了确切高效的方法，不失为一种高效便捷的实验方法。经过上述实验，得到了增强子11/前C-C基因和增强子I/前S-S基因构建的HBV双表达质粒，为进一步研究治疗性HBVDNA的效果打下了基础。将本发明获得的乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因疫苗VCS转染入H印G2细胞，ELISA法检测细胞裂解液和细胞培养液的HBsAg和HBeAg，结果显示均有目的蛋白表达，明显高于对照组质粒。本发明的乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因双表达质粒疫苗，即重组HBVDNA疫苗，能有效地表达乙肝表面抗原和核心抗原，可用于乙型肝炎的预防和治疗。下面通过附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，但并不意味着对本发明保护范围的限制。图IHBVENHII-PreC-C基因PCR扩增相关引物位置示意图；图2HBVENHII-PreC-C基因PCR扩增片段电泳图；图3pGEM_TEasy/HBVENHIl-PreC-C片段重组质粒酶切后电泳分析图；图4质粒VEC酶切后电泳分析图；图5HBVPreS-S-ENHI基因PCR扩增相关引物位置示意图；图6重组质粒VES酶切后电泳分析图；图7重组质粒TA-C酶切后电泳分析图；图8重组质粒VCS酶切后电泳分析图；图9为本发明乙肝病毒双表达质粒基因疫苗构建方法的流程示意图。具体实施例方式菌株、细胞、试剂及实验器材厂商限制性核酸内切酶AgeI、NheI和DpnINewEnglandBiolabT4DNA连接酶NewEnglandBiolabpGEM-TEasyi式剂盒Promega公司X-gal鼎国公司IPTG鼎国公司高保真DNA聚合酶Pfu美国Stratagene公司RocheExpandLongTemplatePCRSystemRoche公司质粒小量提取试剂盒Promega公司DNA纯化试剂盒Promega公司质粒大量提取试剂盒QIAGEN公司卡那霉素鼎国生物公司感受态DH5a菌全式金生物技术有限公司其余常用生化试剂(国产分析纯)上海华美生物公司等HepG2细胞病毒研究室保存DMEM北京天润善达公司高效真核转染试剂VigoFect威格拉斯生物技术有限公司真核细胞蛋白裂解液博大泰克公司HBsAg和HBeAg检测试剂盒北京科卫试剂厂6孔细胞培养板BectonDickinsonLabwareIOml细胞培养瓶北京其余常用生化试剂为国产分析纯上海华美公司等主要仪器MJMiniPCR扩增仪美国Bio-Rad公司LG15-W高速微量离心机北京低温高速离心机日本HITACHI公司DYY-III型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂THZ-C电热恒温摇床江苏太仓仪器厂SmartSpecPlus分光光度计美国Bio-Rad公司C02恒温孵箱德国Heraeus公司BHC-1360IIA2型超净工作台北京哈东联仪器公司MS型酶标检测仪芬兰Labsystems公司实施例1乙肝病毒前C-C基因疫苗的构建1.套式PCR扩增ENHII-PreC-C基因选择病毒性肝炎患者的血液，乙型慢性(中度)，HBVDNA、HBeAg阳性。提取血清HBVDNA后测序，分型为adr亚型。慢性乙型肝炎患者肝素抗凝血3ml，2000rpm离心3min，分离血清。使用QIAGEN试剂盒，提取HBVDNA步骤如下①血清200μ1与蛋白酶20μ1混勻，②加BufferAL200μ1，混勻，③加无水酒精200μ1，混勻，56°C孵育lOmin，④IOOOOrpm离心lmin，过柱，弃离心液，⑤加BufferAff1500μ1，IOOOOrpm离心Imin冲洗，弃离心液，⑥加BufferAW25001，14000rpm离心5min冲洗，弃离心液，⑦14000rpm再次离心lmin，弃离心液，⑧加无菌去离子水200μ1，12000rpm离心，洗脱HBVDNA。所得HBVDNA测序，确定为adr亚型；如图1所示，以此为模板，以c5out(正向外引物，5‘-TTACGCGGTCTCCCCGTCTG)和c3out(反向外引物，3‘-AAAGTTTCCCACCTTATGAG)为引物进行PCR扩增模板Ιμ、弓丨物(25μΜ)各1μl、5mMdNTP2μ1U0XPCRBuffer5μ1、Taq酶1μ1、H2O39μ1，94°C变性3min—94°C变性lmin,52°C退火lmin，72°C延伸lmin，共35个循环一72°C延伸lOmin。