专利名称：Krüppel样转录因子4的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及Kr ii ppel样转录因子4(KLF4)的新用途。
背景技术：
经皮冠状动脉成形术(PTCA)是冠心病治疗的一个重要手段，但术后血管再狭窄一直是影响PTCA疗效的主要问题，PTCA术后的早期血管弹性回縮及晚期血管内膜过度增殖两大弊端使再狭窄发生率在术后的六个月内可达30%到50%。血管内药物洗脱支架(DES)的出现解决了因血管弹性回縮而导致急性闭塞的难题，同时通过抑制细胞增殖抑制血管内膜过度增殖，显著得降低了术后再狭窄的发生率，但是支架的长期使用会导致血管内血栓形成从而引起心梗和心源性死亡。开发更为特异的抑制新生内膜形成的药物是防治血管再狭窄的一个十分必要的问题。
血管平滑肌细胞的迁移和增殖是造成血管成型术后再狭窄的主要原因，而抑制血管平滑肌细胞增殖是治疗血管再狭窄的中心环节。在局部机械或化学损伤的刺激下，血管释放的多种细胞因子通过上调c-fos， c-myc， c-myb， b-myb, ras等即刻早期基因，这些转录因子通过上调包括细胞周期蛋白cyclin在内的细胞周期基因表达促进血管平滑肌细胞的增殖。同时另一类转录因子如p53， GAX， GATA-6， E2A，Id等在新生内膜中也有表达，可以上调包括细胞周期蛋白依赖激酶抑制物(CKI)，如p21一，p27一等在内的细胞周期负调节因子拮抗血管平滑肌细胞增殖。研究发现在大鼠颈动脉球囊损伤模型中通过基因治疗过表达p53， p21, GAX， GATA-6，均可显著的抑制球囊损伤引起的新生内膜形成。这些初步的实验结果令人振奋，而寻找新的参与新生内膜形成过程中调控细胞周期的转录因子进行基因治疗也成为治疗再狭窄的一个新靶点。
KLF4是kriippel样转录因子家族的一个成员，参与多种细胞活动的调控。
发明内容
本发明的一个目的是提供krtlppel样转录因子4蛋白的编码基因的新用途。本发明所提供的一种新用途为kriippel样转录因子4蛋白的编码基因在制备用于治疗血管内膜增生的药物中的应用。
本发明所提供的另一种新用途为含有kriippel样转录因子4蛋白的编码基因的重组载体在制备用于治疗血管内膜增生的药物中的应用。
本发明所提供的另一种新用途为含有krtippel样转录因子4蛋白的编码基因的重组腺病毒在制备用于治疗血管内膜增生的药物中的应用。
本发明的另一个目的是提供一种以krilppel样转录因子4蛋白或其编码基因为靶点的用于治疗血管内膜增生的药物。
本发明所提供的以kriippel样转录因子4蛋白或其编码基因为靶点的用于治疗血管内膜增生的药物，其活性成分为可是使krtlppel样转录因子4过表达的microRNA或siRNA、含有krli卯el样转录因子4蛋白的编码基因的重组载体、或含有kru卯el样转录因子4蛋白的编码基因的重组腺病毒。
上述应用及药物中，所述krtlppel样转录因子4蛋白可来自于人或鼠等，具体可以是如下a)或b)所示的蛋白
a) 氨基酸序列如GenBank Accession Number NP—034767所示的蛋白；
b) 将GenBank Accession Number NP—034767的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有krtl卯el样转录因子4功能的由(a)衍生的蛋白质。
上述应用及药物中，所述编码基因具体可如l)或2)所示
1) 核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA;
2) 与1)限定的DNA具有90%以上同源性且编码所述krii卯el样转录因子4的
DNA。
实验证明，本发明的应用方法或药物可以有效地使krtippel样转录因子4过表达，抑制血管平滑肌细胞的增殖，进而抑制血管新生内膜的增生，抑制效果非常明显，因此，本发明方法及药物在治疗血管内膜增生领域具有重要应用价值。
图1为AdKLF4在平滑肌细胞中的蛋白表达。
图2为细胞计数实验结果。
图3为流式细胞分析图谱。
图4为流式细胞分析统计结果。
图5为brdU掺入实验荧光图。
图6为brdU掺入实验统计结果。
图7为大鼠颈动脉球囊损伤后KLF4mRNA水平变化。在血管的蛋白表达。图9为大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜的增生。图10为大鼠颈动脉球囊损伤后血管增生的新生内膜与中膜的面积比。图11为大鼠颈动脉球囊损伤后血管增生的新生内膜面积。
具体实施例方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、重组腺病毒的构建1、重组腺病毒AdKLF4的构建方法
质粒pMT-KLF4(Janiel M. Shields ， Robert J. Christy and Vincent W.Identification and Characterization of a Gene Encoding a Gut-enrichedKrtippel-like Factor Expressed during Growth Arrest. J Biol Chem. 1996 Aug16 ;271 (33) :20009-17)(北京大学);
