花生MYB类转录因子AhMYB32及其应用

花生MYB类转录因子AhMYB32及其应用
【专利摘要】本发明公开了花生R2R3?MYB类转录因子AhMYB32及其应用，属于基因工程领域。该基因的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码氨基酸序列为SEQ ID NO.2。本发明的AhMYB32基因是花生中首次报道，荧光定量表达分析显示该基因受干旱、高盐诱导表达，通过转拟南芥进行功能验证，结果显示过表达的转基因植株与野生型相比表现出耐旱、耐盐性增强。因此，AhMYB32可作为目的基因导入植物，提高植物的耐旱、耐盐性。
【专利说明】
花生MYB类转录因子AhMYB32及其应用
技术领域
[0001] 本发明公开了花生MYB类转录因子AhMYB32及其应用，属于生物基因工程领域。
【背景技术】
[0002] MYB类转录因子作为植物中最大的转录因子家族之一，在植物胁迫应答过程中起 着重要的调控作用。Paz-Ares等（1987)首次从玉米谷粒糊粉中克隆了 COLOREDl(Cl)基因， 编码一个具有MYB结构域的蛋白，参与花青素合成。拟南芥基因组测序成功后，第一次全面 地对植物MYB基因家族进行描述和分类。根据所含MYB结构域的数目不同，大体分为四类，只 含一个MYB结构域，R1亚类;含两个MYB结构域为R2R3亚类;R1R2R3亚类成员含三个MYB结构 域;最后一个亚类为非典型MYB，该亚族含有4或5个MYB结构域，植物中数量稀少，一般只有 1-2个（Du et al.，2009)。目前玉米（Hai et al.，2012)、甘薯（Mona et al.，2007)、棉花 (房栋等，2008)、大豆(李晓薇等，2011)等作物均有MYB类转录因子的报道。花生中该类转录 因子鲜有报道，山东花生所陈娜等（2013)通过分析花生36741条ESTs序列，获得了30个MYB 基因序列，命名为AhMYBl~30,但它们的具体功能还未见报道。
[0003] MYB类转录因子参与众多生物学过程，如：初生和次生代谢反应、细胞形态与模式 建成、植物生长发育、对生物和非生物胁迫的应答等。在胁迫响应方面，根据基因表达及功 能研究发现，参与植物干旱、盐胁迫调控的MYB蛋白以R2R3类型居多。Hoeren等（1998)从拟 南芥中分离出了可与MYB识别位点特异结合的MYB相关蛋白基因 AtMYB2,受干旱及ΑΒΑ诱导 表达，并能与干旱应答基因 AtADHl特异结合。拟南芥AtMYB60(Cominelli et al.，2005)和 FLP/AtMYB88(Xie et al. ,2010)、马铃薯StMYBlR-l(Shin et al. ,2011)、葡萄VvMYB60 (Galbiati et al.，2011)等都通过调节气孔及逆境相关基因的表达，来提高作物抗旱性。 拟南芥中AtMYB44/AtMYBRl、AtMYB41、AtMYB15和AtMYB20在mRNA水平上均对盐胁迫有响应， 在拟南芥中超表达均能提高转基因植株对盐胁迫的抗性（Jung etal.，2008;Lippold etal.，2009;Ding etal.，2009;Cui et al.，2013)。小麦中的TaMYB32、TaMYB33、TaMYB56-B 和TaMYB73均受盐胁迫诱导表达，超表达这些基因的转基因拟南芥植株耐盐能力均有所增 强（Zhang et al.，2011and2012;He etal.，2012;Qin et al· ,2012)。此外，水稻的0sMYB2 (Yang etal. ,2012)、苹果的Md-SMYBl(Wang et al· ,2014)、甘蔗的PScMYBASl(Prabu et al.，2012)及毛竹的PeMYB2(肖冬长等，2013)，在植物中超表达均能够提高转基因植株的耐 盐能力。另外，一些MYB蛋白可能对植物盐胁迫抗性有负调控作用。如拟南芥的AtMyb73 (Kim et al.，2013)，atmyb73缺失突变体植株在盐胁迫下的存活率高于野生型植株。以上研究皆 表明MYB类转录因子在植物非生物胁迫的调控过程中起作用。

