橡胶树转录因子HbMYB44基因及其应用
【专利摘要】本发明涉及橡胶树转录因子HbMYB44基因及其应用。本发明提供的与橡胶树抗旱相关的转录因子基因HbMYB44，通过对HbMYB44基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，验证了转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受能力得到提高。该基因可用于橡胶树和其他作物的抗旱转基因研究中。本发明与橡胶树抗旱相关的转录因子基因HbMYB44来自橡胶树，不会产生基因漂移，对环境影响较小，为提高植物抗旱性提供新的基因资源。
【专利说明】
橡胶树转录因子HbMYB44基因及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，涉及橡胶树转录因子HbMYB44基因及其 应用。
【背景技术】
[0002] 橡胶树是生长在热带地区的多年生高大乔木，是生产天然橡胶的最主要植物，其 蒸腾耗水巨大，同时割胶也使其水分流失，土壤水分是其水分吸收的主要来源，然而近些年 来我国植胶区的广西、海南、云南以及广东多次出现旱情，对橡胶树的生长和生产带来了严 重的影响和损失。因此深入开展橡胶树抗旱性研究，开发繁育抗旱品系，对合理配置我国植 胶区品系，以及对水资源利用和改善生态环境有着重要的意义。
[0003] 植物抗旱相关的典型特征为蒸腾速率低和通过渗透调节保持水分。渗透调节主要 依赖于低分子量的有机渗透物的积累，如脯氨酸、甘露醇、山梨醇、果糖和寡糖等。而大量渗 透调节物质在细胞内的积累则有利于维持渗透平衡、保护膜质和生物大分子免受伤害。此 外，干旱的信号调节机制与脱落酸(ABA)，钙依赖蛋白激酶(CDPKs)和磷脂信号路径有关。在 一些植物中，过表达或者敲除干旱相关路径的关键基因，会提高植物抗旱性。例如，过表达 脱水(干旱)应答元件结合蛋白（DREB)转录因子基因会促进拟南芥和百脉根的抗旱能力，过 表达大豆泛素结合酶基因 GmUBC2可以通过诱导拟南芥中下游响应基因表达提高抗旱能力。 活性氧降解酶类主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、抗坏血酸过氧化物酶 (APX)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDAR)，过氧化氢酶(CAT)等，由于干旱诱导叶绿体和线粒体 中的活性氧(ROS)产生，活性氧清除酶类在植物抗旱响应中亦具有重要作用。MYB转录因子 结构上都有一段保守的DNA结合结构域(Myb-DNA-Mnding)，由3个保守的结构域组成，即 DNA结合结构域、转录激活结构域和一个不完全界定的负调节区。DNA结合结构域最为保守， 一般包含1-3个串联的、不完全重复的MYB结构域（1R-、2R-和3R-MYB)，每个重复片段由51-52个保守的氨基酸残基和间隔序列组成，每隔约18个氨基酸规则间隔1个色氨酸残基。这些 氨基酸残基使MYB结构域折叠成螺旋-转角-螺旋(Helix-Turn-Helix，HTH)结构。R2R3-MYB 类转录因子通过结合靶标基因启动子序列MBSI(T/C)AAC(T/G)G和MBSIIG(G/T)T(A/T)G(G/ T)T元件调控植物逆境响应等重要生理生化过程。已在拟南芥、玉米、棉花基因组中发现超 过200个MYB基因家族成员。MYB参与了植物次生代谢、激素和环境因子应答，并对细胞分化、 细胞周期以及叶片等器官的形态建成具有重要的调节作用。例如，ABA信号受体PYL8与 ΜΥΒ77、ΜΥΒ44和ΜΥΒ73结合，有助于ΜΥΒ77与生长素基因启动区的MBSI顺式元件结合，调控下 游基因的表达。在可见光下，光信号调控MYB与bHLH和WD40结合调控花青素合成基因表达。 在植物免疫过程中，HvWRKYI和HvMYB6结合抑制下游基因表达，而MLA蛋白可以通过竞争性 结合HvMYB6启动下游基因表达。在拟南芥乙烯信号路径中，MYB44调控乙烯信号途径关键受 体EIN2的表达，从而调控植物对蚜虫和蛾子的抗性反应。除了参与激素信号外，MYB44的功 能与其蛋白的磷酸化和泛素化等修饰过程紧密相关。MYB44还与MPK3结合导致MYB44的磷酸 化进而调控植物对逆境的响应过程。可见，MYB44转录因子通过与PYL9、WRKY70等蛋白结合 调控多样性植物生理过程。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供橡胶树转录因子HbMYB44基因及其编码蛋白。
[0005] 本发明的另一目的是提供橡胶树转录因子HbMYB44基因在提高植物抗旱能力中的 应用。
[0006] 为了实现本发明目的，本发明从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡 胶树转录因子HbMYB44基因，HbMYB44基因的cDNA序列为：
[0007] i)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列；或