含有四环素反应增强子及CMV启动子的穿梭质粒pAdlox (Na叩ing Wang, LyrmeVerna, Stephen Hardy, John Forsayeth, Yi Zhu and Michael B. Stemerman.Adenovirus—Mediated Overexpression of c—J"un and c—Fos Induces IntercellularAdhesion Molecule-1 and Monocyte Chemoattractant Protein—1 in HumanEndothelial Cells. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 1999;19;2078—2084)(北京大学) ，
删除El， E3区域含有loxp位点的腺病毒5基因组DNA (Sauer， B. 1987.Functional expression of the ere-lox site-specific recombination system inthe yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 7:2087 - 2096.) (北京大学)；
cre8细胞(Sauer， B. 1987. Functional expression of the cre-loxsite-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae.Mol. Cell. Biol. 7:2087 - 2096)(北京大学)；
(1) KLF4基因的获得
以质粒pMT-KLF4为模板，用限制性内切酶EcoRI、 BamHI进行酶切，回收得到小鼠KLF4编码片段，基因序列如序列表中序列l所示，其编码的KLF4蛋白的氨基酸序歹U如GenBank Accession Number NPJ)34767所示。
6(2) 含有KLF4基因的重组穿梭质粒的获得
将步骤l)获得的KLF4编码片段亚克隆至含有四环素反应增强子及CMV启动子的穿梭质粒pAdlox的EcoRI和BamHI酶切位点，得到含有KLF4基因的重组穿梭质粒；
(3) 重组腺病毒AdKLF4的获得用磷酸钙转染的方法将重组穿梭质粒与删除El， E3区域含有loxp位点的腺病
毒5基因组DNA共同转染至cre8细胞进行重组，得到重组腺病毒AdKLF4，该重组腺病毒中KLF4的表达受四环素反应转录激活物(tTA)的调控，加入四环素时其表达关闭。
2、 AdLacZ的构建方法
(1) LacZ基因的获得如文献(Neering SJ， Hardy SF， Mi躍oto D， SprattSK, Jordan CT. Transduction of primitive human hematopoietic cells withrecombinant adenovirus vectors. Blood. 1996;88:1147 - 1155.)中所述。
(2) 含有LacZ基因的重组穿梭质粒的获得将LacZ基因亚克隆至含有四环素反应增强子及CMV启动子的穿梭质粒pAdlox，得到含有LacZ基因的重组穿梭质粒；
(3) 重组腺病毒AdLacZ的获得用磷酸钙转染的方法将重组穿梭质粒与删除El， E3区域含有loxp位点的腺病毒5基因组共同转染至cre8细胞进行重组，得到重组腺病毒AdLacZ。
3、 AdtTA的构建方法
载体pUHDIO-1 (Deuschle， U., Pepperkok， R" Wang, F. , Giordano, T.J.'McAllister, W. T. ， Ansorge， W. & Bujard， H. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 86， 5400-5404.)(北京大学)；
pMSVP16 (Triezenberg， S. J., Kingsbury, R. C. & McKnight， S. L(1988)Genes Dev. 2, 718-729.)(北京大学);
质粒pWH510 (Altschmied， L. ， Baumeister， R. ' Pfleiderer， K. & Hillen,W. (1988) EMB0 J. 7, 4011-4017.)(北京大学);(1) TTA基因的获得
如文献(GossenM, Bujard H. Tight control of gene expression in mammaliancells by tetracycline—responsive promoters. Proc Natl Acad SciUSA. 1992:89:5547 - 5551.)中所述。
将四环素抑制子编码基因插入载体pUHD10-l的多克隆位点，得到重组载体 pUHD14-l;将带状疱疹病毒(HSV)的VP16碳末端编码基因平端连接插入载体 pUHD14-l的AflII位点，得到含有带状疱疹病毒(HSV)的VP16碳末端编码基因的重 组载体pUHD15-l;
其中，带状疱疹病毒(HSV)的VP16碳末端编码基因的获得利用限制性内切 酶MluI及Fokl酶切pMSVP16，得到VP16碳末端130个氨基酸的编码基因；利用Klenow DNA聚合酶将其末端补平。