【发明内容】

[0004] 技术问题
[0005] 本发明的目的在于提供一种花生MYB转录因子基因 AhMYB32及其应用。
[0006] 技术方案
[0007] 本发明提供了一种花生MYB转录因子基因 AhMYB32,所述基因 cDNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述的花生MYB转录因子AhMYB32基因编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO.2 所述的氨基酸序列。
[0009] 本发明所述AhMYB32基因的应用。具体指AhMYB32基因不具有转录自激活活性，将 其通过植物表达载体转入目的植物内，能提高植物的耐旱、耐盐性。所述植物优选是模式植 物拟南芥。
[0010] 有益效果
[0011 ] 本发明公开了花生R2R3-MYB类转录因子基因 AhMYB32及其所编码的蛋白质，该基 因在花生中为首次报道。荧光定量表达分析表明该基因受干旱及高盐胁迫诱导;转拟南芥 功能验证显示该基因的过量表达提高了拟南芥植株对干旱及高盐胁迫的抗性。因此有望作 为目的基因导入植物，提高植物耐盐、耐旱性，从而进行植物品种改良。
【附图说明】
[0012] 图1:PCR扩增后的凝胶电泳结果
[0013] 图中M: DL2000marker; 32: AhMYB32
[0014] 图2 :qPCR分析AhMYB32基因在高盐和干旱下的表达情况 [0015]图3: AhMYB32基因的转录自激活活性验证
[0016] 图中 A为阳性对照:pGBKT7+pGADT7 ;B 为阴性对照:pGBKT7 ;C为pGBKT7-AhMYB32。
[0017] 图4:MS培养基法幼苗期耐盐性鉴定结果
[0018] 图A:耐盐性鉴定的对照培养基；图B:耐盐性鉴定的盐处理培养基。
[0019]图5: 土培法耐盐、耐旱性鉴定结果
[0020]图A:对照正常浇清水处理；图B:盐胁迫处理后；图C:干旱胁迫处理后恢复浇水。
【具体实施方式】
[0021] 实施例l:AhMYB32基因的获得
[0022] 选用花生较抗旱品种:丰花1号(公知公用，市场购买），光照培养箱中萌发生长，待 生长至3叶期幼苗，进行干旱（20%PEG6000)及高盐（l%NaCl)处理，处理24h后分别取部分 叶片等量混合放入研钵中，在液氮下快速研磨成粉状，利用RNA提取试剂盒（E.Z.N.A.? Plant RNAKit，购自OMEGA公司）提取样品的总RNA，并用DNAsel进行消化处理。利用1%琼脂 糖凝胶电泳检测总RNA的完整性，NanoDrop-2000型分光光度计检测总RNA的浓度和纯度。再 通过反转录试剂盒将总RNA反转合成cDNA。
[0023] 根据花生抗旱耐盐相关转录组测序结果，挑选了具有完整0RF、差异表达的MYB序 列，根据其预测序列的5'和3'端的非编码区分别设计了特异性引物P1、P2(表1)，以上述的 cDNA为模板，以94 °C预变性5min; 94 °C变性30 s，58-60 °C退火30 s，72 °C延伸60s，32个循环； 72°C延伸lOmin为反应条件进行PCR扩增。扩增片段经1%琼脂糖凝胶电泳检测（图1)，回收 后连接到质粒载体pGEM-Τ，然后转化大肠杆菌菌株JM109感受态细胞，经选择性LB培养基 (IPTG、X-gal、Amp)得到阳性克隆，菌液培养后测序分析。测得序列与预测序列一致，命名为 AhMYB32，AhMYB32的cDNA序列如SEQIDN0.1所示，编码的蛋白序列如SEQIDN0.2所示；结 构域分析显示其具有2个Μ Y B - D N A结构域（R 2、R 3 );系统进化树分析表明与拟南芥的 AtMYB44、70、73、77 亲缘关系近。