[0008] ii)SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且 表达相同功能蛋白质的核昔酸序列;或
[0009] iii)在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸 序列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下杂交，并用该溶液洗膜;或
[0010] iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的 核苷酸序列。
[0011] 测序结果表明，橡胶树转录因子HbMYB44为MYB家族转录因子，HbMYB44基因开放阅 读框全长为1195bp，编码由345个氨基酸组成的蛋白（SEQ ID勵:2)。通过对池1^844基因的 生物信息学分析和受干旱等胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与橡胶树等植物抗逆途 径。
[0012]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的表达盒。
[0013]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的载体。
[0014]携带有所述目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中（Weissbach，1998 ,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和 Corey,1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0015]本发明还提供含有所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的工程菌、转基因细胞系。 [0016]本发明还提供所述橡胶树转录因子HbMYB44基因在提高植物（例如，拟南芥、橡胶 树等)抗旱能力中的应用。
[0017] 本发明还提供所述橡胶树转录因子HbMYB44基因在制备转基因植物中的应用。
[0018] 本发明还提供一种转基因植株的构建方法，包括以下步骤：
[0019 ](1)提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链；
[0020] (2)以cDNA第一链为模板，HbMYB44-F和HbMYB44-R为引物，所用引物序列为： HbMYB44-F：5/-GCCAAGCTTCCATTTTATGATTACT-3/；HbMYB44-R：5 /-CTCTGTACAATGCCCAAAATTATTC-3';通过PCR扩增反应获得转录因子HbMYB44基因的cDNA序 列，并将其cDNA片段连接至pMD18-T载体中并转化大肠杆菌DH5a菌株中进行克隆和测序验 证，测序验证正确的质粒命名为HbMYB44-l 8T;
[0021] (3)以HbMYB44-18T质粒为模板，HbMYB44-0E-F: 5' -CCCAAGCTTATGGCTGTTACT-3, (下划线为汜11(111頂每切位点）和!*]\^844-(^-1?:5 / -CGGGATCCCTCAATCTTACT-37 (下划线为 BamHI酶切位点）为引物，扩增HbMYB44基因的ORF，扩增产物经HindII I和BamHI双酶切后连 接至经相同酶切后的表达载体，利用电击法将带有HbMYB44基因 ORF的质粒转化农杆菌 GV3101 菌株；
[0022] (4)利用转基因技术将带有HbMYB44基因的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定 遗传植株。
[0023]其中，步骤（3 )中使用的表达载体为改造的pGreen Π 载体（购自Biovector 11^.1^六，商品编号：8丨〇代(^(^0800〇]〇，即在原载体骨架的3?61和乂匕&1位点之间插入 mGFP-6XHis片段。
[0024]本发明进一步提供橡胶树转录因子HbMYB44基因的荧光定量PCR检测引物，引物序 列如下：
[0025] HbMYB44-QF：57-GGGTTCACTGCAGAGTTTAT-3 7
[0026] HbMYB44-QR：57-ACTGCCTGAAAACACATACC-3 7
[0027]分别检测橡胶树叶片、胶乳、树皮和花四种组织，经过干旱、机械伤害、乙烯、茉莉 酸、水杨酸和过氧化氢处理后橡胶树叶片HbMYB44基因的表达情况，结果表明，HbMYB44基因 受干旱、机械伤害、乙烯和过氧化氢处理诱导表达。
[0028]本发明通过对HbMYB44基因转化拟南芥进行该基因的功能研究，验证了转基因拟 南芥对干旱胁迫的耐受能力得到提高。该基因可用于橡胶树和其他作物的抗旱转基因研究 中。本发明与橡胶树抗旱相关的转录因子基因 HbMYB44来自橡胶树，不会产生基因漂移，对 环境影响较小，为提高植物抗旱性提供新的基因资源。