以5μ1扩增产物为模板，再以c5in(正向内引物，5‘-AAACTGCAGACCTCTGCACGTCGCATG)和c3in(反向内引物，3'-CGCGGATCCTCCAAGGGATACTAACAT)为引物，采用前述PCR方法扩增，扩增产物即HBVENHII-PreC-C基因。经提取CHB患者血清HBVDNA及套式PCR扩增，获得PCR产物HBVENHII-PreC-C片段，经琼脂糖凝胶电泳鉴定其大小为800900bp，符合预期长度，如图2所示，左侧为DNAMarker，右侧为HBVENHII-PreC-C片段。2.重组质粒VEC的构建(1)构建pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒PCR产物3μl，pGEM_TEasy载体1μ1，2XBuffer5μ1,T4DNA连接酶1μ1，混勻后室温(20°C-25°C，下述室温均为此温度)放置lh，4°C过夜。(2)pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒转化感受态DH5α菌-60°C保存，取出后置冰浴中备用。上述连接产物共10μ1加入100μ1感受态细菌中(同时设阳性及阴性对照)轻轻混勻，冰浴20min，室温lOmin，加LB400μ1，37°C250rpm摇床30min，取100μ1转化菌涂于含氨苄青霉素(25μg/ml)、X-gal和IPTG的固体LB培养板，待表面液体晾干后，将培养板倒置于37°C孵箱中培养过夜(12-18h)。(3)pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒克隆筛选及扩增提取挑取培养板中白色阳性菌落，置于3ml含氨苄青霉素(25μg/ml)的LB中，37°C250rpm摇床过夜(12_18h)。取1.5ml菌液提取质粒，使用Promega质粒提取试剂盒，按说明书操作，步骤如下①8000rpm离心3min，弃上清。②力口ResuspensionSolution250μ1，吹打混勻重悬菌体。③加CellLysisSolution250μ1，颠倒混勻后静置3min，加AlkalineProtezseSolution10μ1，颠倒混勻后静置5min。④力口NeutrilizationSolution350μ1,颠倒混勾。⑤14000rpm离心lOmin，取上清过柱。⑥14000rpm离心柱lmin，弃离心液。⑦力口WashSolution750μ1,14000rpm离心lmin,弃离心液，再力口WashSolution250yl，14000rpm离心lmin，弃离心液后再离2min。⑧离心柱加100μ1无菌去离子水洗脱质粒，室温3min，14000rpm离心lmin。(4)pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒酶切、回收目的片段用T7、SP6引物测序pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒，确认连接片段为所需目的基因后，PstI、BamHI双酶切PstI2μ1+BamHI2μ1+BSA1μ1+质粒30μ1+10XBuffer10μ1+Η2055μ1，37°C水浴2h。如图3所示，pGEM-TEasy/PCR产物重组质粒经PstI、BamHI双酶切后琼脂糖凝胶电泳分析，左侧为DNAMarker,右侧为TEasy/PCR产物重组质粒酶切，上方条带为载体pGEM-TEasy，下方条带为HBVENHII-PreC-C片段，琼脂糖凝胶电泳分析确认酶切片段长度约800900bp，与预期相符，使用PromegaDNA纯化试剂盒纯化回收，步骤如下①酶切产物100μ1加入琼脂糖凝胶加样孔中。②电压80V，电泳15min。③紫外线灯下切胶，取酶切片段，称重。④加等量(ml/mg)MembraneBindingSolution,60°C7jC浴lOmin。⑤过柱，14000rpm离心lmin，弃离心液。⑥离心柱力口700μIMembraneWashSolution,14000rpm离心lmin,弃离心液。⑦离心柱力口500μIMembraneWashSolution,14000rpm离心3min,弃离心液。⑧离心柱加无菌去离子水50μ1，室温3min，14000rpm离心lmin，洗脱目的片段DNA。