[0024] 实施例2:AhMYB32基因的表达分析
[0025] 选用花生品种：丰花1号，光照培养箱中萌发生长，待生长至3叶期幼苗，分别进行 干旱（20 %PEG6000)及高盐（1 %NaCl)处理，分别取Oh、4h、8h、12h的叶片样品，液氮冷冻 后，-80°C冰箱保存。再利用RNA提取试剂盒(E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit，购自OMEGA公司） 分别提取样品的总RNA，并反转成cDNA。
[0026] 基于AhMYB32序列设计定量引物P3、P4(表1)，以花生18S RNA基因引物为内参对 照，根据Real Master Mix(SYBR Green)试剂盒(TaKaRa)操作说明配制反应体系，每个反应 3次重复;反应程序为:94°C变性5min; 94°C变性20s，55°C退火30s，72°C延伸40s，40个循环； 于ABI PRISM 7000实时定量PCR仪上检测表达量。采用2-ΛΛα算法(Livak KJ，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-Δ ACt method.Methods, 2001,25:402-408)分析试验结果，其中 Δ ACT = (CT样本-CTiss)Time x-(CT稱-CTiss)Time 0，其中CT样本和CTiss分别是AhMYB31 和内参基因 18S 的CT值;Time x和Time 0分别为处理的不同时间点（胁迫处理4、8、12h)和对照（胁迫处理 Oh)。结果如图2所示，AhMYB32表现出对干旱、高盐胁迫有响应，其中干旱胁迫响应更为显 著。随着胁迫处理时间的延长，干旱及高盐胁迫下的表达量都不断增加，在胁迫处理12h后 分别上调了近5倍、2倍。
[0027] 实施例3: AhMYB32基因的转录自激活活性分析
[0028] 根据AhMYB32序列设计分别带EcoRl、BamHl酶切位点的引物P5、P6 (表1)，PCR扩增 获得目的片段，同时利用EcoRl和BamHl对载体pGBKT7质粒进行双酶切，再经过同源重组酶 (购自上海捷瑞生物工程有限公司）反应后转化大肠杆菌Transl-Tl感受态细胞(购自北京 全式金生物技术有限公司），阳性克隆进行测序分析，以确保表达载体中编码区阅读框架正 确，从而获得了 pGBKT7-AhMYB32诱饵载体。再将该诱饵载体质粒转化酵母Y2H感受态(购自 上海迈其生物科技有限公司），转化菌液按1、10、1〇 2、1〇3梯度稀释，再分别取l〇〇yL的菌液涂 布转化菌液分别涂布在SD/-Trp及SD/-Trp-His-Ade培养基上，同时设阳性对照：pGBKT7+ PGADT7，阴性对照:pGBKT7，30°C倒置培养，3~5d后观察酵母菌落的生长状况和颜色反应。 [0029] 从结果（图3)来看，AhMYB32转化菌在SD/-Trp培养基中正常生长，而在SD/-Trp- His-Ade筛选培养基上未长出酵母菌落，说明AhMYB32转录因子不具有转录自激活活性，可 以用酵母双杂交系统进行其互作蛋白的筛选。
[0030]实施例4:转化拟南芥及转基因功能验证
[0031] 植物表达载体采用载体pSuperl300,根据AhMYB32序列分别设计带HindIII、SpeI 酶切位点的引物P7、P8(表1)，重组载体构建方法参考实施例3中pGBKT7-AhMYB32诱饵载体 的构建。将获得的重组表达载体质粒转入农杆菌EHA105感受态，经选择性LB培养基(50mg/L Rif、100mg/L Kan)得到阳性克隆，菌液培养后通过浸花法侵染拟南芥植株(Colombia)。收 获的To代种子分别经潮霉素及基因引物进行阳性鉴定。获得的阳性株系继续种植，单株收 获。
