芳香环类药物在抑制恶性黑色素瘤关键转录因子方面的应用的制作方法

本发明涉及药物化学领域，更具体地涉及芳香环类药物及其在抑制恶性黑色素瘤关键转录因子mitf方面的应用。

背景技术：

恶性黑色素瘤是起源于黑色素细胞的肿瘤，是最难以治疗的恶性肿瘤之一。研究表明，mitf是恶性黑色素瘤中最为重要的直系致癌基因(“thelineagesurvivaloncogeneofmelanoma”)。有家族遗传史的黑色素瘤患者常携带突变mitfe318k，阻碍sumo介导的mitf降解，激活mitf下游基因表达，导致该突变体携带者罹患黑色素瘤的可能性较常人高出五倍。mitf过量表达会对mapk信号通路中的抑制剂(包括vrt11e，azd6224，plk4720等黑色素瘤治疗研发药物)产生耐药性，促进肿瘤复发。抑制mitf可以有效抑制黑色素瘤对其它靶向药物的耐药性，增强治疗效率，而其本身对身体的其他细胞没有影响。抑制mitf的蛋白表达可以在细胞水平和小鼠模型中显著抑制肿瘤的生长。因此，特异靶向mitf的小分子具有抑制恶性黑色素瘤生长，降低抗药性发生的药物潜力，能否通过小分子化合物特异有效的靶向mitf一直是该领域的热点问题。

mitf是含有保守bhlhlz结构域的转录因子，而特异靶向转录因子的小分子探针研究一直是非常具有挑战性的热点研究领域。由于转录因子的作用发挥依赖于蛋白相互作用界面(ppi，protein-proteininterface)，一般ppi界面在左右，特异靶向ppi界面需要较长，疏水的和刚性的小分子化合物来完成，对化合物的可溶性，跨膜能力和稳定性造成很大的挑战。同时，大部分转录因子缺少可以用于药物设计的底物结合口袋，无法通过底物类似物的方法筛选小分子探针。由于靶向机理不明确，高通量筛选模型的设计也是筛选靶向转录因子抑制化合物的难点。目前，仍没有机理明确的直接靶向mitf的小分子化合物的研究报道。

因此，本领域迫切需要一种能够直接靶向mitf且有效抑制恶性黑色素瘤生长、降低抗药性的小分子化合物。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能够直接靶向mitf的小分子化合物，用于治疗与mitf相关的疾病，调节mitf参与的生理活动。

本发明的第一方面提供了一种式a所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐的用途，所述式a所示的化合物用于(a)抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)；(b)治疗与mitf相关的疾病；和(c)调节mitf参与的生理活动；

式中，

ar为苯基，吡啶基，嘧啶基、或不含或含有氮、硫、氧杂原子的芳香环；

x1和x2各自独立地表示选自下组的基团：o原子，s原子，取代或未取代的n原子，c原子；其中所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、呋喃、含有o或s的杂原子的取代或未取代的5-7元杂环，所述取代的杂环含有1-3个选自下组的取代基：取代或未取代的苯基、c1-c3烷基、c1-c3卤代烷基、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、卤素、苄基；

r1和r2各自独立地表示选自下组的基团：卤素、取代或未取代的c1-c8烷基、取代或未取代的c1-c8烷氧基、取代或未取代的c2-c8烯烃基，取代或未取代的c2-c8炔烃基，取代或未取代的c3-c8环烷基；其中所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、呋喃、含有o或s的杂原子的取代或未取代的5-7元杂环，所述取代的杂环含有1-3个选自下组的取代基：取代或未取代的苯基、c1-c3烷基、c1-c3卤代烷基、-oh、-nh2、-cn、-nh(c1-c3烷基)、-n(c1-c3烷基)2、卤素、苄基。

在另一优选例中，所述的式a化合物具有如下结构式：

式中，

ar为吡啶基或苯环；

x1和x2各自独立地表示选自下组的基团：n原子、o原子、s原子；

r1和r2各自独立地表示选自下组的基团：

在另一优选例中，所述的式a化合物具有如下结构式：

在另一优选例中，所述的与mitf相关的疾病选自下组：恶性黑色素瘤、胰腺癌，皮肤过敏、哮喘。

在另一优选例中，所述mitf参与的生理活动包括皮肤美白。

本发明的第二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有(a)活性成分，所述活性成分包括如下式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐：

式中，ar、r1、x2、x1和x2如本发明第一方面中所定义；

以及(b)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物或制剂还可含有其他药物活性成分或药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述药物组合物中含有0.001-99wt％，较佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％的式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，按组合物的总重量计。

本发明的第三方面提供了一种如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，所述的药物组合物用于(a)抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)；(b)治疗与mitf相关的疾病；和(c)调节mitf参与的生理活动。