(5)构建重组质粒VECPstI.BamHI双酶切载体VR1012并纯化(方法同前)，然后与步骤(4)中双酶切后的目的片段连接T4DNA连接酶1μ1，10XBuffer1μ1，酶切片段+酶切载体共8μ1(根据电泳结果评估载体与酶切片段浓度，按片段载体31比例加样)。10μ1连接产物16°C过夜后按前述方法转染感受态DH5α菌，涂于含卡那霉素的半固体LB培养板上，12-18h后挑取阳性菌落扩增，按前述方法提取质粒VEC、PstI和BamHI酶切鉴定。如图4所示，载体VR1012插入基因片段为HBVENHII-PreC-C，经限制性内切酶PstI、BamHI双切后，琼脂糖凝胶电泳分析确认酶切片段大小约860bp，证实连接片段为所需目的基因，左侧为DNAMarker；右侧为重组质粒VEC酶切，上方条带为载体VR1012，下方条带为HBVENHII-PreC-C片段。电泳分析确认酶切大小正确后测序，测序显示插入片段HBVENHII-PreC-C的核酸及氨基酸序列结果与模板序列完全一致，其序列如SEQIDNO:1、2。实施例2乙肝病毒前S-S基因疫苗的构建1.套式PCR扩增PreS-S-ENHI基因以HBV质粒G683-1为模板，以S2-5(正向，5‘-AAACTGCAGCATCCTCAGGCCATG,)禾口S3E(反向，5‘-GGATCCCTAGGAGTTCCGCAGTATGG)为引物，采用实施例1中第1部分中的PCR方法扩增，如图5，模板1μ1、引物(25μΜ)各1μ1.5mMdNTP2y1U0XPCRBuffer5μ1、Taq酶1μ1、H2O39μ1，94°C变性3min—94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸lmin,共35个循环一72°C延伸lOmin。扩增产物即HBVPreS-S-ENHI基因。经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小约1.3kb，符合预期长度。2.重组质粒VES的构建方法同实施例1中第2部分，将PCR产物与pGEM-TEasy载体连接、转化感受态细菌、挑取白色单克隆菌落，扩增培养后提取质粒、PstI和BamHI酶切后纯化酶切片段，将其与同样酶切纯化的VR1012载体连接、转化感受态菌，挑取单克隆菌落、筛选出含插入片段的重组质粒VES；如图6所示，经限制性核酸内切酶PstI、BamHI双切后，琼脂糖凝胶电泳分析确认酶切片段大小约1.3kb，与预期相符，证实连接片段为所需目的基因，左侧为DNAMarker,右侧为重组质粒VES酶切产物，上方条带为载体VR1012，下方条带为PreS-S-ENHI片段。电泳分析确认酶切片段大小正确后测序，其核酸及氨基酸序列结果与预计序列完全一致。插入片段HBVPreS-S-ENHI的核苷酸和氨基酸序列如SEQIDNO:3和4。实施例3重组质粒VES的插入突变单引物二次PCR法扩增实现VES质粒的插入突变1.合成1对引入插入突变的引物，插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位点VR-正向5，-GGTGCTGAAGAATTGCTAGCTTAATTAAGGCCGGCCACCGGTTCCTCCTGGG，序列如SEQIDNO5；VR-反向5，-TGGCCGGCCTTAATTAAGCTAG，序列如SEQIDNO6(斜体加粗为插入序列)2.第一轮PCR以VES质粒为模板，加入正向引物VR-正向，PCR扩增，反应体积和条件如下模板(VES0.lyg/μ1)2μ1、引物VR-正向(25μΜ)2μ1、dNTP(5mM)2μ1、10XPCRBuffer2.5μ1、Pfu酶1μ1、Η2016·5μ1，反应条件94°C变性Imin—94°C变性lmin，52°C退火lmin，72°C延伸12min，20个循环后72°C延伸lOmin。3.第二轮PCR以步骤2中PCR反应产物为模板，加入反向引物VR-反向，PCR法扩增，反应体积和条件如下模板2μ1、引物VR-反向(25μΜ)2μ1、dNTP(5mM)2μ1、10XPCRBuffer2.5μ1、Pfu酶1μ1、Η2016·5μ1，反应条件与第一轮PCR相同。4.PCR产物选择性酶切第二轮PCR产物25μ1加入DpnI酶1μ1，10XBuffer2.5μ1，37°C水浴2h。5.突变质粒的转化-70°C冻存的感受态DH5α菌100μ1置冰浴融化，将步骤3中PCR产物10μ1加入到感受态细菌中，轻轻混勻，冰浴25min，42°C40秒后置冰上3min，加LB300μ1，37°C摇床200rpm复苏40min，取转化菌液涂于含卡那霉素(50μg/ml)的固体LB培养板，待表面液体晾干后倒置于37°C孵箱中过夜。