【附图说明】
[0029]图1为本发明实施例1中HbMYB44与拟南芥AtMYB44家族转录因子保守区的氨基酸 序列同源性比对结果。
[0030] 图2为本发明实施例2中利用荧光定量PCR检测橡胶树受干旱、机械伤害、乙烯利、 脱落酸和过氧化氢处理后，HbMYB44基因的表达情况。
[0031] 图3为本发明实施例3中野生型(Col)和HbMYB44转基因拟南芥株系的表型比较。
【具体实施方式】
[0032]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。 [0033] 实施例1橡胶树转录因子HbMYB44基因的克隆
[0034]利用RT-PCR技术从巴西橡胶树品种热研7-33-97叶片中克隆获得橡胶树转录因子 HbMYB44基因，具体方法如下：
[0035] 1、提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。
[0036] 2、以cDNA第一链为模板，HbMYB44-F和HbMYB44-R为引物，通过PCR扩增反应获得转 录因子HbMYB44基因的cDNA序列。
[0037]引物序列如下：
[0038] HbMYB44-F：57-GCCAAGCTTCCATTTTATGATTACT-37
[0039] HbMYB44-R：57-CTCTGTACAATGCCCAAAATTATTC-37
[0040] 使用2 X Taq PCR MasterMix(天根生化)进行PCR扩增，反应体系为：cDNA模板2yL， 引物F、R( 10μπιο1/υ各IyL，2 X PCR MasterMix2^L，加 CldH2O至5〇yL。
[0041 ] PCR 扩增程序为：94°C 变性 3min; 94°C 变性 30s，55 °C 退火 50s，72 °C 延伸 2min，共 35 个循环;最后72 °C延伸IOmin。
[0042] 3、扩增产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，凝胶回收纯化，并克隆到 PMD18-T载体上，经菌落PCR检测，送上海立菲生物技术有限公司进行测序验证，测序验证正 确的质粒命名为HbMYB44-18T。测序结果表明，橡胶树转录因子HbMYB44属于MYB家族转录因 子，HbMYB44基因 cDNA序列（SEQ ID N0:1)为 1195bp;其ORF(开放阅读框）为 1038bp(SEQ ID NO:3)，编码由345个氨基酸组成的蛋白HbMYB44(SEQ ID NO:2)。
[0043] HbMYB44与拟南芥AtMYB44家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对结果见 图1。
[0044] 实施例2HbMYB44基因受干旱等胁迫时的表达分析
[0045] 采用荧光定量PCR方法检测橡胶树叶片、胶乳、树皮和花四种组织，经过干旱、机械 伤害、乙烯利、脱落酸和过氧化氢处理后橡胶树叶片HbMYB44基因的表达情况。
[0046]干旱处理:先将热研7-33-97芽接苗浇水至饱和，然后放在光照培养箱进行断水处 理，连续采集O-IOd叶片为材料。
[0047] 机械伤害处理:采用镊子夹伤热研7-33-97叶片，在0、0.5、1、2、6和12h采取叶片样 品，以未处理的植株作为对照。
[0048]化学药剂处理：以巴西橡胶树无性系CATAS7-33-97芽接苗为材料，分别喷施200μΜ 脱落酸(ΑΒΑ)、1.0%乙烯利(ET)和2%过氧化氢，分别在0、0.5、2、6、10、24、48和7211采取叶 片样品，所有药剂用〇.05%乙醇进行溶解，对照植株喷施0.05%乙醇水溶液。
[0049] 根据HbMYB44基因序列设计如下荧光定量PCR检测引物：
[0050] HbMYB44-QF：57-GGGTTCACTGCAGAGTTTAT-37 [0051 ] HbMYB44-QR：57-ACTGCCTGAAAACACATACC-37
[0052] HbACTIN-F：57-GATGTGGATATCAGGAAGGA-37
[0053] HbACTIN-R：57-CATACTGCTTGGAGCAAGA-37
[0054] 以HbACTIN(GenBank登录号：H0004792)为内参基因。使用BioRad公司的CFX-96荧 光定量PCR仪进行荧光定量PCR，反应程序为:95 °C预变性30s; 94 °C 5s，60 °C 20s，72 °C 20s，进 行45个循环。扩增结束后绘制熔解曲线，从50°C逐渐升温至95°C，升温速度0.2°C/s，全过程 检测荧光信号。HbMYB44基因的表达量采用公式Qt = 2-Ct(HbACTIN)-Ct(HbMYB44)计算，Ct 表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
[0055] 荧光定量PCR检测结果表明，橡胶树受干旱、机械伤害、乙烯利、脱落酸和过氧化氢 处理后，HbMYB44基因诱导表达（图2)。