[0032]耐盐性鉴定：（1)MS培养基法:先分别将T2代转基因种子及野生型种子进行春化处 理3-4天，再用次氯酸钠进行消毒后，点播于含不同浓度NaCl (0mM/L、100mM/L)的MS固体培 养基上，于光照培养箱中生长，观察表型差异。整个生长过程中，MS平板垂直放置。（2)土培 法:将T2代转基因种子及野生型种子进行春化处理3-4天，再用次氯酸钠进行消毒后，分别 将MS培养基上培养7d的转基因及野生型幼苗移植到装有定量营养土的营养钵中，每钵移植 4株，光照培养箱中缓苗10d，进行胁迫处理，每组每个株系3钵，重复3次。盐胁迫处理组用 300mmol/LNaCl水溶液浇灌营养土，对照同期浇清水，温室中继续培养至第15天，观察幼苗 生长情况。
[0033]耐旱性鉴定:将!^代转基因种子及野生型种子进行春化处理3-4天，再用次氯酸钠 进行消毒后，分别将MS培养基上培养7d的转基因及野生型幼苗移植到装有定量营养土的营 养钵中，每钵移植4株，光照培养箱中缓苗10d，停止浇水3-4周，有胁迫反应后恢复浇水5天， 期间记录幼苗生长情况。
[0034] 结果如图4所示，幼苗期耐盐鉴定显示，在不添加 NaCl的对照平板上(A)，野生型和 转基因植株无明显差异；而在添加了 100mM/LNaCl处理的平板上(B)，转基因拟南芥植株的 根长明显长于野生型植株。
[0035] 从图5可见，与清水对照（图A)相比，盐处理及干旱处理后，野生型及转基因植株生 长都受到了明显的抑制，其中野生型较转基因植株抑制程度更重（图B、C)。表明转AhMYB32 基因能提尚植株的耐盐、耐旱性。
[0036]综上所述本发明人提供的AhMYB32基因是首次在花生中分离的新基因，为花生中 首次报道，其功能与花生耐盐、耐旱相关，可作为目的基因导入植物，提高植物耐盐、耐旱 性，以进行植物品种改良。可利用本发明AhMYB32基因作为目的基因构建植物表达载体，其 中可用任何一种启动子例如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、Ubiquitin启动子或其它启 动子，该表达载体中必要时可包括增强子，不论是转录增强子或翻译增强子。为了简化转化 细胞的鉴定可使用选择性标记包括对抗生素抗性的酶，也可利用颜色变化(例如B-葡糖醛 酸糖苷酶GUS)或发光(例如荧光素酶)来识别的化合物的酶类，也可用无标记选择。所用的 表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪 法、花粉管通道法或其它方法转化植物。
[0037] 本发明涉及的序列及记号分列如下：
[0038] SEQ ID N0.1(762bp)
[0041] SEQ ID N0.2(253aa)[0043]表1:说明书中涉及的引物相关信息

【主权项】
1. 花生R2R3-MYB类转录因子AhMYB32，该基因的cDNA序列如SEQIDN0.1所示。2. 根据权利要求1所述的花生R2R3-MYB类转录因子AhMYB32,该基因 AhMYB32所编码氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3. 权利要求1或2所述花生R2R3-MYB类转录因子AhMYB32的应用。4. 根据权利要求3所述的应用，是指花生R2R3-MYB类转录因子AhMYB32的是指在植物耐 旱或耐盐方面的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，是指花生R2R3-MYB类转录因子AhMYB32的是指在拟南芥 耐旱或耐盐方面的应用。
【文档编号】C12N15/29GK105949296SQ201610567403
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月18日
【发明人】刘永惠, 陈志德, 沈, 沈一, 沈悦
【申请人】江苏省农业科学院