四环素抑制子编码基因的获得如文献(GossenM， Bujard H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline—responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 ;89:5547 - 5551.)中所述。
(2)重组腺病毒AdtTA的获得用磷酸钙转染的方法将重组质粒pUHD15-l与 删除El， E3区域含有loxp位点的腺病毒5共同转染至cre8细胞进行重组，得到重 组腺病毒AdtTA。
实施例2、 KLF4对血管平滑肌细胞增殖的抑制
一、 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的分离及原代培养
1、分离方法以离体的SD雄性大鼠胸主动脉为原料，采用组织贴片法分离得 到大鼠主动脉平滑肌细胞。
验证a型肌动蛋白为血管平滑肌细胞的标记物，用特异针对a型肌动蛋白的抗 体(购自Santa Cruz Biotechnology, Inc,货号为sc-130617)对上述分离得到的 细胞进行免疫染色鉴定，结果阳性细胞在99%以上，证明所分离的细胞为血管平滑 肌细胞。
原代培养用含10% (体积百分含量)胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/mL 链霉素的DMEM培养基，在37'C、 5%0)2培养箱中培养。
二、 构建转入KLF4编码基因的重组平滑肌细胞
将AdKLF4腺病毒上清及AdtTA腺病毒上清加入培养生长至融合的血管平滑肌 细胞中，对照组加AdKLF4腺病毒上清、AdtTA腺病毒上清及终浓度为0. lpg/raL的 四环素，感染滴度为20 M0I，2小时后换至新鲜培养液，24小时后提取总蛋白进行 western blot，用特性针对KLF4的抗体(Santa Cruz, sc-12538)检测其过表达， 有KLF4蛋白表达的细胞即为成功高表达KLF4蛋白的平滑肌细胞。
8三、转基因平滑肌细胞的增殖
1、 KLF4蛋白在细胞中的表达情况
实验组将转入KLF4蛋白编码基因的血管平滑肌细胞接种于细胞培养基中， 在37"C、 5。/。C02条件下培养24小时；然后提取细胞总蛋白，利用抗KLF4的特异抗 体(Santa Cruz， sc-12538)进行Western Blot检测KLF4蛋白水平，以a -Tubulin 作为内参。
对照组h将转入KLF4蛋白编码基因的血管平滑肌细胞接种于细胞培养基中， 再向其中添加四环素(四环素在培养体系中的终浓度为0. lpg/mL)，其余实验条件 均与实验组相同。
细胞培养基含10% (体积百分含量)胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/iiiL
链霉素的DMEM培养基。
结果如图1所示(图1中，泳道1为对照组的结果，泳道2为实验组的结果)。 结果表明在转入重组腺病毒AdKLF4的平滑肌细胞中KLF4基因的过表达受四环
素调控。
2、 转入KLF4编码基因的重组平滑肌细胞的增殖
实验组将转入KLF4编码基因的重组平滑肌细胞接种入含0.5。/。(体积百分含 量)胎牛血清的DMEM培养基中，在37。C、 5%0)2条件下饥饿培养24小时；再用10% 胎牛血清刺激细胞增殖，在血清刺激的24、 48、 72小时对细胞进行计数；取血清 刺激18小时的部分细胞进行流式细胞术分析和BrdU掺入实验，以检测细胞的增 殖情况。
对照组将转入KLF4编码基因的重组平滑肌细胞接入含0. 5% (体积百分含量) 胎牛血清的DMEM培养基中，再向其中添加终浓度为O. lpg/ml的四环素，在37。C、 5%0)2条件下饥饿培养24小时；再用10%胎牛血清刺激细胞增殖，在血清刺激的24、 48、 72小时对细胞进行计数；取血清刺激18小时的部分细胞进行流式细胞术分析 和BrdU掺入实验，以检测细胞的增殖情况。
BrdU掺入实验的方法为将血管平滑肌细胞培养于含lOOraM BrdU的正常细胞 培养基中18小时，然后用4%多聚甲醛固定细胞，用特异针对BrdU的一抗和罗丹明 标记的二抗进行常规免疫荧光染色，在荧光显微镜下照相。
针对BrdU的一抗购自Santa Cruz Biotechnology, Inc，产品目录号为 SC-56256，罗丹明标记的二抗购自北京中杉金桥公司，产品目录号为ZDR-5210。细胞计数实验结果如图2所示，结果表明，AdKLF4能显著抑制血清刺激的血 管平滑肌细胞的增殖。
流式细胞分析结果如图3和4所示，BrdU掺入分析结果如图5和6所示，实 验组和对照组的结果表明，KLF4通过抑制血管平滑肌细胞中DNA的复制使细胞停 滞在G0/G1期，从而抑制了细胞的增殖。
实施例3、 KLF4抑制大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜的增生
1、 大鼠颈动脉球囊损伤处理
400克雄性Sprague-Dawley大鼠，腹腔注射0. 6%戊巴比妥钠进行麻醉(注射剂 量为25mg/kg)。将1.5mm球囊(Medtronic, Minneapolis, MN)从左侧颈外动脉 插入颈总动脉，并向胸主动脉方向前进4cm,球囊充气后(0.5大气压)旋转拉回 至颈总动脉分叉处，该过程重复3次，保证血管内皮充分去除。同时以没有球囊拉 伤的大鼠(以control表示)作为对照。