本发明的第四方面提供了一种药盒，所述的药盒包括：

(1)第一容器，以及位于所述容器内的第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有第一化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体；

(2)第n容器，以及位于所述容器内的第n药物组合物，所述的第n药物组合物含有第n化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体；其中，n为2-8中任一正整数；

其中，第一化合物和第n化合物选自如下所示化合物：

式中，ar、r1、x2、x1和x2如本发明第一方面中所定义；

以及(3)任选的使用说明书。

本发明的第五方面提供了一种体外非治疗性的抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子mitf的方法，所述方法将mitf与式a化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐进行接触，从而抑制mitf的活性，其中所述的式a化合物如本发明第一方面中所定义。

本发明的第六方面提供了一种治疗恶性黑色素瘤的方法，包括步骤：给需要的对象施用如式a所示的化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，或如本发明第二方面所述的药物组合物，其中所述的式a化合物如本发明第一方面中所定义。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.化合物tt-012高效抑制恶性黑色素瘤关键调控因子mitf的二体形成。

图2.化合物tt-012特异抑制mitf的转录活性。

图3.化合物tt-012高效特异抑制mitf依赖的恶性黑色素瘤细胞b16f10的生长。

图4.化合物tt-012显著抑制forskolin诱导的黑色素生成。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次发现了一类结构如式a所示芳香类化合物可以以ic50＝10nm的能力高效抑制mitf活性二体形成,显著地直接抑制mitf的二体形成的活性。实验表明，所述的式a化合物对mitf有较好的抑制效果。本发明的式a化合物可用于治疗与mitf靶点相关的恶性黑色素瘤，胰腺癌，皮肤过敏，哮喘等疾病治疗及皮肤美白。在此基础上，完成了本发明。

术语

术语“c1～c8烷基”指具有1-8个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、1-丁基、2-丁基、戊基、己基、庚基、辛基、或类似基团。

术语“c3～c8环烷基”指具有3～8个碳原子的环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环庚基、或类似基团。

术语“c1-c3卤代烷基”指具有1～3个碳原子的直链或支链并被1～3个卤素取代烷基。

术语“c1～c8烷氧基”指具有1～8个碳原子的直链或支链烷基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、或类似基团。

术语“c2～c8烯烃基”指具有2-8个碳原子的直链或支链的烯基，例如乙烯基、丙烯基、异丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、或类似基团。

术语“c2～c8炔烃基”指具有2-8个碳原子的直链或支链的炔基，例如乙炔基、丙炔基、异丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、或类似基团。

术语“5-7元杂环”指具有一个或多个，优选1-3个杂原子的环状结构，所述的环可以是饱和或不饱和的环。

术语“卤素”指f、cl、br和i。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

本发明中，术语“药学上可接受的”成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)，即有合理的效益/风险比的物质。

恶性黑色素瘤

恶性黑色素瘤是起源于黑色素细胞的肿瘤，是最难以治疗的恶性肿瘤之一。研究表明，mitf是恶性黑色素瘤中最为重要的直系致癌基因(“thelineagesurvivaloncogeneofmelanoma”)，同时也是目前治疗恶性黑色素瘤最具突破性的靶点之一。20％的恶性皮肤癌患者会存在mitf基因扩增现象，过量表达mitf会诱导黑色素细胞转化为肿瘤，并促进肿瘤的增殖和分化。

黑色素瘤关键转录调控因子

黑色素瘤关键转录调控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)是皮肤表皮黑色素细胞的主要调控因子，它的功能是调节黑色素合成酶的转录，促进黑色素的生成，传递给周围的皮肤角质细胞，防止由紫外线辐射造成的细胞损伤，同时形成皮肤表面颜色。mitf功能缺失型突变是人类遗传性白化病疾病waardenburgsyndrometypeiia，tietzsyndrome的主要原因，也是人在衰老过程毛发中变成灰白色的主要原因。

式a化合物

如本文所用，“本发明化合物”、或“式a化合物”可互换使用，指式a所示的化合物、或其消旋体、对应异构体、或其药学上可接受的盐。应理解，该术语还包括上述组分的混合物。

式中，各基团的定义如上所述。

在本发明中，还包括式a化合物的药学上可接受的盐。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。药学上可接受的盐包括无机盐和有机盐。一类优选的盐是本发明化合物与酸形成的盐。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

本发明的式a化合物可采用现有技术中本领域技术人员熟知的方法进行制备，对各个步骤的反应参数没有特别限制。此外，本发明的典型化合物也可通过市售方式获得。

除非特别说明，本发明中，所有出现的化合物均意在包括所有可能的光学异构体，如单一手性的化合物，或各种不同手性化合物的混合物(即外消旋体)。本发明的所有化合物之中，各手性碳原子可以任选地为r构型或s构型，或r构型和s构型的混合物。