6.变异质粒的扩增和提取挑取培养板中的阳性单菌落，置于5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB中，370C200rpm摇床过夜(12_18h)。取1.5ml菌液提取质粒，使用Promega质粒提取试剂盒，按说明书操作，方法同前。取所提质粒与模板质粒电泳鉴定，条带位置一致，测序证实在VES质粒中成功插入酶切位点，得到突变质粒VES-2。实施例4乙肝病毒前C-C基因疫苗VEC表达调控单元的扩增与克隆1.VEC表达调控单元的扩增RocheExpandLongTemplatePCRSystem扩增VEC表达调控单元，引物为VR2012-PF(正向，5，-AGTCGAGCTAGCGCCATGTTGACATTG,含NheI酶切位点，序列如SEQIDNO7)和VR2012-PR(反向，5，_TTAACCACCGGTAATTCTTCAGCACCTGG，含AgeI酶切位点，序列如SEQIDNO8)，PCR参数为94°C预变性2分钟，94°C变性10秒、45°C复性30秒、68°C延伸3分钟，10个循环后改为94°C变性15秒、45°C复性30秒、68°C延伸3分20秒，以后每隔2个循环延伸时间增加20秒，共28个循环，最后延伸7分；琼脂糖凝胶电泳显示扩增出预期大小片段。2.VEC表达调控单元扩增产物的克隆及鉴定将3μ1PCR产物与ΙμpGEM-TEasyVector连接，室温1小时后4°C过夜，连接产物转化感受态菌DH5α，挑取单克隆菌扩增后提取质粒TA-C，NheI和AgeI酶切后琼脂糖凝胶电泳分析；如图7所示，右侧为DNAMarker,左侧为重组质粒TA-C酶切，上方条带为载体pGEM-TEasy，下方条带为VEC表达调控单元片段，酶切片段大小约2.7kb，与预期相符，测序证实为目的基因。详细方法同实施例1中第2部分。实施例5乙肝病毒双表达质粒VCS的构建l.NheI和AgeI酶切VEC表达调控单元克隆质粒TA_C，纯化回收约2.7kb的插入片段，详细方法同实施例1中第2部分。2.构建双表达质粒VCSNheI和AgeI酶切突变后质粒VES-2并纯化，然后与步骤1中双酶切纯化后的目的片段连接、转化感受态DH5α菌，挑取单克隆菌落，扩增后提取质粒VCS，详细方法同实施例1中第2部分。NheI和AgeI酶切质粒VCS后琼脂糖凝胶电泳分析，如图8所示，右侧为DNAMarker；左侧为重组质粒VCS酶切产物，上方条带为载体VES-2，下方条带为VEC表达调控单元片段。电泳分析显示载体约5.8kb，插入片段约2.7kb，与预计大小一致，测序证实序列正确。3.大量提取质粒使用QIAGEN公司大量提取质粒试剂盒提取双表达质粒VCS和对照空质粒VR1012，按说明书操作，步骤简述如下(1)挑取阳性菌落，放入含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液5ml中，37°C、250rpm摇振8h。(2)将上述菌液0.5ml转入含卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液500ml中，37°C摇床250rpm摇振16h。(3)取出500ml菌液，5000rpm4°C离心15min，弃上清。(4)加BufferP150ml重悬菌液，吹打混勻后加入BufferP250ml，颠倒数下混勻，室温放置5min，再加BufferP350ml，颠倒数下混勻，冰浴30min。(5)16000rpm4°C离心30min，上清移入新离心管，再16000rpm4°C离心20min，将上清过柱(BufferQBT35ml预处理)。(6)BufferQC200ml洗柱。(7)BufferQF35ml过柱，洗脱DNA。(8)加入异丙醇24.5ml，混勻，14000rpm4°C离心30min，弃上清。(9)力卩70%乙醇7ml，混悬后14000rpm4°C离心15min，弃上清。(10)加500μ1生理盐水溶解DNA，精密分光光度仪测浓度及260/280nm比值。实施例6HBV双表达载体VCS的真核细胞转染及表达产物检测1.真核细胞转染接种适量H印G2细胞于2块六孔培养板，双表达质粒VCS和对照空质粒VRlO12(阴性对照)各转染5孔，另2孔作空白对照；每组检测数值的均值作为该组的检测数据。按转染试剂VigoFect说明书操作，转染过程简述如下1)转染前24小时，接种适量细胞，至转染时细胞密度为40%-60%。