在球囊损伤的3天后提取血管的总RNA， RT-PCR检测损伤血管KLF4 mRNA水平 变化，RT-PCR所用的引物为上游引物:5， -ctgaacagcagggactgtca-3，，下游引物 5' -gtgtgggtggctgttctttt-3，；结果如图7所示，表明，球囊损伤3天后KLF4 mRNA 水平显著下降，提示KLF4可能参与损伤后血管内膜增生过程。
2、 向损伤后动脉中注入重组腺病毒
在大鼠颈总动脉球囊损伤后，暂时夹闭颈总动脉近心端及颈内动脉，将K)9pfu 的AdKLF4和l(fpfu的AdtTA (辅助病毒)混匀后从颈外动脉切口注入颈总动脉，对 照组感染10、fu的AdLacZ和l()9pfu的AdtTA (辅助病毒)，孵育15分钟后吸出病 毒液，接扎血管切口及恢复颈总动脉血流。LacZ基编码beta-半乳糖甘酶，是大肠 杆菌乳糖操纵子中的一个基因，同时可以用x-Gal(5-溴-4-氯-3-B引哚-beta-半乳糖 苷)为底物进行染色来检测转染效率，是在体外转染中常用的对照。
在球囊损伤的7天后提取颈总动脉，利用特异针对KLF4抗体(Santa Cruz， sc-12538)进行免疫组化染色，结果如图8所示，表明AdKLF4能显著上调血管中KLF4 蛋白表达；在球囊损伤的21天后提取颈总动脉进行11』染色观察损伤后新生内膜增 生情况，结果如图9所示；对血管内膜及中膜面积进行定量，结果如图10和11所示， 表明AdKLF4能显著抑制球囊损伤后血管新生内膜的面积及内膜中膜面积比，这些 结果表明AdKLF4能显著抑制球囊损伤后血管新生内膜的形成。<formula>formula see original document page 11</formula>
权利要求
1、krüppel样转录因子4蛋白的编码基因在制备用于治疗血管内膜增生的药物中的应用。
2、 含有krlippel样转录因子4蛋白的编码基因的重组载体在制备用于治疗血 管内膜增生的药物中的应用。
3、 含有krlippel样转录因子4蛋白的编码基因的重组腺病毒在制备用于治疗 血管内膜增生的药物中的应用。
4、 根据权利要求l、 2或3所述的应用，其特征在于所述krtlppel样转录 因子4蛋白为如下a)或b)所示的蛋白a) 氨基酸序列如GenBank Accession Number NP_034767所示的蛋白；b) 将GenBank Accession Number NP—034767的氨基酸序列经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有krijppel样转录因子4功能的由(a) 衍生的蛋白质。
5、 根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于所述编码基因如1)或 2)所示1) 核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA;2) 与1)限定的DNA具有90%以上同源性且编码所述krii卯el样转录因子4的DNA。
6、 一种以kruppel样转录因子4蛋白或其编码基因为靶点的用于治疗血管内 膜增生的药物，其活性成分为使kruppel样转录因子4过表达的microRNA或siRNA、 含有kruppel样转录因子4蛋白的编码基因的重组载体、或含有kr卯pel样转录因 子4蛋白的编码基因的重组腺病毒。
7、 根据权利要求6所述的药物，其特征在于所述kriippel样转录因子4蛋 白为如下a)或b)所示的蛋白a) 氨基酸序列如GenBank Accession Number NP—034767所示的蛋白；b) 将GenBank Accession Number NP—034767的氮基酸序列经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有kruppel样转录因子4功能的由(a) 衍生的蛋白质。
8、 根据权利要求6或7所述的药物，其特征在于所述编码基因如l)或2)所示1) 核苷酸序列为序列表中序列1所示的DNA;2) 与1)限定的DNA具有90%以上同源性且编码所述krtippel样转录因子4的DNA。
全文摘要
本发明公开了krüppel样转录因子KLF4的新用途。该用途为krüppel样转录因子4蛋白的编码基因在制备用于治疗血管内膜增生的药物中的应用。本发明公开的一种以krüppel样转录因子4蛋白或其编码基因为靶点的用于治疗血管内膜增生的药物，其活性成分为使krüppel样转录因子4过表达的microRNA或siRNA、或含有krüppel样转录因子4蛋白的编码基因的重组载体。实验证明，本发明的应用方法或药物可以有效的抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而抑制血管内膜的增生，抑制效果非常明显，因此，本发明方法及药物在治疗血管内膜增生领域具有广阔的应用前景。
文档编号A61P9/00GK101502659SQ20091007871
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月2日 优先权日2009年3月2日
发明者汪南平, 颖 王 申请人:北京大学