用途

本发明的上述式a化合物可用于抑制mitf，进而预防或治疗与mitf相关的疾病。

本发明还提供了一种抑制mitf的方法，以及治疗与mitf相关的疾病的方法。

在本发明中，与mitf相关的疾病的例子包括(但并不限于)：恶性黑色素瘤，胰腺癌，皮肤过敏，哮喘，皮肤美白等。

在一实施例中，本发明提供了一种体外非治疗性的抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子mitf的方法，包括：例如在体外培养体系中，将恶性黑色素瘤关键转录调控因子与式a化合物(或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐)进行接触，从而抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子mitf的活性。

本发明还提供了一种抑制恶性黑色素瘤关键转录调控因子mitf的方法，该方法可以是治疗性的或非治疗性的。通常，该方法包括步骤：给需要的对象施用本发明的式a化合物。优选地，所述对象包括人和非人哺乳动物(啮齿动物、兔、猴、家畜、狗、猫等)。

组合物和施用方法

由于本发明化合物具有优异的对恶性黑色素瘤关键转录调控因子(mitf，microphthalmia-associatedtranscriptionfactor)的抑制活性，因此本发明化合物、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐，以及含有以本发明化合物为主要活性成分的药物组合物可用于治疗、预防和缓解与mitf相关的疾病。本发明化合物可用于与mitf相关的疾病如恶性黑色素瘤，胰腺癌，皮肤过敏，哮喘，皮肤美白等的预防和治疗。

本发明的药物组合物包含安全有效量范围内的本发明化合物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且这种组合物中，活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明化合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，具体剂量应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的式a化合物对mitf具有显著的抑制效果，其抑制mitf二体的ic50值达到10nm。

(b)本发明的典型式a化合物以明确的作用机理靶向mitf。

(c)本发明的式a化合物对于与mitf靶点相关的多种疾病的治疗具有良好的开发应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

在具体实施例中，选择化合物tt-012以更好地说明本发明的内容，所述的化合物tt-012具有如下结构式，其为本发明式a所示化合物中的其中一种化合物：

实施例1

tt-012高效特异抑制mitf二体形成。

在alphascreen高通量筛选模型midas(mitfdependentalpha-screen)中，mitf被分别标记了被alphadonorbeads识别的biotin标签，和被alphareceptorbeads识别的his标签。当mitf形成二体时，alphadonorbeads和alphareceptorbeads被牵引靠近，通过680nm激发光和520-620nm发射光进行检测，便可以监测mitf的二体形成情况。利用midas技术，tt-012可以以ic50＝10nm的能力高效的抑制mitf二体形成(见图1)。图1显示，通过高通量筛选模型midas(mitfdependentalpha-screen)检测，tt-012可以以ic50＝10nm高效的抑制mitf二体形成(正方形标注)，而对对照试验,lysrs-p38相互作用的alphascreen信号没有影响(三角形标注)。

实施例2

tt-012特异抑制mitf的转录活性

将tt-012与黑色素瘤细胞b16f10细胞系孵育，通过mrna抽提，逆转录实验，荧光定量pcr检测mitf标志性下游基因-tyr(酪氨酸酶)和(trpm1瞬时受体电位阳离子通道m1)的转录情况。通过rt-pcr实验，tt-012可以以ic50＝2μm高效抑制mitf标志性下游基因-tyr和trpm1的mrna水平。图2显示活性tt-012可以显著抑制mitf下游基因转录影响。

实施例3

tt-012特异抑制恶性黑色素瘤的生长

将活性tt012与mitf依赖并高表达的黑色素瘤细胞系b16f10，mitf低表达的a375黑色素瘤细胞系，和对照细胞系hela孵育，通过mtt实验检测细胞活性，从图3中可以发现，通过mtt实验，tt-012以ic50＝300nm的高效能抑制mitf依赖的恶性黑色素瘤细胞b16f10的生长(正方形标注)，而对mitf低表达的恶性黑色素瘤细胞a375(圆形标注)以及对照细胞hela(三角形标注)没有杀伤能力。说明tt-012有特异抑制mitf活性并抑制mitf依赖的恶性黑色素瘤生长的性质。

实施例4

tt-012特异抑制黑色素的形成

mitf调控黑色素合成酶tyr，tyrp1的转录表达，是黑色素形成的主要调控因子。小分子化合物foskolin可以通过激活msh-camp-creb调节通路，促进mitf表达，进而促进黑色素的生成。从图4中可以看出，tt-012可以通过抑制mitf,高效抑制黑色素的形成，具有良好的皮肤美白潜力。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。