2)转染前1小时，更换新鲜的完全培养液2ml，置37°C，5%CO2培养。3)取5μgDNA，加入生理盐水中至总体积为100μ1，轻轻混勻，室温放置。4)取VigoFect2μ1，加入生理盐水中至总体积为100μ1，轻轻混勻，室温放置5分钟。5)将稀释的VigoFect逐滴加入稀释的DNA溶液中，轻轻混勻，所得的转染工作液在室温放置15分钟。6)将转染工作液轻轻混勻，逐滴加入2ml培养液中，轻混勻培养液，置37°C，5%CO2培养。2.真核表达产物收集1)转染48小时后，收集每孔的培养液，-20°C冻存，用于检测。2)转染48小时后，每孔用1毫升PBS洗细胞1次，然后加1毫升PBS，用细胞刮刀刮下细胞，吸入管中，5000rpm离心3分钟，取沉淀，放冰上；每管加300微升真核细胞蛋白裂解液，用10微升枪头吹打数次，以后每隔10分钟吹打1回，共吹打6回后_20°C冻存，用于检测。3.表达产物检测利用ELISA试剂盒分别检测细胞培养液和细胞裂解液，共10个样本，按试剂盒步骤操作，简述如下1)检测外膜蛋白的表达双抗体夹心法检测HBsAg，S/N=双表达质粒A值组内均值/空质粒对照A值组内均值a.取HBsAb包被板。b.细胞裂解液或培养液50μ1，阴性对照、阳性对照、空白孔各50μ1，每1样本加2孔。c.加酶抗体复合物50μ1，混勻，37°C孵箱放置30min。d.洗板机洗涤，洗液350μ1/孔，洗5次。e.加显色剂Α50μ1，显色剂Β50μ1，混勻，37°C孵箱放置lOmin。f.加终止液50μ1。g.450nm波长分光光度计测A值，2孔均值为该标本检测值。双表达质粒VCS转染后的细胞裂解液及培养液均检测到HBsAg，浓度高于VR1012载体对照组，以细胞培养液的更明显，t检验显示有显著性差异，酶标仪测得反应表达强度的光密度如表1所示。表1、HBsAg的ELISA检测结果分组细胞裂解液*_细胞培养液*__A值(χ士s)S/N_A值(x±s)S/N_VR10120.127±0.0520.010±0.003VCS_0.407±0.1153.2_0.715±0.26968.7_*P<0.Ol2)检测核心蛋白的表达双抗体夹心法检测HBeAg，S/N=双表达质粒A值组内均值/空质粒对照A值组内均值a.取HBeAb包被板。b.细胞裂解液或培养液50μ1，阴性对照、阳性对照、空白对照各50μ1，每1样本加2孔。c.加酶抗体复合物50μ1，混勻，37°C孵箱放置30min。d.洗板机洗涤，洗液350μ1/孔，洗5次。e.加显色剂Α50μ1，显色剂Β50μ1，混勻，37°C孵箱放置lOmin。f.加终止液50μ1。g.450nm波长分光光度计测A值，2孔均值为该标本检测值。双表达质粒VCS转染后的细胞裂解液及培养液均检测到HBeAg，浓度高于VR1012载体对照组，以细胞培养液的更明显，t检验显示有显著性差异，酶标仪测得反应表达强度的光密度如表2所示。表2、HBeAg的ELISA检测结果-<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*P<0.01本实施例将构建好的双表达质粒VCS转染真核细胞，体外培养48h后采用ELISA法检测细胞裂解液和培养液，结果显示成功表达两种目的蛋白，以细胞培养液中浓度较高。通过本实施例，验证了双表达质粒VCS在真核细胞中能够成功地同时表达2种预期蛋白，为HBVDNA疫苗的研究打下了基础。本实施例动物实验结果显示双表达质粒VCS以肌注方式免疫Balb/c小鼠后，血清中均能够产生抗HBc和抗HBe抗体。细胞免疫分析表明，VCS可使小鼠脾淋巴细胞中Y干扰素产生细胞数增多。上述结果表明双表达质粒VCS在诱导小鼠特异性细胞和体液免疫方面确实存在优势。上述实验结果表明乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因双表达质粒VCS在诱导小鼠特异性细胞和体液免疫方面均有优势，可用于乙型肝炎的免疫治疗。