[0056] 实施例3转HbMYB44基因拟南芥植株的获得及抗旱鉴定
[0057] 以实施例1制备的HbMYB44-18T质粒为模板，HbMYBAA-OEU'-CCCAAGCTTATGGCTGTTACT-3 7 (下划线为Hindi 11酶切位点）和HbMYB44-〇E_R : 5'-CGGGATCCCTCAATCTTACT-37 (下划线为BamHI酶切位点）为引物，扩增HbMYB44基因的ORF，扩 增产物经HindIII和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的表达载体(改造的pGreenn载 体，即在原载体骨架的SpeI和XbaI位点之间插入mGFP-6 X His片段），构建好的重组质粒命 名为HbMYB44-0E-GFP，利用电击法将重组质粒HbMYB44-0E-GFP转化农杆菌GV3101菌株;通 过农杆菌介导法将HbMYB44基因转化到野生型拟南芥植株(Co 1)中进行过表达，对转基因阳 性植物进行鉴定，对含目标基因的T3代阳性植株进行筛选及抗逆分析，结果表明过表达 HbMYB44基因的转基因拟南芥对干旱胁迫的耐受能力明显提高，为HbMYB44基因在其他植物 上的应用提供良好的基础。与野生型(Col)拟南芥植株相比，HbMYB44转基因株系的根系发 达，土壤中的耐旱性明显提高(表1和图3)。
[0058] 表1野生型和转HbMYB44基因拟南芥植株的表型比较
L0000」虽然，上文中已经用一股性说明及具体实施方案对本发明作/详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 橡胶树转录因子HbMYB44基因，其特征在于，HbMYB44基因的cDNA序列为： i) SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达 相同功能蛋白质的核昔酸序列;或 iii) 在严格条件下与SEQ ID NO: 1所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序 列，所述严格条件为在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 杂交，并用该溶液洗膜;或 iv) 与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷 酸序列。2. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序 列如SEQ ID NO:2所示。3. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的表达盒。4. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的载体。5. 含有权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的工程菌。6. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因在提高植物抗旱能力中的应用。7. 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物包括拟南芥、橡胶树。8. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因在制备转基因植物中的应用。9. 一种转基因植株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取橡胶树叶片中的总RNA，反转录得到cDNA第一链； (2) 以cDNA第一链为模板，HbMYB44-F和HbMYB44-R为引物，通过PCR扩增反应获得转录 因子HbMYB44基因的cDNA序列； (3) 利用电击法将带有HbMYB44基因 cDNA序列的质粒转化农杆菌； (4) 利用转基因技术将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物，获得转基因稳定遗传植 株； 其中，步骤⑵所述引物F和R的序列如下： HbMYB44-F: 5~GCCAAGCTTCCATTTTATGATTACT-3r HbMYBiiU7 -CTCTGTACAATGCCCAAAATTATTC-37。10. 权利要求1所述橡胶树转录因子HbMYB44基因的荧光定量PCR检测引物，其特征在 于，引物序列如下： HbMYB44-QF：57-GGGTTCACTGCAGAGTTTAT-37 HbMYB44-QR：5/-ACTGCCTGAAAACACATACC-37 〇
【文档编号】C12N15/11GK105861519SQ201610338942
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月20日
【发明人】王立丰, 王纪坤, 安锋, 谢贵水
【申请人】中国热带农业科学院橡胶研究所