序列表<110>中国人民解放军第三〇二医院<120>一种乙肝病毒双表达质粒及构建方法和应用<130><160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>864<212>DNA<213>VEC插入片段HBVENHIl-PreC-C的核苷酸序列<400>1ctgcagacctctgcacgtcgcatggaaaccaccgtgaacgcccaccaggtcttgcccaag60gtcttacataagaggactcttggactcgcagcaatgtcaacgaccgaccttgaggcatac120ttcaaaagactgtttatttaaggactgggaggagttgggggaggagattaggttaaaggt180ctttgtactaggaggctgtaggcataaattggtctgttcaccagcaccatgcaacttttt240cacctctgcctaatcatctcatgttcatgtcctactgttcaagcctccaagctgtgcctt300gggtggctttggggcatggacattgacccgtataaagaatttggagcttctgtggagtta360ctctcttttttgccttctgacttctttccttctattcgcgatctcctcgacaccgcctca420gctctgtatcgggaggccttagagtctccggaacattgttcacctcaccatacagcactc480aggcaagctatcctgtgttggggtgagttgatgaatctggccacctgggtgggaagtaat540ttggaagacccagcatccagggaattagtagtcagctatgtcaatgttaatatgggccta600aaaatcagacaactattgtggtttcacatttcctgtcttacttttggaagagaaactgtt660cttgagtatttggtgtcttttggagtgtggattcgcactcctcctgcttacagaccacca720aatgcccctatcttatcaacacttccggaaactactgttgttagacgacgaggcaggtcc780cctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaaggtctcaatcgccgcgtcgcagaaga840tctcaatctcgggaatctcaatgt864<210>2<211>212<212>PRT<213>VEC插入片段HBVENHIl-PreC-C的氨基酸序列<400>2MetGlnLeuPheHisLeuCysLeulielieSerCysSerCysProThr151015ValGlnAlaSerLysLeuCysLeuGlyTrpLeuTrpGlyMetAsplie202530AspProTyrLysGluPheGlyAlaSerValGluLeuLeuSerPheLeu354045ProSerAspPhePheProSerlieArgAspLeuLeuAspThrAlaSer505560AlaLeuTyrArgGluAlaLeuGluSerProGluHisCysSerProHis65707580HisThrAlaLeuArgGlnAlalieLeuCysTrpGlyGluLeuMetAsn859095LeuAlaThrTrpValGlySerAsnLeuGluAspProAlaSerArgGlu100105110LeuValValSerTyrValAsnValAsnMetGlyLeuLyslieArgGln115120125LeuLeuTrpPheHisiIeSerCysLeuThrPheGlyArgGluThrVal130135140LeuGluTyrLeuValSerPheGlyValTrplieArgThrProProAla145150155160TyrArgProProAsnAlaProlieLeuSerThrLeuProGluThrThr165170175ValValArgArgArgGlyArgSerProArgArgArgThrProSerPro180185190ArgArgArgArgSerGlnSerProArgArgArgArgSerGlnSerArg195200205GluSerGlnCys210<210>3<211>1317LysGinTyrLeuAsnLeuTyrProValAlaArg385390395CysGinValPheAlaAspAlaThrProThrGly405410GlyHisArgArgLeuArgGlyThrPheValAla420425ThrAlaGluLeuLeuGlylie435<210>5<211>52<212>DNA<213>VR-正向5’引物的核苷酸序列<400>5ggtgctgaagaattgctagcttaattaaggccggccaccg<210>6<211>22<212>DNA<213>VR-反向5’引物的核苷酸序列<400>6tggccggccttaattaagctag<210>7<211>27<212>DNA<213>VR2012-PF正向引物的核苷酸序列<400>7agtcgagctagcgccatgttgacattg<210>8<211>29<212>DNA<213>VR2012反向引物的核苷酸序列<400>8ttaaccaccggtaattcttcagcacctggArgSerGlyLeu400GlyLeuAlalie415LeuProlieHis4302227291权利要求一种乙肝病毒双表达质粒，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II以及含调控序列的乙肝病毒前S-S基因和自身复制调控元件增强子I。2.—种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下首先以血清中的HBVDNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因或增强子1/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VES，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VEC中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VES中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。3.根据权利要求2所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于所述的单引物二次PCR法为点突变，第一轮PCR，加入正向单引物扩增，得到少量变异链；第二轮PCR，加入反向单引物，反向单引物序列与正向变异链互补。4.根据权利要求2或3所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于所述的单引物二次PCR法突变VES，首先合成1对引入插入突变的引物，插入NheI、PacI、FseI和AgeI酶切位点，VR-正向和VR-反向；进行第一轮PCR:以VES质粒为模板，加入正向引物VR-正向，PCR扩增；再进行第二轮PCR:以第一轮PCR反应产物为模板，加入反向引物VR-反向，PCR扩增；然后对PCR产物进行选择性酶切，转化细菌后克隆筛选得到突变VES基因。5.根据权利要求2所述的乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其特征在于所述的PCR扩增VEC，以含NheI酶切位点的VR2012-PF为正向引物、含AgeI酶切位点的VR2012-PR为反向引物。6.一种乙肝病毒双表达质粒的构建方法，其步骤如下首先以血清中的HBVDNA为模板，用套式PCR分别扩增出乙肝病毒增强子II/前C-C基因和增强子1/前S-S基因，然后通过基因克隆连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到单表达质粒VEC和VES；采用单引物二次PCR法突变VEC，在调控表达单元下游插入酶切位点，PCR扩增VES中完整的调控和表达单元并克隆到突变后的VEC中，克隆筛选得到利用各自的启动子分别表达前C-C和前S-S的双表达质粒。7.根据权利要求1-6中任一项所述的乙肝病毒双表达质粒在预防和治疗乙型肝炎基因疫苗中的应用。全文摘要本发明涉及一种乙肝病毒双表达质粒及其构建方法，首先分别以乙肝病毒前C-C基因/自身复制调控元件增强子II、乙肝病毒前S-S基因/自身复制调控元件增强子I为目的基因，使用真核表达载体VR012，构建乙肝ENHII/前C-C基因疫苗重组质粒VEC和ENHI/前S-S基因疫苗重组质粒VES；然后采用单引物二次PCR法，突变VES重组质粒，在表达调控单元下游插入酶切位点；最后利用插入的酶切位点，PCR扩增VEC重组质粒的调控和表达单元，酶切重组到突变后的VES质粒中，得到2个启动子分别调控表达乙肝病毒前C-C基因和前S-S基因的双表达质粒做为DNA疫苗。该重组HBVDNA疫苗能有效地表达乙肝表面抗原和核心抗原，可用于乙型肝炎的预防和治疗。文档编号A61K39/29GK101824430SQ20091007930公开日2010年9月8日申请日期2009年3月5日优先权日2009年3月5日发明者侯俊,张敏,栾翔玲,沈宏辉,王志杰,王福生,白冰珂,胡燕,貌盼勇,赫兢,辛绍杰申请人:中国人民解放军第三〇二医院